利用STA-PUT沉降速度法分离精原细胞类型

本实验的总体目标是分离睾丸中不同类型的细胞。首先，从小鼠中获取混合的细胞群体。将睾丸细胞与BSA梯度液加入“stay put”装置中。

现在让细胞通过BSA梯度沉降。然后收集各组分，并根据细胞组成进行合并。最终，利用“stay put”速度沉降法，根据细胞大小和密度的差异，从睾丸中分离不同类型的细胞。

与现有方法（如 facts）相比，该技术的主要优势在于，仅使用简单的玻璃器皿和重力即可分离出大量不同类型的细胞，且纯度较高。将两个两升的圆筒和细胞加样室固定在顶部平台，并用两段小段软管及软管夹连接所有部件。夹紧所有软管使其关闭，并密封最右侧两升圆筒的出口。

在细胞加样室中放入一个小的搅拌子，在最左侧的两升圆筒中放入一个较大的搅拌子。然后将两升沉降室放置在平台上。将金属挡板直接置于沉降室底部开口的正上方，以防止液体在组分收集过程中产生涡流，从而避免细胞梯度被破坏。

现在将沉降室的盖子盖上。在三通旋塞的磨砂玻璃接头处涂抹少量真空脂。然后将旋塞用夹具固定在沉降室底部，连接旋塞与沉降室的磨砂玻璃接头。

接下来，使用管路将细胞加样室连接到三通阀的右侧出口。关闭三通阀，然后将细胞分馏管路连接到三通阀的左侧出口，并夹住最底部的小管。将2% BSA溶液倒入左侧的两升量筒中。

将4% BSA溶液倒入右侧的两升量筒中。确保连接这些量筒的管路中无大气泡。将Krebs缓冲液倒入细胞加样室，并充满连接该室与沉降室的管路。

检查是否存在可能干扰梯度的大气泡。如有必要，可轻轻挤压或弹击管路以去除气泡。确认所有CREBS均位于管内，而不在细胞室中。

让少量 Krebs 缓冲液流入沉降室。然后将几乎全部缓冲液排入细胞分级管中。为了充满管道并去除任何大气泡，将分级收集器直接放置在沉降室下方。

检查所有收集管是否已放置到位，并用塑料膜覆盖以防止污染。在另一培养皿中加入8 mL Krebs液，将睾丸去囊。用一对镊子在包围生精小管的薄膜上剪开切口。

用另一把镊子夹住膜。将小管从膜中推出并移开。将含有小管的4毫升克雷布斯液转移至各含有25毫升胶原酶溶液的锥形管中。

在33摄氏度下振荡10分钟，直至小管呈现类似意大利面的外观。接着，让小管在管底静置沉降5分钟。倒出上清液，并在室温下用25毫升克雷布斯液（Krebs）洗涤两次，每次均让小管沉降至管底。

每个试管中保留约五毫升克列布斯液。将小管与胰蛋白酶孵育后，使用宽口移液管轻轻搅动含有小管的溶液。

反复吹打约10次。溶液应逐渐呈现单细胞悬液的状态。现在将每份30毫升的单细胞悬液通过100微米的细胞滤网进行过滤。

混合细胞悬液后，计数细胞总数。确保旋塞的位置能够将细胞室中的液体导向沉降室。将两个搅拌子加热板调至低速搅拌档位。

然后将细胞悬液倒入细胞室中。打开活塞，使细胞以每分钟10毫升的速度缓慢流入沉降室。随后关闭活塞，以将细胞从细胞室中冲洗出去。

以每分钟10毫升的速度将5毫升0.5% BSA溶液倒入并流入沉降室。关闭旋塞，再重复BSA洗涤四次。然后打开细胞室与两个2升量筒之间的夹子，立即以每分钟40毫升的速度将液体排入沉降室，调节流速，使BSA梯度溶液在约20至30分钟内完成加载。

观察位于BSA梯度上方的一层薄而未受扰动的细胞。当大部分BSA加载完毕后，关闭旋塞阀，并将其旋转至使液体从沉降室流入分级管的位置。此时关闭搅拌板，让细胞沉降1小时45分钟。

沉降完成后，将分段收集管连接至分级收集器。通过调节活塞控制流速，使每45秒收集10毫升至每根收集管中。待所有组分收集完毕后，通过显微镜分析各组分中的不同细胞群体。

可根据细胞大小和细胞核形态区分不同类型的细胞，以确定各组分的纯度。取10微升DPI染色的细胞滴加到载玻片上，盖上盖玻片后用荧光显微镜观察。

根据大小和细胞核形态的相似性，分离出细胞群体。通常使用约22个睾丸进行制备，通过该原位操作可获得约10的8次方个细胞。

利用光学显微镜和荧光显微镜相结合的方法，可快速分析睾丸中的不同细胞类型组分。初级精母细胞、精原细胞和体细胞二倍体细胞是睾丸中体积最大的细胞，其细胞核较大，经dpi染色后呈现相对均一的着色。圆形精子细胞体积较小，具有较小的圆形细胞核，通常含有一个染色较深的染色质中心；而正在伸长的精子细胞为更小的细胞，其细胞核呈镰刀状。

将细胞组分合并后，可通过细胞裂解物的蛋白质印迹分析进一步确定其纯度。细线期细胞的常见标志物是联会复合体蛋白1（Synaptonemal Complex one proteins）；浓缩的精子细胞的常见标志物是转换蛋白（transition proteins）或鱼精蛋白（protamine）。

一旦掌握，该技术在开发完成后若操作得当，可在七小时内完成。该技术为精子发生领域的研究人员探索睾丸中不同类型细胞的细胞过程铺平了道路。