Name: 从外围目标跨突触跟踪与伪狂犬病病毒其次是霍乱毒素和生物素葡聚糖胺双标 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-14T17:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 12 s
Description: 了解利用伪狂犬病病毒进行跨突触追踪以绘制中枢前运动神经网络的技术。该方法结合霍乱毒素和生物素葡聚糖胺双标记验证神经元连接，为神经解剖学研究提供高分辨率图谱。

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感谢日本神户大学的 Toshio Terashima 博士传授喉部手术技术，感谢普林斯顿大学的 Lynn Enquist 博士提供 PRV-Bartha 毒株。本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）先锋奖 DP1 OD000448（授予 Erich D. Jarvis）以及美国国家科学基金会（NSF）研究生研究奖学金（授予 Gustavo Arriaga）的支持。文中所用部分图片来自此前已适当署名的研究工作，根据《PLoS ONE》期刊的编辑政策，依据知识共享许可协议（CC-BY）在开放获取条件下使用。

注意：所有动物实验程序均已通过杜克大学机构动物护理与使用委员会的审查和批准。 &amp;#38; 使用委员会。
1. 伪狂犬病病毒的保存
<ol>
	<li>我们在普林斯顿大学Lynn Enquist博士的实验室获得活病毒（PRV152），滴度为1 × 109 pfu/mL。该病毒的制备方案已有文献报道2。</li>
	<li>在BSL-2生物安全柜内将病毒分装为每管20 µl，并在适当的生物安全条件下于-80 °C保存。</li>
	<li>在注射前立即解冻一份PRV分装样品。</li>
</ol>
2. 肌肉注射的手术准备
<ol>
	<li>通过肌肉注射氯胺酮-赛拉嗪（100&#160;mg/kg 氯胺酮；10&#160;mg/kg 赛拉嗪）诱导全身麻醉，并使用异氟烷维持适当的麻醉深度。</li>
	<li>使用眼用软膏保护角膜。</li>
	<li>按照无菌技术准备手术区域：剪除毛发，并使用聚维酮碘和70%酒精交替擦拭消毒手术部位（至少3个循环）。&#160;务必使用无菌巾覆盖手术区域。在整个操作过程中须严格遵守无菌技术。</li>
	<li>做皮肤切口，暴露目标肌肉。例如，要暴露环甲膜喉肌，需先移除覆盖其上方的胸骨舌骨肌部分组织。</li>
	<li>使用VetBond组织粘合剂封闭任何被切断的肌肉。</li>
</ol>
3. 将PRV注射至肌肉
<ol>
	<li>使用解冻后的PRV溶液填充10 µl NanoFil微量注射器系统，安装34 G不锈钢针头，并小心将其固定在立体定位仪上。</li>
	<li>缓慢清除死腔，并确认溶液从微量注射器尖端流出。将废液作为生物危害废物丢弃。</li>
	<li>使用立体定位微操作装置，将微量注射器针尖小心插入目标肌肉，并缓慢注射至肌肉出现轻微肿胀。注射速度需根据肌肉大小和注射体积进行调整。例如，分五次注射，每次200 nl&#160;（1 µl&#160;以4 nl/sec的速度注射（总量）两次，每次间隔1分钟，注射位置相同，以填充环甲肌。将注射器移至下一个目标肌肉（本例中为侧环杓关节肌），重复注射操作。每块肌肉仅穿刺一次。</li>
	<li>五分钟后收回微量注射器。</li>
	<li>使用VetBond组织粘合剂封闭筋膜的切口。</li>
