Printing Thermoresponsive Reverse Molds for the Creation of Patterned Two-component Hydrogels for 3D Cell Culture

该程序的总体目标是打印反向模具，以创建用于 3D 细胞培养的图案化双组分水凝胶。这是通过首先用热可逆聚合物打印反向模具来实现的，热可逆聚合物在 4 摄氏度时是液体，但在室温下是软凝胶。这种反向模具以后可以避免。

第二步是用选择的生物聚合物填充反向模具。这里我们用了 aros。生物聚合物可以通过酶、UV 或温度交联进行交联。

接下来，通过将模具浸入冷水中来暗示反向模具。完成此步骤后，生成的 AROS 模具就可以进行进一步加工了。最后一步是用第二种生物聚合物填充空隙，该生物聚合物可能包含细胞，并且可以通过酶、紫外线或温度交联。

最终，我们建立了一种可重复的方法来创建空间组织到 D 细胞培养支架。我们第一次想到这种方法是在一位同事建议我们可以利用 Oxr 的热响应特性，将其用作牺牲模具时。演示该程序的是我实验室的研究生 Misha Muah。

首先，将 60 毫升冰冷的 PBS 溶液加入玻璃瓶中，并使用磁力搅拌剧烈搅拌。然后称取 24.5 克 Paul ER，少量加入冷 PBS 中。等到 Paul Oxr 部分溶解在 PBS 中后再添加更多。

继续搅拌溶液，直到所有 Paul Oxr 溶解。接下来，添加额外的冰冷 PBS，直到达到 100 毫升的最终体积，产生每体积重量 24.5% 的最终浓度。然后搅拌混合物，直到充分混合。

停止搅拌溶液，让它在 4 摄氏度下静置过夜，直到溶液中的气泡和泡沫消失。被困在凝胶内的气泡会转移到打印机墨盒中，并会导致打印的牺牲模具出现缺陷。无菌 使用预冷过滤器将溶液直接过滤到打印墨盒中，以去除任何可能堵塞针头的不需要的颗粒。

将小柱储存在 4 摄氏度下，直到实验前 30 分钟。将电磁阀和针头放入单独的 1.5 毫升微量离心管中，放入装有超纯水的单独离心管中，然后联合放置 30 分钟，以准备用于打印。然后用乙醇冲洗清洁过的阀门，并用氮气枪干燥。

接下来，在打印机中安装干净的电磁阀和针。此外，请安装一个空的 Clean Print Cartridge 来测试系统。对系统施加 3 bar 的压力，并用压缩空气吹出已安装的阀门和针头上的任何残留液体。

适用于小直径的针。在压缩空气出口处安装过滤器，以避免小颗粒进入，从而堵塞针头。然后关闭压力。

当压力降至零时，安装预装聚乙烯 oxr 的筒。应在安装墨盒前大约 30 分钟将墨盒从冰箱中取出，以便静止的液体聚乙烯氧树脂可以达到室温并在打印前凝胶化。通过翻转墨盒检查聚乙烯 oxr 是否被冻化。

接下来，对系统施加 3 巴的压力并分配 Paul Emer，直到它到达针尖并挤出成连续的股线。使用 bio CAD 软件，在打印机软件设置菜单中绘制一条与要打印的结构长度大致相同的线。在参数部分将电磁阀设置为 50 赫兹的高频，并手动将高压设置调整到 3 巴。

接下来，设置玻璃显微镜，滑入打印机并通过打开真空将其固定到位。然后以每分钟 300 毫米的载物台速度打印一层单行。通过手动减少压力和软件中每条新线路的频率设置来获得所需的线宽，确保线路保持连续。

如果绘制的线条被打断，则已达到下限。一旦获得具有所需宽度的连续线，通过检查打印结构中的缺陷来确定最佳载物台速度和层厚。为了微调层厚，压力和频率也可能需要稍微重新调整。

为了测试层厚设置，请打印多个图层，并观察以确保指针位于前一图层上方的正确位置。调整层厚，以便每个层都直接打印在前一层的顶部。为了优化载物台速度，首先将载物台速度从每分钟 300 毫米逐步降低，以便挤出层的起点和终点与前面的层相同。

如果舞台移动得太快，图层顶部会出现一个波浪状的图案。对于打印柱结构，请在 CAD 软件中绘制单个点而不是线条。然后微调压力和频率以调节层厚和柱直径以及打印头的步长，以最大限度地提高打印速度。

优化后，保存参数以备后用。首先，在玻璃显微镜载玻片上打印内部结构，例如这个柱状阵列，然后让它干燥。过夜干燥可减小结构的尺寸和厚度，并在结构和基材之间提供更好的附着力。

第二天，画一个结构，它由一堵外墙组成，围绕着你打算躲避和填充的结构。由于针的尺寸，聚合物壁应打印在距离内部结构至少 3.5 毫米的位置。接下来，在完全溶解后，在微波炉中加热，制备 1%aros 的去离子水混合物。

将农业溶液冷却至 35 至 45 摄氏度之间。然后使用移液管用农用溶液填充牺牲模具。这应该慢慢进行，以避免破坏墙内的结构。

填充后，将模具置于 4 摄氏度以固化凝胶。大约 10 分钟后，从冰箱中取出凝胶，将其放入冰浴中 10 分钟以洗脱聚合物结构。然后小心地去除结构，并用纸巾吸干去除残留的水。

小心地将结构压在新的玻璃显微镜载玻片上，以形成良好的密封，防止第三颗水凝胶泄漏。接下来，制备 1% 甲基丙烯酸海藻酸盐在 0.15 摩尔氯化钠中的溶液。涡旋溶液以溶解甲基丙烯酸海藻酸盐。

然后将 2.5%volume 添加到 volume。Alexa，4 88 偶联纤维蛋白原，每体积重量为 0.05%。苯基 2 4 6 三甲基苯甲酰磷酸锂获得第三种水凝胶，可通过荧光轻松观察。

将此溶液放入配备 30 号针头的 0.3 毫升注射器中。然后使用注射器填充逃脱的聚合物留下的空隙。确保在从每根色谱柱中抽出针头时，通过弹出聚合物来完全填充每根色谱柱。

最后，用高强度紫外灯对注入的聚合物进行光聚合 5 分钟，然后使用落射荧光或共聚焦显微镜对构建体进行成像。这里显示的是类似于刚刚制造的结构的 3D Zack 重建，用于回填的荧光标记海藻酸盐。柱状形状显示为绿色柱状，而构造的外部是透明的。

本视频中展示的技术广泛适用于许多不同的 3D 排列，例如此处显示的同心圆。分辨率取决于针直径。用于此设计的 150 微米直径针可以产生直径在 120 到 200 微米之间的股线。

看完这个视频，你应该对打印 oxr 所涉及的步骤有很好的了解。我们已经证明了使用 oxr 作为牺牲模具来制造图案水凝胶，但如果使用与制造相关的聚合物版本，oxr 也可以进行紫外线稳定。