Name: 打印温敏反向模具图案创作的双组分水凝胶的三维细胞培养 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: 学习利用温敏反向模具技术打印双组分水凝胶，用于三维细胞培养和组织工程研究。该方法通过生物打印实现复杂水凝胶结构的精确控制，为细胞行为研究提供仿生微环境。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们感谢Deborah Studer在生物打印机使用方面提供的帮助。
本工作由欧洲联盟第七框架计划（FP7/2007-2013）资助，资助协议编号 n&deg;NMP4-SL-2009-229292

1. 泊洛沙姆407溶液的制备
如果条件允许，应在低温室（4 °C）中配制泊洛沙姆溶液。若无低温室，可将玻璃瓶置于盛有冰水的烧杯中。温度较高时，泊洛沙姆会超过凝胶点，无法充分溶解。
<ol>
	<li>将60 ml预冷的PBS溶液加入玻璃瓶中，使用磁力搅拌器剧烈搅拌。</li>
	<li>称取24.5克泊洛沙姆，分少量加入冷的PBS中。待泊洛沙姆部分溶解后，再加入下一批。</li>
	<li>搅拌溶液直至所有泊洛沙姆完全溶解。</li>
	<li>加入冷PBS，直至总体积达到100 ml。最终浓度为24.5%（w/v）。</li>
	<li>停止搅拌溶液，并在4 °C下静置，直至溶液中的气泡和泡沫完全消失。凝胶中残留的气泡会被转移至打印机墨盒中，导致打印的牺牲模具出现缺陷。</li>
	<li>使用0.22 μm滤器将溶液直接过滤至打印 cartridge 中，以去除可能堵塞针头的任何不需要的颗粒。过滤步骤应在低温室中进行（若无条件，可使用预冷的滤头进行过滤）。 等等。以避免泊洛沙姆在滤器中凝胶化。将装有溶液的 cartridge 置于 4 °C 保存，直至实验前 30 分钟取出。</li>
</ol>
2. 3D 打印机的准备
本研究中使用的3D打印机为regenHU公司的“BioFactory”。该系统的挤出部分由多个组件构成。顶部加压的料筒通过鲁尔锁紧接头与连接器相连。该连接器连接料筒出口与电磁阀入口之间的空间。在电磁阀的出口处，可使用不同直径的针头。材料被挤出并沉积到由真空固定于运动平台上的基底上。系统的主要部件如图1所示。其他基于挤出的系统也可用于打印过程，但每种系统均需进行相应的优化。
<ol>
	<li>将电磁阀（喷嘴直径 0.3 mm）和针头（内径 0.15 mm）分别放入盛有超纯水的 1.5 ml 离心管中，置于加热超声波清洗仪中清洗 30 分钟。用乙醇冲洗清洗后的阀门，并用氮气枪吹干。</li>
	<li>将阀门和针头安装到打印机中，并安装一个空的、洁净的墨盒。</li>
	<li>向系统施加 3 bar 压力，用压缩空气吹出已安装阀门和针头中的任何残留液体。对于较小的针头直径，建议在压缩空气出口处安装过滤器（常用注射器滤器，孔径 0.45 μm），以避免微小颗粒进入而堵塞针头。</li>
	<li>关闭压力，安装装有泊洛沙姆的墨盒。墨盒应在安装前约 30 分钟从冰箱中取出，使泊洛沙姆升至室温并形成凝胶。</li>
	<li>向系统施加 3 bar 压力，挤出泊洛沙姆，直至其到达针尖并以连续丝状物挤出。</li>
</ol>
3. 打印参数的优化
为了构建精确的三维结构，必须针对所选材料及其浓度优化打印工艺。根据材料的黏度和所使用的3D打印系统，在一组固定的参数条件下，每种材料会产生特定的分配体积和线条厚度。
<ol>
	<li>使用合适的 CAD 软件（能够从图纸生成 ISO 文件），绘制一条与您打算打印的结构长度相近的单线。</li>
	<li>将一块尺寸为 25 mm × 75 mm × 1 mm 的显微镜载玻片或任何其他基底放入打印机中，并通过开启真空泵将其固定。</li>
	<li>在打印机软件中，将电磁阀设置为 50 Hz 的高频率，并设定 3 bar 的高压力。</li>
	<li>以 300 mm/min 的平台移动速度打印单线的一层。</li>
	<li>逐步降低压力，直至达到所需的线宽。您也可以通过调节阀门开启时间来控制挤出的体积。</li>
	<li>逐步降低阀门频率，直到无法再打印出连续的线条为止。选择略高于该值的频率作为工作参数。</li>
</ol>
注意：当达到所需的线宽和连续线条后，确定最佳的平台移动速度和层厚 即 针头在完成一层打印后的抬升动作。
<ol start="7">
	<li>逐层叠加打印，观察经过多层打印后针头是否位于上一层材料的正上方。调整层厚（针头抬升高度），确保每一层均准确打印在下一层之上（图3）。</li>
	<li>逐步降低打印平台的速度（从300 mm/min开始），使挤出的材料层起始与终止位置与前一层保持一致（图4）。平台速度过高会导致平台在挤出材料接触前一层之前即开始移动。</li>
	<li>打印柱状结构时，请遵循步骤3.1–3.8，但将绘制单条直线改为绘制单个点。打印柱状结构时需重点关注的参数包括：压力（控制泊洛沙姆层厚及柱体直径）、阀门开启时间（控制挤出体积）以及打印头在柱体沉积位置的停留时间。</li>
	<li>当参数优化完成后，连续打印多层直线应形成致密的墙体结构，而连续打印点则应形成柱状结构。请保存已优化的参数以供后续使用。</li>
</ol>
4. 反向模具的打印与洗脱
从此时起，使用优化过程中确定的参数。
<ol>
	<li>在玻璃显微镜载玻片上打印内部结构（此处为柱状阵列），并过夜干燥。此步骤可：a) 减小结构的尺寸和厚度；b) 增强结构与基底之间的粘附性，从而避免在后续填充过程中发生结构剥离。</li>
	<li>使用 CAD 软件绘制一个包含外壁的结构，该外壁应包围住需要被洗脱并填充的结构。使用泊洛沙姆（poloxamer）打印该外壁结构，打印过程需时 6 分钟。</li>
</ol>
注意：由于针头尺寸限制，壁面必须距离内部结构至少 3.5 mm 处进行打印，否则外壁的打印过程会破坏内部结构
<ol start="3">
	<li>准备用于填充牺牲模具的溶液（此处为去离子水中含1%琼脂糖）。琼脂糖溶液的温度应保持在35 °C至45 °C之间。温度低于此范围会导致琼脂糖过快凝固；高于此范围则可能因泊洛沙姆结构软化而破坏已打印的支柱结构。</li>
	<li>使用移液器缓慢将填充溶液注入牺牲模具中。操作应缓慢进行，以避免破坏模具内壁的结构。</li>
	<li>根据所用聚合物的性质，使填充后的溶液发生凝胶化或交联。以琼脂糖为例，其在4 °C下静置10分钟即可完成凝固。</li>
	<li>将填充后的牺牲模具置于冰浴中10分钟，以溶出泊洛沙姆结构。</li>
	<li>用纸巾轻轻吸干填充后的结构，并将其放置于新的玻璃载玻片上。小心地将结构压紧在载玻片表面，防止第三种水凝胶从空腔泄漏至结构与载玻片之间的间隙中。</li>
</ol>
5. 填充空隙
<ol>
	<li>为了填充由洗脱的泊洛沙姆留下的孔隙，将预定的聚合物溶液注入配备30 G针头的注射器中。在本示例中，我们使用了含有0.05% w/v苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂（LAP）和2.5% v/v Alexa-488标记的纤维蛋白原的1%海藻酸甲基丙烯酸酯溶于0.15 M NaCl的溶液。添加Alexa-488标记的纤维蛋白原用于可视化观察。</li>
	<li>使用高强度紫外灯（100瓦，365 nm，与基底距离为3.5 cm）对聚合物进行5分钟的光聚合，并利用落射荧光或共聚焦显微镜对构建物进行成像。</li>
</ol>