	<li>所有注射完成后，使用 VetBond 组织粘合剂闭合伤口。根据您所在机构的动物使用指南，也可使用缝线或伤口夹闭合。&#160;</li>
	<li>监测动物直至其恢复胸卧位，并根据机构动物使用指南的要求提供镇痛、食物、水和护理。</li>
	<li>在实验确定的存活时间后（本实验中为90小时，用于标记2nd 通过戊巴比妥过量处死动物，随后经心脏灌注0.9%生理盐水，接着灌注0.1 M PBS中的4%甲醛溶液。</li>
	<li>取出脑组织，用4%甲醛固定24小时。</li>
	<li>在含30%蔗糖的磷酸盐缓冲液中对脑组织进行冷冻保护，时间至少48小时。</li>
</ol>
4. eGFP 的免疫化学检测
<ol>
	<li>使用滑动式切片机将组织切成40 µm厚的切片，并将漂浮切片保存于0.1 M PBS中。当对贴片切片进行染色时，可使用较薄的切片（例如30 µm）。</li>
	<li>将切片置于含0.3% H2O2的PBS中避光孵育30分钟，以淬灭内源性过氧化物酶活性。</li>
	<li>用VECTASTAIN Elite试剂盒（VE试剂盒）中的正常山羊血清，在含0.3% Tween 20的PBS中室温孵育30分钟，以封闭切片中的非特异性抗原位点。</li>
	<li>将封闭后的切片在室温下与兔抗eGFP一抗（1:1,000稀释）孵育3.5小时。</li>
	<li>用PBS洗涤切片3次，每次5分钟，然后在室温下与VE试剂盒中的山羊抗兔二抗孵育1小时。</li>
	<li>根据生产商说明书，配制VE试剂盒中的ABC溶液。</li>
	<li>用PBS洗涤切片3次，每次5分钟，然后在室温下与VE试剂盒提供的ABC溶液反应1小时。</li>
	<li>用磷酸盐缓冲液洗涤切片3次，每次10分钟，随后在pH 7.4的磷酸盐缓冲液中加入0.05% DAB（3,3'-二氨基联苯胺）和0.015% H2O2，显色反应8分钟。</li>
	<li>将切片贴附于SuperFrost Plus载玻片上，并依次通过梯度乙醇（70%、95%、100%、100%，各5分钟）脱水。</li>
	<li>用二甲苯清洗两次（每次5分钟），然后使用Permount封片介质封片。</li>
	<li>在显微镜下观察贴片后的切片。细胞内的DAB反应产物应呈棕色。数字化图像可进行颜色反转处理，以突出显示细微结构。</li>
</ol>
5. 通过PRV示踪发现脑区后进行示踪剂注射的手术准备
<ol>
	<li>通过肌内注射氯胺酮-赛拉嗪（100&#160;mg/kg 氯胺酮；10&#160;mg/kg 赛拉嗪）诱导全身麻醉，并使用异氟烷维持适当的麻醉深度。</li>
	<li>使用眼用软膏保护角膜。</li>
	<li>将头部固定在合适的立体定位仪上。</li>
	<li>按照无菌技术准备手术区域，修剪毛发，并用聚维酮碘和70%酒精交替擦拭消毒（至少3个循环）。</li>
	<li>做头皮切口，并将皮肤向后牵拉，暴露目标脑区。</li>
	<li>在相应的立体定位坐标处进行小范围开颅。例如，在成年小鼠中通过PRV示踪确定的与喉部相连的运动皮层坐标为前囟外侧1.2 mm、前囟头侧0.2 mm。</li>
</ol>
6. 向脑内注射生物素化葡聚糖胺
<ol>
	<li>通过将25 mg BDA（10,000 MW）溶解于333 µl无菌生理盐水中，制备7.5%的生物素化葡聚糖胺（BDA）溶液。</li>
	<li>向Nanoject II微量注射系统中加入足量的BDA溶液，以满足计划中的注射需求。</li>
	<li>缓慢排空死腔，并确认溶液正从微量移液管尖端流出。</li>
