从外周靶向通过伪狂犬病病毒进行跨突触示踪，继而进行霍乱毒素与生物素化葡聚糖胺双标记

本实验的总体目标是发现投射到特定外周靶点的分布细胞所构成的中枢前运动网络，并进一步验证这些脑内细胞之间的特异性连接。该目标首先通过外周肌肉注射跨突触病毒载体逆行感染前运动环路来实现；实验的第二步是利用荧光显微镜对被感染的细胞进行成像观察。

第三步是通过向运动前神经回路中先前已鉴定的节点注射单突触示踪剂，以确认大脑中的特定连接。最终，结合跨突触病毒示踪技术与传统的单突触神经解剖学方法，结果可揭示分布式的运动前神经网络中的细胞是如何相互连接的。与传统的单突触神经示踪等现有方法相比，该技术的主要优势在于，可在麻醉小鼠上识别出分布式神经网络的节点，并解析该网络内细胞之间的特定连接。

通过修剪毛发并使用聚维酮碘和70%酒精交替擦拭至少三次来消毒皮肤，以准备手术区域。现在在喉部区域做皮肤切口，暴露目标肌肉。例如，要暴露环甲膜喉肌，需先去除覆盖其上方的胸骨舌骨肌，并使用Vet Bond组织粘合剂封闭任何被切断的肌肉。

接下来，用新解冻的 PR RV 溶液填充 10 微升纳米注射器系统。缓慢排空死体积，并确认溶液从微注射器尖端流出。将废液作为生物危害性废物丢弃，并小心地将注射器安装到立体定位仪上。

使用微定位装置，小心地将针尖插入目标肌肉中。然后缓慢注射，直至观察到轻微肿胀。接着将注射器移至下一个目标肌肉（本例中为环甲侧肌），重复上述操作。

注射操作仅需穿刺每块肌肉一次。注射速率需根据肌肉大小和注射体积进行调整。例如，为填充环甲肌，应在同一位置以每秒4纳升的速度注射200纳升，分五次进行，每次间隔一分钟。

撤出微量注射器后，使用 Vet Bond 组织粘合剂封闭筋膜的切口。待所有注射完成后，用 Vet Bond 组织粘合剂闭合伤口。持续观察动物，直至其恢复胸卧位。

然后根据您所在机构的动物使用指南，按需提供镇痛、食物、水和护理。EGFP表达及PRV感染神经元的分析步骤在文本方案中已有详细说明。

组织处理步骤与本视频稍后介绍的内容非常相似。首先麻醉成年小鼠，注意保护其眼睛，并固定头部位置。然后按照之前所述方法，使用聚维酮碘和70%酒精交替擦拭，准备手术区域。

现在进行头皮切口，并将头皮向脑部方向牵开。感兴趣区域。在相应立体定位坐标处，使用钻头进行小范围开颅。

例如，通过PRV示踪在成年小鼠中鉴定出的喉部连接运动皮层的坐标位于bgma外侧1.2毫米、头侧0.2毫米处。接下来，配制7.5%的生物素化葡聚糖胺（biotinylated dextran amines）无菌水溶液。然后，用足量BDA溶液填充NanoJet II微注射系统，以满足计划中的注射需求。

缓慢清除死腔，并确认溶液正从微移液管尖端流出。使用微调定位装置，小心地将微移液管尖端插入目标脑区，并缓慢注入BDA溶液。根据需要标记区域的大小调整注射速率。

例如，应在四个不同位置分别注射12次，每次4.6纳升，各位置之间相距0.2毫米，以覆盖成年小鼠喉部相连的运动皮层。

最终注射体积应根据目标区域的大小进行调整。需注意示踪剂可能从注射核心部位通过脑组织以及标记神经元的突起发生扩散。使用无菌生理盐水清洁并润湿颅骨开窗区域，并用Vet Bond组织粘合剂闭合头皮切口。

持续观察动物，直至其出现胸卧位。随后根据所在机构的动物使用指南，按需提供镇痛、食物、水及相应护理。

六天后，可将霍乱毒素B亚基注入动物肌肉中。三天后，处死动物进行分析。在冷冻切片机上以40微米厚度切片，并将漂浮切片保存于0.1摩尔PBS中。用含0.3%过氧化氢的PBS溶液在避光并振荡条件下孵育切片30分钟以淬灭背景。

用 PBS 清洗切片三次，每次五分钟。然后在室温下用新鲜配制的 A b, C 溶液孵育一小时。接着用磷酸盐缓冲液清洗切片三次，每次十分钟。

然后在含有DAB、过氧化氢和氯化镍的磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中振荡孵育切片8分钟。细胞内的DAB反应产物应呈黑色。

接下来，在含有0.3%吐温20和来自Vector Stain Elite试剂盒的正常兔血清的PBS中，于室温下振荡孵育30分钟以封闭切片。随后，将封闭后的切片加入山羊抗CTB抗体中，室温下振荡孵育2小时。然后用PBS再洗涤切片三次，每次5分钟。

加入VE试剂盒中的兔抗二抗，于室温下振荡孵育切片1小时。用PBS清洗切片3次，每次5分钟，然后在新配制的A、b、C溶液中室温反应30分钟。再用磷酸盐缓冲液清洗切片3次，每次10分钟，随后孵育切片8分钟。

在显色液中，细胞内的DAB反应产物应呈现棕色。现在将切片置于超粘附载玻片（super frosts plus slides）上，通过梯度酒精系列对组织进行脱水，随后用二甲苯进行两次透明处理。然后用中性树胶（paramount）封片，并进行成像分析。

注射P RV 1 52后72小时，初级运动神经元中应开始出现微弱的EGFP荧光信号，90小时后染色信号变得明显。在将P RV 1 52注射至七块喉肌中的两块后94小时，可观察到包含喉运动神经元的疑核。这是因为病毒通过支配受感染肌肉的神经元进入了脑组织。

其他运动神经元池（如舌下神经核）在90小时后不表达EGFP。可在二级细胞中观察到EGFP。这些脑干神经元是在疑核初次感染后被染色的。

注射为单侧进行，脑干中呈现的标记模式显示同侧疑核被感染。疑核和孤束核的网状中间神经元也受到感染，并对EGFP呈现强染色。这些中间神经元连接多个结构，包括喉运动神经元池和对侧疑核。

然而，由于该病毒仅能逆向传播，其传出靶点仍无法被标记。PRV 的存活时间有限，但可在第三级及更高级的细胞中显示 EGFP 染色，这些细胞为运动皮层中被感染的前运动神经元，且 EGFP 表达位于外周注射部位的对侧。推测只有构成喉部肌肉运动皮层表征的细胞群被感染。

在疑核水平，由箭头指示的BDA标记的轴突与通过喉肌注射逆行标记的CTB阳性运动神经元（呈棕色）形成接触，这些轴突在喉运动神经元树突附近以及喉运动神经元胞体附近形成串珠样膨大和假定的终末棒状结构。需要进一步通过电子显微镜或电生理学实验来确定这些串珠样膨大是否代表突触结构。在喉部连接的运动皮层中进行双侧BDA注射，显示为黑色，因为BDA不具有方向特异性，因此传入和传出连接均可能被标记。

例如，在丘脑中可同时观察到顺行标记的投射区域和逆行标记的细胞体。丘脑细胞由箭头指示，内囊作为定位标志进行标注。请注意，操作伪狂犬病病毒和DAB时可能具有极高危险性，必须采取消毒等防护措施。

所有接触过PRV或DAB的材料均需使用10%次氯酸钠溶液处理。在进行本操作时，应始终按照所在机构的规定，对生物危害性固体和液体废物进行适当处置。