<ol><li>Fedorovich, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+photocrosslinked+Lutrol+hydrogel+for+tissue+printing+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Evaluation of photocrosslinked Lutrol hydrogel for tissue printing applications.</a> Biomacromolecules. 10, 1689-1696 (2009).</li>
<li>Lee, K. B., Park, S. J., Mirkin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+nanoarrays+generated+by+Dip-Pen+Nanolithography%5BTitle%5D)+AND+%22Abstr+Pap+Am+Chem+S%22%5BJournal%5D)">Protein nanoarrays generated by Dip-Pen Nanolithography.</a> Abstr Pap Am Chem S. 223, C94(2002).</li>
<li>Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+lithography+in+biology+and+biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+biomedical+engineering%22%5BJournal%5D)">Soft lithography in biology and biochemistry.</a> Annual review of biomedical engineering. 3, 335-373 (2001).</li>
<li>Mironov, V., Reis, N., Derby, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+bioprinting%3A+a+beginning%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering%22%5BJournal%5D)">Review: bioprinting: a beginning.</a> Tissue engineering. 12, 631-634 (2006).</li>
<li>Odde, D. J., Renn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-guided+direct+writing+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+bioengineering%22%5BJournal%5D)">Laser-guided direct writing of living cells.</a> Biotechnology and bioengineering. 67, 312-318 (2000).</li>
<li>Derby, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioprinting%3A+inkjet+printing+proteins+and+hybrid+cell-containing+materials+and+structures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mater+Chem%22%5BJournal%5D)">Bioprinting: inkjet printing proteins and hybrid cell-containing materials and structures.</a> J Mater Chem. 18, 5717-5721 (1039).</li>
<li>Therriault, D., White, S. R., Lewis, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chaotic+mixing+in+three-dimensional+microvascular+networks+fabricated+by+direct-write+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chaotic mixing in three-dimensional microvascular networks fabricated by direct-write assembly.</a> Nature. 2, 265-271 (2003).</li>
<li>Engelhardt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+2D+protein+microstructures+and+3D+polymer-protein+hybrid+microstructures+by+two-photon+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Fabrication of 2D protein microstructures and 3D polymer-protein hybrid microstructures by two-photon polymerization.</a> Biofabrication. 3, 025003(2011).</li>
<li>Mironov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Printing+technology+to+produce+living+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+opinion+on+biological+therapy%22%5BJournal%5D)">Printing technology to produce living tissue.</a> Expert opinion on biological therapy. 3, 701-704 (2003).</li>
<li>Mironov, V., Kasyanov, V., Drake, C., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+printing%3A+promises+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+medicine%22%5BJournal%5D)">Organ printing: promises and challenges.</a> Regenerative medicine. 3, 93-103 (2008).</li>
<li>Mironov, V., Kasyanov, V., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+printing%3A+from+bioprinter+to+organ+biofabrication+line%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Organ printing: from bioprinter to organ biofabrication line.</a> Current opinion in biotechnology. 22, 667-673 (2011).</li>
<li>Fedorovich, N. E., De Wijn, J. R., Verbout, A. J., Alblas, J., Dhert, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+fiber+deposition+of+cell-laden%2C+viable%2C+patterned+constructs+for+bone+tissue+printing%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional fiber deposition of cell-laden, viable, patterned constructs for bone tissue printing.</a> Tissue engineering. Part A. 14, 127-133 (2008).</li>
<li>Dhariwala, B., Hunt, E., Boland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+prototyping+of+tissue-engineering+constructs%2C+using+photopolymerizable+hydrogels+and+stereolithography%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering%22%5BJournal%5D)">Rapid prototyping of tissue-engineering constructs, using photopolymerizable hydrogels and stereolithography.</a> Tissue engineering. 10, 1316-1322 (2004).</li>
<li>Cook, C., Wang, T., Derby, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inkjet+Printing+of+Enzymes+for+Glucose+Biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Mater+Res+Soc+Symp+P%22%5BJournal%5D)">Inkjet Printing of Enzymes for Glucose Biosensors.</a> Mater Res Soc Symp P. 1191, 103-109 (2009).</li>
<li>Cui, X., Gao, G., Qiu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+myotube+formation+using+bioprinting+technology+for+biosensor+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Lett%22%5BJournal%5D)">Accelerated myotube formation using bioprinting technology for biosensor applications.</a> Biotechnol Lett. , 1-7 (2012).</li>
<li>Fabrication of a Glucose Biosensor by Piezoelectric Inkjet Printing. Wang, T. M., Cook, C., Derby, B. 2009 3rd International Conference on Sensor Technologies and Applications (Sensorcomm 2009), , 82-85 (2009).</li>
