生精细胞类型使用STA把速度沉降分离
October 9th, 2013
在STA-PUT方法允许对生精细胞的不同人群根据大小和密度的分离。
该程序的总体目标是分离睾丸中发现的不同类型的细胞。首先，从小鼠中收获混合细胞群。睾丸将细胞和 BSA 梯度加载到保持不动的装置中。
现在让细胞通过 BSA 梯度沉淀。然后收集组分并根据细胞组成进行组合。最终，保持不动的速度沉降用于根据大小和密度的差异将不同类型的细胞与睾丸分离。
与现有方法（如事实）相比，该技术的主要优点是可以使用简单的玻璃器皿和重力以相当高的纯度分离大量不同的细胞类型。将两个 2 升气瓶和细胞加载室固定到顶部平台，并用两小块管子和管夹连接。夹紧所有管子，并将喷嘴密封在最右边的 2 升气缸上。
在细胞加载室中放置一个小搅拌棒，在最左侧的 2 升圆筒中放置一个较大的搅拌棒。然后将 2 升沉淀室放在平台上。将金属挡板直接放在沉淀室底部开口的顶部，以防止在馏分收集过程中液体涡旋和细胞梯度中断。
现在盖上沉淀室的盖子。将极少量的真空润滑脂涂抹在三通旋塞的磨砂玻璃接头上。然后将旋塞阀夹在沉淀室的底部，连接旋塞阀的磨砂玻璃接头和沉淀室。
接下来，将细胞加载室连接到带有管路的旋塞旋塞的右侧出口。关闭旋塞阀，然后将细胞分离管连接到旋塞阀的左侧出口，并将小管夹在最底部。将 2% BSA 溶液倒入左侧的 2 升圆筒中。
将 4% BSA 溶液倒入右侧 2 升圆筒中。确保连接这些气瓶的管道中没有大气泡。将 Krebs 缓冲液倒入细胞加载室中，并填充连接该腔室与沉淀室的管道。
验证没有可能干扰梯度的大气泡。如有必要，轻轻挤压或轻弹管路以去除气泡。确认所有 crebs 都在试管中，而不是在细胞室中。
允许少量 Krebs 缓冲液流入沉淀室。然后将几乎所有缓冲液排空到细胞组分分离管中。为了填充试管并去除任何大气泡，请将馏分收集器直接放在沉淀室下方。
检查所有馏分管是否就位并用保鲜膜覆盖以防止污染。将睾丸解封装在含有 8 毫升 Krebs 的单独板中。用一对镊子在围绕生精小管的薄膜上做一个切口。
现在用另一对镊子握住膜。将小管推出膜并远离膜。将 4 毫升含有小管的 Krebs 转移到每个含有 25 毫升胶原酶溶液的锥形管中。
在 33 摄氏度下摇晃 10 分钟，直到小管形成意大利面状外观。接下来，让小管沉降 5 分钟，直到试管底部。倒出上清液，在室温下用 25 毫升 Krebs 洗涤两次，每次让小管沉降到管底。
在每个试管中留下大约 5 毫升的 Krebs。用胰蛋白酶孵育小管后。使用大口径移液器搅拌含有小管的溶液。
将它们移入和移出大约 10 次。溶液应该开始看起来更像单细胞悬液。现在通过 100 微米网状细胞过滤器过滤每个 30 毫升单细胞悬液。
混合细胞悬液后，计数细胞总数。确保旋塞阀的位置将流从细胞室引导到沉淀室中。将两个搅拌棒板调低。
然后将细胞悬液倒入细胞室中。打开旋塞阀，使细胞以每分钟 10 毫升的速率缓慢流入沉淀室。然后关闭旋塞，将细胞从细胞室中洗出。
倒入 5 毫升 0.5% BSA 溶液，以每分钟 10 毫升的速度排入沉淀室。关闭旋塞阀并再重复 BSA 洗涤四次。现在打开细胞室和两个 2 升圆筒之间的夹子，立即以每分钟 40 毫升的速度将液体排入沉淀室，调整流速，使 BSA 梯度加载到沉淀室中大约需要 20 到 30 分钟。
监测位于 BSA 梯度顶部的一层薄的未受干扰的细胞。加载大部分 BSA 后，关闭旋塞并将其转动到允许液体从沉淀室排入分馏管的位置。现在关闭搅拌板，让细胞沉淀 1 小时 45 分钟。
沉淀完成后，将馏分管连接到馏分收集器。使用旋塞阀调整流速，以便每 45 秒收集每个收集管 10 mL。收集所有组分后，在显微镜下分析不同细胞群的组分。
可以根据细胞大小和细胞核形态来区分不同的细胞类型，以确定每个组分的纯度。将 10 μL DPI 染色细胞转移到载玻片上。放置盖玻片并用荧光显微镜分析。
拉出大小和细胞核形态相似的组分以创建细胞群。大约 22 个睾丸的典型制剂。通过这种保持原位程序，大约产生 10 到第 8 个细胞。
Perper metagene 细胞类型组分可以使用光学和荧光显微镜的组合进行快速分析。肌细胞、精原细胞和体细胞二倍体细胞是睾丸中发现的最大细胞，将包含大细胞核，这些细胞核与 dpi 相对均匀地染色。圆形精子细胞是具有较小圆形细胞核的较小细胞，通常具有明亮染色的染色色中心凝聚细长的精子细胞是具有镰刀状细胞核的小细胞。
混合细胞组分后，可以通过细胞裂解物的蛋白质印迹血液分析进一步确定纯度。肌细胞的常见标志物是 Synap Neal Complex one 蛋白。浓缩精子细胞的常见标志物是过渡蛋白或鱼精蛋白。
一旦掌握，如果在开发后正确执行，这项技术可以在 7 小时内完成。这项技术为精子发生领域的研究人员探索睾丸不同细胞类型的细胞过程铺平了道路。
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概述
STA-PUT方法允许基于大小和密度对不同种群的精子发生细胞进行分离。这种技术对于从睾丸中分离特定细胞类型以进行进一步分析至关重要。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 生殖生物学
背景
- 了解精子发生对于生殖健康至关重要。
- 睾丸中的不同细胞类型具有不同的角色和特征。
- 分离技术增强了对这些细胞类型的研究。
- STA-PUT方法利用大小和密度差异进行细胞分离。
研究目的
- 分离各种种群的精子发生细胞。
- 提高对睾丸细胞组成的理解。
- 促进对精子发生细胞功能的进一步研究。
使用的方法
- 从小鼠睾丸中收集混合细胞种群。
- 将细胞和BSA梯度加载到STA-PUT装置中。
- 让细胞通过BSA梯度沉降。
- 根据细胞组成收集并合并分数。
主要结果
- 成功分离了不同类型的精子发生细胞。
- 证明了STA-PUT方法的有效性。
- 基于大小和密度识别细胞种群。
- 为进一步研究精子发生提供了潜在应用。
结论
- STA-PUT方法是一种可靠的细胞分离技术。
- 该方法增强了对精子发生细胞多样性的理解。
- 未来的研究可以在此研究的发现基础上继续进行。
常见问题
Executive Industry Relevance