	<li>使用立体定位微操装置，小心地将微量移液管尖端插入目标脑区，并缓慢注射BDA。根据待标记区域的大小调整注射速率。例如，为覆盖成年小鼠与喉部相连的运动皮层，应在四个不同位置（前后方向相距0.2 mm）进行共12次、每次4.6 nl&#160;的注射。最终注射体积应根据目标脑区的大小进行调整，需注意标记物可能通过脑组织扩散或沿标记神经元的突起传播而从注射核心区域扩散开来。</li>
	<li>使用牙科水泥封闭颅骨开窗部位，并用VetBond组织粘合剂闭合头皮切口。</li>
	<li>持续监测动物直至其恢复胸卧位，并根据所在机构的动物使用指南要求提供镇痛、食物、水及其他护理。</li>
</ol>
7. 霍乱毒素B亚基向肌肉的注射
<ol>
	<li>通过将 1 mg 霍乱毒素亚基 b（CTb）溶解于 100 µl 无菌生理盐水中，制备 1% 的 CTb 溶液。</li>
	<li>在向脑内注射 BDA 后第六天，按照上述 PRV 注射至肌肉的方法进行手术准备。</li>
	<li>用 CTb 溶液填充 10 µl&#160;NanoFil 微量注射系统，安装 34 G 不锈钢针头，并小心地将其固定在立体定位仪上。</li>
	<li>按照先前 PRV 注射所述方法，对目标肌肉进行微量注射。</li>
	<li>监测动物直至其恢复胸卧位，并根据所在机构的动物使用指南提供镇痛、食物、水及其他必要护理。</li>
	<li>CTb 注射后第三天，通过过量戊巴比妥麻醉处死动物，随后经心脏灌注 0.9% 生理盐水，接着灌注 0.1 M PBS 中的 4% 甲醛溶液。</li>
	<li>取出脑组织，并在 4% 甲醛溶液中后固定 24 小时。</li>
	<li>将脑组织置于含 30% 蔗糖的磷酸盐缓冲液中，进行冷冻保护，时间不少于 48 小时。</li>
</ol>
8. 同一组织切片中 BDA 与 CTb 的检测
<ol>
	<li>使用切片机将组织切成40 µm厚的切片，并将漂浮切片保存于0.1 M PBS中。</li>
	<li>将切片置于含0.3% H2O2的PBS中避光孵育30分钟以淬灭内源性过氧化物酶活性。</li>
	<li>根据VE试剂盒说明书配制ABC溶液。</li>
	<li>用PBS洗涤切片3次，每次5分钟，然后在ABC溶液中室温孵育1小时。</li>
	<li>用磷酸盐缓冲液洗涤切片3次，每次10分钟，随后在pH 7.4的磷酸盐缓冲液中显色8分钟，缓冲液中含0.05% DAB（3,3'-二氨基联苯胺）、0.015% H2O2和0.05%氯化镍。细胞内的DAB反应产物应呈黑色。</li>
	<li>将切片在含0.3% Tween 20和VECTASTAIN Elite试剂盒中提供的正常兔血清的PBS中封闭30分钟。</li>
	<li>将封闭后的切片与山羊抗CTb抗体（1:10,000稀释）在室温下孵育2小时。</li>
	<li>用PBS洗涤切片3次，每次5分钟，然后在室温下与VE试剂盒中的兔抗山羊二抗孵育1小时。</li>
	<li>根据VE试剂盒说明书配制ABC溶液。</li>
	<li>用PBS洗涤切片3次，每次5分钟，然后在ABC溶液中室温反应30分钟。</li>
	<li>用磷酸盐缓冲液洗涤切片3次，每次10分钟，随后在pH 7.4的磷酸盐缓冲液中显色最多8分钟，缓冲液中含0.05% DAB（3,3'-二氨基联苯胺）和0.015% H2O2。细胞内的DAB反应产物应呈棕色。</li>
	<li>将切片贴附于SuperFrost Plus载玻片上，并依次通过梯度乙醇（70%、95%、100%、100%，各5分钟）脱水。</li>
	<li>用二甲苯清洗两次（每次5分钟）以透明化切片，然后使用Permount封片介质封片。</li>
	<li>在显微镜下观察封片后的切片。</li>
</ol>