<li>Shim, J. H., Lee, J. S., Kim, J. Y., Cho, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioprinting+of+a+mechanically+enhanced+three-dimensional+dual+cell-laden+construct+for+osteochondral+tissue+engineering+using+a+multi-head+tissue%2Forgan+building+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Micromech.+Microeng%22%5BJournal%5D)">Bioprinting of a mechanically enhanced three-dimensional dual cell-laden construct for osteochondral tissue engineering using a multi-head tissue/organ building system.</a> J. Micromech. Microeng. 22, (2012).</li>
<li>Malmsten, M., Lindman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-Assembly+in+Aqueous+Block+Copolymer+Solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Self-Assembly in Aqueous Block Copolymer Solutions.</a> Macromolecules. 25, 5440-5445 (1021).</li>
<li>Cebotari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+application+of+tissue+engineered+human+heart+valves+using+autologous+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Clinical application of tissue engineered human heart valves using autologous progenitor cells.</a> Circulation. 114, I132-I137 (2006).</li>
<li>Matsumura, G., Hibino, N., Ikada, Y., Kurosawa, H., Shin'oka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+application+of+tissue+engineered+vascular+autografts%3A+clinical+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Successful application of tissue engineered vascular autografts: clinical experience.</a> Biomaterials. 24, 2303-2308 (2003).</li>
<li>Kropp, B. P., Zwischenberger, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+autologous+bladders%3A+new+possibilities+for+cystoplasty%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+clinical+practice.+Urology%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered autologous bladders: new possibilities for cystoplasty.</a> Nature clinical practice. Urology. 3, 588-589 (2006).</li>
<li>Oberpenning, F., Meng, J., Yoo, J. J., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+reconstitution+of+a+functional+mammalian+urinary+bladder+by+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">De novo reconstitution of a functional mammalian urinary bladder by tissue engineering.</a> Nature. 17, 149-155 (1999).</li>
<li>Wood, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering+of+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Clinics+in+plastic+surgery%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering of skin.</a> Clinics in plastic surgery. 39, 21-32 (2012).</li>
<li>Groeber, F., Holeiter, M., Hampel, M., Hinderer, S., Schenke-Layland, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+tissue+engineering--in+vivo+and+in+vitro+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Clinics+in+plastic+surgery%22%5BJournal%5D)">Skin tissue engineering--in vivo and in vitro applications.</a> Clinics in plastic surgery. 39, 33-58 (2012).</li>
<li>Bannasch, H., Momeni, A., Knam, F., Stark, G. B., Fohn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering+of+skin+substitutes%5BTitle%5D)+AND+%22Panminerva+medica%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering of skin substitutes.</a> Panminerva medica. 47, 53-60 (2005).</li>
<li>Jakab, K., Neagu, A., Mironov, V., Forgacs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+printing%3A+fiction+or+science%5BTitle%5D)+AND+%22Biorheology%22%5BJournal%5D)">Organ printing: fiction or science.</a> Biorheology. 41, 371-375 (2004).</li>
<li>Boland, T., Mironov, V., Gutowska, A., Roth, E. A., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+and+organ+printing+2%3A+fusion+of+cell+aggregates+in+three-dimensional+gels%5BTitle%5D)+AND+%22The+anatomical+record.+Part+A%2C+Discoveries+in+molecular%2C+cellular%2C+and+evolutionary+biology%22%5BJournal%5D)">Cell and organ printing 2: fusion of cell aggregates in three-dimensional gels.</a> The anatomical record. Part A, Discoveries in molecular, cellular, and evolutionary biology. 272, 497-502 (2003).</li>
<li>Mironov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+printing%3A+tissue+spheroids+as+building+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Organ printing: tissue spheroids as building blocks.</a> Biomaterials. 30, 2164-2174 (2009).</li>
<li>Raimondi, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+polymerization%3A+from+fundamentals+to+biomedical+application+in+tissue+engineering+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+applied+biomaterials%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser polymerization: from fundamentals to biomedical application in tissue engineering and regenerative medicine.</a> Journal of applied biomaterials. 10, 56-66 (2012).</li>
<li>Miller, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+casting+of+patterned+vascular+networks+for+perfusable+engineered+three-dimensional+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues.</a> Nature. 11, 768-774 (2012).</li>