Efficient separation of spermatogenic cell types is critical for dissecting the molecular mechanisms underlying mammalian spermatogenesis, a process not yet recapitulated in vitro. The STA-PUT velocity sedimentation method enables high-yield, scalable enrichment of distinct testicular cell populations, supporting early discovery and mechanistic de-risking in reproductive biology pipelines. This capability is particularly valuable for R&D teams lacking access to advanced cell sorting infrastructure, facilitating robust target validation and functional studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of cell-type specific pathways in spermatogenesis using enriched populations.
- Supports biological de-risking by isolating functionally distinct germ cell stages for mechanistic studies.
- Facilitates predictive confidence in target validation by providing sufficient cell numbers for downstream assays.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, enriched cell fractions for quantitative and reproducible assay development.
- Supports assay standardization by enabling consistent isolation of defined cell types across experiments.
- Delivers high-yield outputs suitable for scalable compound screening and platform reuse.
Translational & Preclinical Research
- Provides disease-relevant cell populations for translational biomarker discovery in reproductive biology.
- Enables continuity from early discovery to preclinical validation by supplying primary cells for functional studies.
- Reduces mechanistic ambiguity in preclinical models by allowing precise cell-type attribution of observed effects.
Pipeline & Workflow Integration
The STA-PUT method integrates into the discovery continuum from early target validation through assay development and preclinical research, especially where in vitro differentiation systems are lacking.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating specific spermatogenic stages.
- Screening: Provides reproducible, quantitative cell fractions for downstream functional assays.
- Analytics: Enables measurement of cell-type specific markers and outputs via microscopy and immunoblotting.
- Translational Research: Supplies primary cell populations for biomarker alignment and disease modeling.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, equipment-light solution adaptable across multiple research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in reproductive target validation.
- Operational Value: Delivers high-yield, reproducible cell fractions using accessible instrumentation.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by supporting robust early-stage data generation.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of reproductive biology programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in testis dissection, cell handling, and gradient sedimentation.
- Needs specialized but widely available glassware and cold-room or large refrigerator access.
- Demands cross-team standardization for fraction collection and purity assessment.
- Adaptable to various rodent models but may require optimization for other species.
- Fraction purity is moderate; downstream validation (e.g., microscopy, immunoblotting) is essential.