<ol><li>Card, J. P., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCard%2C+JP+%22Transneuronal+circuit+analysis+with+pseudorabies+viruses.Multiple+values+selected%22">Transneuronal circuit analysis with pseudorabies viruses.Multiple values selected</a>. Unit 1.5, John Wiley & Sons Inc. Hoboken, NJ, USA. Multiple values selected 1.51-1.5.28 (2001).</li>
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</ol>

未声明利益冲突。

在设计使用PRV152的实验时，必须考虑若干问题4,21。最重要的是，伪狂犬病病毒具有致死性。如前所述，包括人类在内的灵长类动物对感染不敏感，但仍需采取适当措施以保护其他动物。成年小鼠在接种减毒PRV152毒株后通常可存活5至7天。因此，PRV152不适用于需要超过一周存活时间的实验。此外，感染动物在存活期间通常会表现出疾病症状，从而限制了PRV152在需要观察正常行为实验中的应用。
此外，PRV152 可触发细胞毒性免疫反应22由于病毒的复制和传播具有滴度和时间依赖性4，通过免疫化学方法检测病毒蛋白或eGFP报告基因所揭示的神经元分布模式，会随着细胞感染进程在存活期间内发生动态变化。接种后5天，肌肉中rd 或 4th 次级神经元可能被检测到，但最早感染的神经元可能已发生凋亡。因此，每项研究都应通过实验确定最佳存活时间。建议进行时间序列分析，以确定感染在神经环路中的传播进程，并确定标记特定目标神经元的最佳时间点，同时避免细胞或动物死亡的风险。
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跨突触示踪&#160;已成为一种强大的工具，用于分析通过多突触环路调控外周靶点的中枢传出通路。该方法在啮齿类动物脑中应用最为广泛，通常利用猪源性病原伪狂犬病毒（pseudorabies virus, PRV），尤其是1961年首次报道的减毒株PRV-Bartha12。本文介绍一种利用表达增强型绿色荧光蛋白（eGFP）报告基因的重组伪狂犬病毒株（PRV152）来鉴定特定肌肉或肌群的运动皮层表征的实验方案2。该方法利用嗜神经病毒的特性，即病毒可产生具有感染性的子代病毒，跨过突触感染功能环路中的其他神经元3,4,13。PRV152与PRV-Bartha为同源株，仅能从感染位点开始，沿突触连接的层级结构逆向跨突触传播3,5。通过精确控制外周感染位点，可限制病毒仅通过特定亚群的运动神经元进入中枢神经系统。随着病毒依次感染相互连接的神经元链，全脑中eGFP信号的分布模式将揭示出与最初感染细胞相连接的神经元网络。
使用病毒进行神经示踪的另一个优势在于感染细胞内报告蛋白（本例中为 eGFP）的信号放大。这种信号放大提供了较高的灵敏度，使得即使是非常稀疏的投射也能被检测到。例如，在大鼠中利用病毒表达的绿色荧光蛋白发现了一条从须部运动皮层到控制胡须的面神经运动神经元的稀疏投射14；而以往的研究使用传统的示踪剂但无报告基因扩增系统时，未能发现该投射11,15。然而，许多病毒示踪载体（包括上述研究中使用的载体）不能跨突触传播，因此限制了其在多突触环路示踪中的应用。
尽管PRV-152的跨突触示踪在识别参与运动环路的细胞网络方面具有显著优势，但其分布特性使得对环路内特定连接的解释变得困难。因此，我们提出一种简单的方法，通过使用生物素化葡聚糖胺（BDA）和霍乱毒素B亚基（CTb）进行双重标记，以验证利用PRV-152鉴定出的环路中的特定连接。联合使用BDA和CTb是一种已被广泛认可的方法，用于示踪特定神经元群之间的连接6-8,11。当两者联合使用时，可通过双色DAB（3,3'-二氨基联苯胺）法在同一组织切片中同时显示两种示踪剂16。本方案选用高分子量BDA（BDA10kDa），因其可对神经元突起实现精细标记6,7,9。BDA10kDa的其他优势包括：主要沿顺行方向运输6-8；可通过离子电泳或压力注射方式递送6-8；可通过简单的亲和素-生物素化辣根过氧化物酶（ABC）法进行显色检测17；并可用于光镜或电镜成像6,7,18。我们选择用辣根过氧化物酶结合DAB对CTb进行免疫化学检测，用于运动神经元的逆行标记，因其能有效显示包括远端树突在内的细胞突起结构10,19。我们近期应用该方法鉴定了小鼠的发声运动通路，并揭示了从初级运动皮层到喉部运动神经元的稀疏连接，而该连接此前被认为并不存在20。