<li>Billiet, T., Vandenhaute, M., Schelfhout, J., Van Vlierberghe, S., Dubruel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+trends+and+limitations+in+hydrogel-rapid+prototyping+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A review of trends and limitations in hydrogel-rapid prototyping for tissue engineering.</a> Biomaterials. 33, 6020-6041 (2012).</li>
<li>Murphy, S. V., Skardal, A., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+hydrogels+for+bio-printing+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomedical+materials+research.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Evaluation of hydrogels for bio-printing applications.</a> Journal of biomedical materials research. Part A. 101, 272-284 (2013).</li>
<li>He, J., Li, D., Liu, Y., Gong, H., Lu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indirect+fabrication+of+microstructured+chitosan-gelatin+scaffolds+using+rapid+prototyping%5BTitle%5D)+AND+%22Virtual+and+Physical+Prototyping%22%5BJournal%5D)">Indirect fabrication of microstructured chitosan-gelatin scaffolds using rapid prototyping.</a> Virtual and Physical Prototyping. 3, 159-166 (2008).</li>
<li>Sachlos, E., Reis, N., Ainsley, C., Derby, B., Czernuszka, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+collagen+scaffolds+with+predefined+internal+morphology+made+by+solid+freeform+fabrication%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Novel collagen scaffolds with predefined internal morphology made by solid freeform fabrication.</a> Biomaterials. 24, 1487-1497 (2003).</li>
<li>Lee, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-demand+three-dimensional+freeform+fabrication+of+multi-layered+hydrogel+scaffold+with+fluidic+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+bioengineering%22%5BJournal%5D)">On-demand three-dimensional freeform fabrication of multi-layered hydrogel scaffold with fluidic channels.</a> Biotechnology and bioengineering. 105, 1178-1186 (2010).</li>
<li>Turturro, M., Christenson, M., Larson, J., Papavasiliou, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinase+%28MMP%29+sensitive+PEG+diacrylate+%28PEGDA%29+hydrogels+with+spatial+variations+in+matrix+properties+direct+vascular+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Tissue%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinase (MMP) sensitive PEG diacrylate (PEGDA) hydrogels with spatial variations in matrix properties direct vascular cell invasion.</a> J. Tissue. 6, 302-302 (2012).</li>
<li>Butterworth, A., Garcia, M. D. L., Beebe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photopolymerized+poly%28ethylene%29+glycol+diacrylate+%28PEGDA%29+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Roy.+Soc.+Ch%22%5BJournal%5D)">Photopolymerized poly(ethylene) glycol diacrylate (PEGDA) microfluidic devices.</a> Roy. Soc. Ch. , 4-6 (2005).</li>
<li>Shachar, M., Tsur-Gang, O., Dvir, T., Leor, J., Cohen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+immobilized+RGD+peptide+in+alginate+scaffolds+on+cardiac+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+biomaterialia%22%5BJournal%5D)">The effect of immobilized RGD peptide in alginate scaffolds on cardiac tissue engineering.</a> Acta biomaterialia. 7, 152-162 (2011).</li>
<li>Jeon, O., Bouhadir, K. H., Mansour, J. M., Alsberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photocrosslinked+alginate+hydrogels+with+tunable+biodegradation+rates+and+mechanical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Photocrosslinked alginate hydrogels with tunable biodegradation rates and mechanical properties.</a> Biomaterials. 30, 2724-2734 (2009).</li>
<li>Mauck, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+tissue+engineering+of+articular+cartilage+through+dynamic+loading+of+chondrocyte-seeded+agarose+gels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech.+Eng-T+Asme%22%5BJournal%5D)">Functional tissue engineering of articular cartilage through dynamic loading of chondrocyte-seeded agarose gels.</a> J. Biomech. Eng-T Asme. 122, 252-260 (2000).</li>
<li>D'Arrigo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronic+acid+methacrylate+derivatives+and+calcium+alginate+interpenetrated+hydrogel+networks+for+biomedical+applications%3A+physico-chemical+characterization+and+protein+release%5BTitle%5D)+AND+%22Colloid+Polym.+Sci%22%5BJournal%5D)">Hyaluronic acid methacrylate derivatives and calcium alginate interpenetrated hydrogel networks for biomedical applications: physico-chemical characterization and protein release.</a> Colloid Polym. Sci. 290, 1575-1582 (2012).</li>
<li>Pescosolido, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronic+Acid+and+Dextran-Based+Semi-IPN+Hydrogels+as+Biomaterials+for+Bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Hyaluronic Acid and Dextran-Based Semi-IPN Hydrogels as Biomaterials for Bioprinting.</a> Biomacromolecules. 12, 1831-1838 (2011).</li>
<li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+of+collagen%2Fchondroitin+sulfate%2Fhyaluronan+interpenetrating+polymer+network+for+cartilage+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mater.+Sci-Mater.+M%22%5BJournal%5D)">Hydrogels of collagen/chondroitin sulfate/hyaluronan interpenetrating polymer network for cartilage tissue engineering.</a> J. Mater. Sci-Mater. M. 23, 2267-2279 (2012).</li>
</ol>

