打印热响应性反向模具以制备用于三维细胞培养的图案化双组分水凝胶

本实验的总体目标是打印一个反向模具，用于制备适用于三维细胞培养的图案化双组分水凝胶。该过程首先使用一种热可逆聚合物打印反向模具，该聚合物在4°C时呈液态，而在室温下则形成软凝胶。此反向模具后续可被去除。

第二步是用选定的生物聚合物填充反向模具。此处我们使用了 aros。该生物聚合物可通过酶交联、紫外光交联或温度交联方式进行交联。

接下来，通过将模具浸入冷水中来制备反向模具。经过此步骤后，所得到的 AROS 模具即可用于后续加工。最后一步是用第二种可包含细胞的生物聚合物填充空腔，并可通过酶、紫外光或温度诱导交联。

最终，我们建立了一种可重复的方法，用于构建空间有序的 D 细胞培养支架。最初提出该方法的构想，源于一位同事建议我们可以利用 Oxr 的温敏特性，将其作为牺牲模具。本实验操作将由我实验室的研究生 Misha Muah 演示。

首先，将 60 毫升冰冻的 PBS 溶液加入玻璃瓶中，使用磁力搅拌器剧烈搅拌。然后称取 24.5 克 Paul ER，分小份加入冰冷的 PBS 中。每次添加后需等待 Paul ER 在 PBS 中部分溶解，再继续加入下一批量。

继续搅拌溶液，直至所有 Paul Oxr 完全溶解。接着，加入额外的冰冻 PBS，直至总体积达到 100 毫升，得到终浓度为 24.5%（重量/体积）。然后搅拌混合物，直至充分混匀。

停止搅拌溶液，并在4°C下静置过夜，直至溶液中的气泡和泡沫完全消失。凝胶中残留的气泡会被转移至打印墨盒中，导致打印出的牺牲模具出现缺陷。使用预冷的滤器将溶液直接无菌过滤至打印墨盒中，以去除可能堵塞针头的任何不需要的颗粒。

将 cartridge 置于 4°C 保存，直到实验前 30 分钟取出。将电磁阀和打印针分别放入装有超纯水的 1.5 毫升微量离心管中，震荡清洗 30 分钟，以准备打印。随后用乙醇冲洗清洁后的电磁阀，并用氮气枪吹干。

接下来，在打印机中安装清洁的电磁阀和针头。同时，安装一个空的清洁打印墨盒以测试系统。向系统施加3 bar的压力，并用压缩空气吹出已安装的阀和针头中的任何残留液体。

适用于小直径针头。在压缩空气出口处安装过滤器，以避免微小颗粒进入而堵塞针头。然后关闭压力。

当压力降至零后，安装预先装有聚氧化烯（poly oxr）的墨盒。墨盒应在安装前约30分钟从冰箱中取出，以便使仍处于液态的聚氧化烯达到室温并在打印前凝胶化。通过翻转墨盒检查聚氧化烯是否已形成凝胶。

接下来，向系统施加 3 bar 的压力，并挤出 Paul Emer，直至其到达针尖并以连续丝状挤出。在生物 CAD 软件中，于打印机软件设置菜单中绘制一条与您打算打印的结构长度相近的直线。在参数部分将电磁阀设置为 50 赫兹的高频率，并手动调节高压设置至 3 bar。

接下来，将载玻片放入打印机，并通过开启真空泵将其固定到位。然后以每分钟 300 毫米的平台速度打印单条单层线条。通过手动降低压力以及在软件中调整每条新线条的频率设置，获得所需的线条宽度，并确保线条连续不间断。

如果绘制的线条出现断裂，则已达到下限。当获得所需宽度的连续线条后，通过检查打印结构中的缺陷来确定最佳的打印速度和层厚。为了微调层厚，可能还需要略微调整压力和频率。

为了测试层厚设置，可打印多个相互叠加的层，并观察确保针头位于上一层上方的正确位置。调节层厚，使每一层直接打印在上一层之上。为优化平台移动速度，首先从每分钟300毫米开始逐步降低速度，使挤出的各层起始和结束位置与前一层保持一致。

如果平台移动过快，会在层的顶部出现波浪状图案。打印柱状结构时，应在 CAD 软件中绘制单个点而非线条。然后微调压力和频率以调节层厚度和柱体直径，并调节打印头的步长时间以最大化打印速度。

优化完成后，保存参数以供后续使用。首先，将内部结构（例如此类柱状阵列）打印到玻璃显微镜载玻片上，并使其干燥。过夜干燥可减小结构的尺寸和厚度，并增强结构与基底之间的粘附性。

第二天，绘制一个结构，该结构由一个外壁组成，外包围住你希望被洗脱并填充的内部结构。由于针头的尺寸限制，聚合物壁应至少距离内部结构 3.5 毫米。接着，将 1% aros 溶于去离子水中，通过微波加热使其完全溶解，制备成混合液。

将琼脂溶液冷却至 35 至 45 摄氏度之间。然后使用移液管将琼脂溶液缓慢注入牺牲模具中。操作应缓慢进行，以避免破坏模具壁内结构。

填充后，将模具置于 4 摄氏度环境中使凝胶固化。约 10 分钟后，从冰箱中取出凝胶并放入冰浴中 10 分钟，以洗脱聚合物结构。随后小心取出结构，并用纸巾轻轻吸去残留水分。

将结构小心地压到新的玻璃载玻片上，以形成良好的密封，防止第三层水凝胶泄漏。接着，配制 1% 的海藻酸甲基丙烯酸酯溶液于 0.15 摩尔/升氯化钠中。涡旋溶液以充分溶解海藻酸甲基丙烯酸酯。

然后加入体积比2.5%的Alexa 488标记的纤维蛋白原和质量体积比0.05%的二苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂，以获得一种可通过荧光轻松观察的第三种水凝胶。

将该溶液加入一个带有30号针头的0.3毫升注射器中。然后使用该注射器填充聚合物流失后留下的空隙。在将针头从每根柱子中抽出时，通过挤出聚合物确保每根柱子完全填满。

最后，使用高强度紫外灯对注入的聚合物照射五分钟，进行光聚合，然后使用落射荧光显微镜或共聚焦显微镜对构建物成像。图中显示的是一个类似于刚刚制备的构建物的三维Zack重建图像，其中用于填充的荧光标记海藻酸盐。支柱结构呈现为绿色柱状，而构建物的外部部分是透明的。

本视频展示的技术可广泛适用于多种不同的三维结构，例如此处所示的同心圆排列。分辨率取决于针头直径。本设计所使用的直径为150微米的针头，可产生直径在120至200微米之间的纤维。

观看本视频后，您应能充分理解打印 oxr 所涉及的各个步骤。我们已展示了如何将 oxr 用作牺牲模具来制备图案化水凝胶；但如果使用与制造相关的聚合物版本，则 oxr 也可通过紫外光稳定化处理。