作者声明无任何利益冲突。

本文首次提出使用一种热响应性聚合物作为牺牲模具，该聚合物由于泊洛沙姆在约 20 °C 时发生凝胶-溶胶转变，可在冷水中快速洗脱。整个过程的速度使得泊洛沙姆在快速构建无法以足够分辨率直接打印的生物聚合物结构方面具有吸引力。此处描述的技术可用于在一种水凝胶内对另一种水凝胶进行图案化，或用于构建微流体通道，此前已有其他材料实现类似应用35。泊洛沙姆作为牺牲模具的优势在于，它可被打印成任意几何形状，并逐层构建为固体结构，随后可进行填充并洗脱去除。
本文描述了使用泊洛沙姆（poloxamer）制备牺牲性模具，并随后用第二种水凝胶回填以制造结构化水凝胶的过程。在填充时，结构化水凝胶的材料选择需受到粘度和温度条件的限制。常用的低粘度前体溶液，如二丙烯酸聚乙二醇36,37、海藻酸钠38,39、琼脂糖40以及甲基丙烯酰化生物聚合物41-43，仅是适合填充材料的几个示例。然而，高粘度材料可能无法充分填充狭窄的几何结构，或在打印出的细小脆弱结构（如本文中的柱状结构）情况下破坏牺牲性模具。因此，...

近年来，组织工程在人体组织和器官再生方面已取得显著进展19,20。然而，迄今为止，组织工程的研究重点往往局限于结构简单或尺寸较小的组织，例如膀胱21,22或皮肤23-25。然而，人体内存在许多复杂的三维组织，其中细胞与细胞外基质以特定的空间方式排列。要制造这类组织，需要一种能够在三维结构中将细胞和细胞外基质支架精确放置于指定位置的技术。生物打印技术有望实现这一目标，使制造复杂三维组织的愿景成为可能10,11,26-28。
生物打印被定义为“利用材料转移工艺对具有生物学相关性的材料——包括分子、细胞、组织和可生物降解的生物材料——进行图案化和组装，使其具有特定的空间结构，以实现一种或多种生物学功能”4。该技术涵盖多种不同的方法，其分辨率和尺度各不相同，例如双光子聚合技术的分辨率可达亚微米级29，而挤出式打印的分辨率则在150 μm至420 μm之间1,12,30。没有任何一种单一材料或材料组合能够满足所有方法的需求31。对于挤出式打印而言，关键参数是黏度和凝胶化时间32，其中高黏度和快速凝胶化是理想特性。
3D打印是一种可简便制备牺牲性模具以构建复杂几何结构的技术30,33,34。该方法基于使用快速成型技术（如挤出式生物打印）构建模具。所制备的牺牲性模具可用于由难以直接打印的材料（因其黏度低、凝胶化速度慢）形成复杂结构。本文所述方法涉及制备一种由可在低温下快速溶解且可精确挤出的材料构成的牺牲性模具。嵌段共聚物聚乙二醇99-聚丙二醇67-聚乙二醇99（又称Pluronic F127或泊洛沙姆407）满足这些要求。该材料此前已在改性形式下用于挤出打印1，但据我们所知，因其在液态环境中不稳定，尚未见以其未改性形式用于打印的报道。泊洛沙姆407还表现出逆向热响应行为18 即在降温时由凝胶态转变为溶胶态。最重要的是，它能够被打印成具有极高保真度的任意复杂曲面结构。通过将溶液移液至打印所得的牺牲性模具中，该方法可实现由低黏度材料（本例中为凝胶化缓慢的琼脂糖）制备结构化水凝胶。牺牲性模具的高保真打印及其在成型结构水凝胶中的快速洗脱，使其成为一种快速且灵活的模具制备方法，无需使用光刻法中常见的掩模或印章。成型的结构化水凝胶还可进一步填充另一种因黏度过低而不适用于挤出打印的材料，本例中为低黏度海藻酸甲基丙烯酸酯溶液。本文以柱状阵列为例，介绍利用热响应逆向牺牲性模具进行水凝胶图案化的方法。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;强&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>泊洛沙默（Pluronic F127）</td><td>Sigma</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>&lt;u&gt;&lt;a href=&quot;http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catProductDetail&amp;&productID=10010015&quot; 目标=&quot;_blank&quot;&gt;10010-015&lt;/a&gt;&lt;/u&gt;</td><td></td></tr><tr><td>CAD 软件</td><td>regenHU</td><td>BioCAD</td><td></td></tr><tr><td>海藻酸甲基丙烯酸酯</td><td>Innovent e.V. 耶拿技术开发中心</td><td></td><td>由Innovent为FP7项目编号NMP4-SL-2009-229292合成</td></tr><tr><td>人血浆纤维蛋白原，Alexa Fluor 488 标记物</td><td>Invitrogen</td><td>F13191</td><td></td></tr><tr><td>苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂（LAP）</td><td>Innovent e.V. 技术开发耶拿</td><td></td><td>由Innovent为FP7项目编号NMP4-SL-2009-229292合成</td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;强&gt;仪器设备&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>生物打印机</td><td>regenHU</td><td>生物工厂</td><td></td></tr><tr><td>瓣膜</td><td>regenHU</td><td>300 &amp;#956;m 喷嘴直径</td><td></td></tr><tr><td>针</td><td>regenHU</td><td>150 &amp;#956;毫米内径</td><td></td></tr><tr><td>蔡司Axioobserver配ApoTome</td><td>蔡司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>紫外光源</td><td>UVP</td><td>Blak-Ray B-100AP 高强度紫外灯</td><td>100 W</td></tr></tbody></table>

打印热响应性反向模具以制备用于三维细胞培养的图案化双组分水凝胶

Printing Thermoresponsive Reverse Molds for the Creation of Patterned Two-component Hydrogels for 3D Cell Culture

生物打印是一种源自快速成型产业的新兴技术。不同的打印工艺可分为接触式生物打印1-4（挤出式、蘸笔式和软光刻）和非接触式生物打印5-7（激光正向转移、喷墨沉积），以及基于激光的技术，例如双光子光聚合8。该技术可用于多种应用，如组织工程9-13、生物传感器微加工14-16，以及作为回答基础生物学问题的工具，例如共培养不同类型细胞的影响17。与常见的光刻或软光刻方法不同，挤出式生物打印的优势在于无需额外的掩模或印章。通过使用CAD软件，结构设计可根据操作者的需求快速修改和调整，这使得生物打印比基于光刻的方法更加灵活。
在此，我们演示了通过打印牺牲模具来制造多材料三维结构的方法，并以水凝胶内含的一组柱状结构为例。这些柱状结构可代表用于血管网络的中空结构，或神经导管内的管道。牺牲模具选用泊洛沙姆407（poloxamer 407），这是一种具有优异打印性能的温敏性聚合物，其在4 °C时呈液态，而在24.5% w/v溶液条件下，高于约20 °C时发生凝胶化转变为固态18。该特性使得基于泊洛沙姆的牺牲模具可按需洗脱，相较于固体材料的缓慢溶解，尤其在狭窄结构中更具优势。将泊洛沙姆打印在显微镜玻片上以形成牺牲模具，随后将琼脂糖溶液移液至模具中并冷却至凝胶化。在冰水中洗脱泊洛沙姆后，琼脂糖模具中的空腔被含有FITC标记纤维蛋白原的海藻酸甲基丙烯酸酯（alginate methacrylate）填充。填充后的空腔经紫外光交联，最终通过落射荧光显微镜对结构进行成像。

代表性结果表明，反向模具技术（如图2所示）可制备出具有结构的凝胶，并可填充第二种材料。在每次打印过程开始前，需首先优化打印参数。逐步调整这些参数后，当打印单条线时，可获得如图3和图4所示的多层结构。如果层厚（每完成一层打印后针头的抬升高度）过低，则会观察到针头触碰到前一层。若针头过高，则打印结构表面会出现波浪状图案。这一点在图3A-3D中可见，所有测试的层厚对于给定的平台速度而言均过大。由于较高的平台速度会减小实际层厚，设定值与实际层厚之间的微小差异会逐渐累积，随着结构高度增加，波浪图案开始显现。通过降低层厚，这些差异减小，波浪图案出现在更高的位置（如图3C和图3D中的虚线所示）。在固定层厚的情况下，若平台速度过快，则会导致波浪图案，或使结构向顶部逐渐变窄，并在结构起始端出现凸起（打印结构的右边缘），如图4A-4C所示。针对泊洛沙姆优化的参数为：开启时间0.2毫秒、频率31.14 Hz、层厚0.15 m...

采用生物打印机基于可牺牲模具制备出具有特定图案的水凝胶。首先用第二种水凝胶填充泊洛沙姆模具，随后将其洗脱，形成可被第三种水凝胶填充的孔隙结构。该方法利用泊洛沙姆快速洗脱和良好可打印性的特点，实现由生物聚合物构建复杂结构。

生物打印是一种源自快速成型产业的新兴技术。不同的打印工艺可分为接触式……

本实验的总体目标是打印一个反向模具，用于制备适用于三维细胞培养的图案化双组分水凝胶。该目标通过首先打印一种热可逆聚合物的反向模具来实现，该聚合物在4°C时呈液态，而在室温下则形成软凝胶。此反向模具后续可被去除。第二步是用选定的生物聚合物填充反向模具。此处我们使用了 aros。该生物聚合物可通过酶交联、UV 交联或温度交联进行交联。接下来，通过将模具浸入冷水中来制备反向模具。完成此步骤后，所得到的 AROS 模具即可用于后续加工。最后一步是用第二种生物聚合物填充空腔，该生物聚合物可含有细胞，并可通过酶、紫外光或温度进行交联。最终，我们建立了一种可重复的方法，用于制备空间有序的D细胞培养支架。最初提出该方法的设想源于一位同事的建议，即可以利用Oxr的温敏特性，将其作为可牺牲的模具。本实验操作将由我实验室的研究生Misha Muah进行演示。首先，在玻璃瓶中加入 60 毫升预冷的 PBS 溶液，并使用磁力搅拌器剧烈搅拌。然后称取 24.5 克 Paul ER，分小份加入冰冷的 PBS 中。每次加入后需等待 Paul ER 在 PBS 中部分溶解，再继续添加下一份。继续搅拌溶液，直至所有 Paul Oxr 完全溶解。接着，加入额外的冰冻 PBS，直至总体积达到 100 毫升，使最终浓度为 24.5%（重量/体积）。然后搅拌混合物，直至充分混匀。停止搅拌溶液，并在4摄氏度下静置过夜，直至溶液中的气泡和泡沫完全消失。凝胶中残留的气泡会被转移至打印机墨盒中，导致打印出的牺牲模具出现缺陷。使用预冷的滤器将溶液直接过滤至打印墨盒中，以去除可能堵塞针头的任何不需要的颗粒。将 cartridge 在 4 摄氏度下保存，直到实验前 30 分钟取出。将电磁阀和打印针分别放入装有超纯水的 1.5 毫升离心管中，超声处理 30 分钟，以完成打印前的准备。随后用乙醇冲洗清洁后的电磁阀，并用氮气枪吹干。接下来，将清洁的电磁阀和针头安装到打印机中。同时，安装一个干净的空打印墨盒以测试系统。向系统施加3 bar的压力，并用压缩空气吹出已安装的阀和针头中的任何残留液体。适用于小直径针头。在压缩空气出口处安装过滤器，以防止微小颗粒进入而堵塞针头。然后关闭压力。当压力降至零后，安装预先装有聚氧化烯（poly oxr）的墨盒。墨盒应在安装前约30分钟从冰箱中取出，以便使仍处于液态的聚氧化烯达到室温并在打印前凝胶化。通过翻转墨盒检查聚氧化烯是否已形成凝胶。接下来，向系统施加 3 bar 的压力，并挤出 Paul Emer，直至其到达针尖并以连续丝状挤出。在生物 CAD 软件中，于打印机软件设置菜单中绘制一条与拟打印结构长度相近的直线。在参数部分将电磁阀频率设为 50 赫兹的高频，并手动调节高压设定至 3 bar。接下来，将一块玻璃显微镜载玻片放入打印机中，并通过开启真空泵将其固定到位。然后以每分钟300毫

printing-thermoresponsive-reverse-molds-for-creation-patterned-two

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

打印温敏反向模具图案创作的双组分水凝胶的三维细胞培养

在本方案中，我们演示了该技术所基于的垂直位移微柱阵列微致动器的制备方法，并介绍了如何对该基础技术进行改进，以在二维和三维培养模式下实现高通量的力学动态细胞培养。...

用于力学动态细胞培养的微加工平台

本文描述了利用数字微镜装置在常规细胞培养基底上进行动态掩模投影光刻，快速制备微加工神经培养系统的简单技术。这些培养系统可能更接近天然生物结构，且所述技术可针对多种应用进行调整。...

使用动态掩模投影光刻技术制备用于神经培养系统的微图案化水凝胶

我们介绍一种利用简单工艺制备可自由组装和操作的自支撑微图案化水凝胶片的方法。利用这些模块化水凝胶片，可构建具有可控细胞微环境的简单宏观尺度三维细胞培养系统。...

用于微图案化宏观尺度三维细胞结构的模块化水凝胶片构建

荧光共振能量转移（FRET）成像是一种用于实时细胞生物学研究的有力工具。本文介绍了一种利用常规落射荧光显微镜在生理性的三维（3D）水凝胶微环境中进行FRET成像细胞的方法。同时描述了一种针对比率型FRET探针的分析方法，该方法在激活范围内可产生线性比率结果。...

三维水凝胶中的FRET成像

我们描述了一种用于三维细胞培养的合成水凝胶基质的光介导形成及其后续生物化学图案化的连续过程。文中展示了利用细胞相容性光点击化学构建和修饰水凝胶的方法。此外，还介绍了对这些水凝胶中的图案进行定量与观察、以及测定细胞活力的简便技术。...

光介导的水凝胶形成与图案化及其在细胞培养中的应用

本方案描述了一种利用定制的3D打印塑料模具制备不同尺寸自组装组织环的平台。将PDMS倒入3D打印模具中固化形成阴模，然后将琼脂糖注入固化的PDMS阴模中成型。将细胞接种至所得的琼脂糖孔中，细胞在其中聚集形成组织环。...

使用3D打印模具制备定制琼脂糖孔用于细胞接种和组织环自组装

我们介绍一种在三维细胞外基质中控制初始细胞簇形状的方法，以获得可重复的模式形成。采用包含两种不同水凝胶的立方体装置，实现组织模式形成的多方向成像。...

用于可重复图案形成的混合凝胶立方体装置中初始三维细胞簇的控制

我们描述了一种用于细胞和多细胞类器官三维培养及实验的装置构建方法。该装置可实现对细胞在具有明确趋化因子梯度的三维微环境中对可溶性信号响应的分析。类器官在检测微弱且含噪声的输入信号方面优于单个细胞。...

趋化因子梯度下多细胞反应的三维分析

本文介绍了一种明胶甲基丙烯酰胺的3D生物打印方法。...

基于明胶甲基丙烯酰胺水凝胶生物墨水的3D生物打印方案

水凝胶形成过程中的剪切处理可产生微凝胶悬浮液，该悬浮液具有剪切变稀特性，但在去除剪切力后能迅速重构。此类材料已被用作生物打印复杂、含细胞结构的支撑基质。本文描述了用于制备支撑床及相容性生物墨水的方法。...

通过凝胶化过程中剪切处理形成琼脂糖流体凝胶用于悬浮3D生物打印

本文介绍了如何使用3D生物打印光可调水凝胶来研究细胞外基质硬化和成纤维细胞活化。...

3D生物打印光可调水凝胶以研究成纤维细胞活化

学习利用温敏反向模具技术打印双组分水凝胶，用于三维细胞培养和组织工程研究。该方法通过生物打印实现复杂水凝胶结构的精确控制，为细胞行为研究提供仿生微环境。

打印热响应性反向模具以制备用于三维细胞培养的图案化双组分水凝胶

探索更多视频