<table><tbody><tr><td>试剂/材料名称</td><td>公司</td><td>目录编号</td><td>备注</td></tr><tr><td>NanoFil 显微注射系统</td><td>World Precision Instruments</td><td>IO-Kit</td><td>34 G 选项</td></tr><tr><td>立体定位仪</td><td>David Kopf Instruments</td><td>Model 900</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject II 自动纳升级注射器</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-204</td><td></td></tr><tr><td>滑动式切片机</td><td>Leica</td><td>SM2010 R</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>VetBond</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷（Forane）</td><td>Baxter&amp;nbsp;</td><td>1001936060</td><td></td></tr><tr><td>碘伏棉签棒</td><td>Cardinal Health</td><td>2130-01</td><td>200 根装</td></tr><tr><td>Permount 封片介质</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus 载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>生物素化葡聚糖胺</td><td>Invitrogen</td><td>D-1956</td><td>分子量 10,000</td></tr><tr><td>伪狂犬病病毒</td><td>普林斯顿大学 Lynn Enquist 博士实验室</td><td>PRV152</td><td>滴度 &gt;1 × 10&lt;sup&gt;7&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>抗霍乱毒素 B 亚基（山羊来源）</td><td>List Biological Laboratories</td><td>703</td><td></td></tr><tr><td>霍乱毒素 B 亚基</td><td>List Biological Laboratories</td><td>103B</td><td></td></tr><tr><td>抗 eGFP 抗体</td><td>Open Biosystems</td><td>ABS4528</td><td></td></tr><tr><td>3,3'-二氨基联苯胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5905</td><td>10 mg 片剂</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>200 证明</td></tr><tr><td>甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td>稀释至 4%</td></tr><tr><td>过氧化氢</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3410</td><td>30%</td></tr><tr><td>盐酸氯胺酮 &amp;amp; 盐酸赛拉嗪</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K4138</td><td>80 mg/ml &amp;amp; 6 mg/ml</td></tr><tr><td>氯化镍</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>339350</td><td></td></tr><tr><td>磷酸缓冲液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3619</td><td>1.0 M；pH 7.4</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5493</td><td>10×；pH 7.4</td></tr><tr><td>戊巴比妥钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3761</td><td>50 mg/ml 剂量</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>吐温 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>534056</td><td>组织学级</td></tr><tr><td>VECTASTAIN Elite ABC 试剂盒</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-6101（兔）；PK-6105（山羊）</td><td></td></tr><tr><td>Optixcare 眼科软膏</td><td>Vet Depot</td><td>1017992</td><td></td></tr></tbody></table>

从外周靶向通过伪狂犬病病毒进行跨突触示踪，继而进行霍乱毒素与生物素化葡聚糖胺双标记

Transsynaptic Tracing from Peripheral Targets with Pseudorabies Virus Followed by Cholera Toxin and Biotinylated Dextran Amines Double Labeling

跨突触示踪已成为一种强大的工具，用于分析通过多突触环路调控外周靶点的中枢传出通路。该方法在脑科学研究中应用最为广泛，通常利用猪源性病原体伪狂犬病病毒（pseudorabies virus, PRV）1。PRV不会感染包括人类在内的大型猿类，因此主要应用于小型哺乳动物，尤其是啮齿类动物的研究中。伪狂犬病病毒株PRV152表达增强型绿色荧光蛋白（eGFP）报告基因，且仅能从感染位点出发，逆向跨过功能性的突触，沿突触连接的层级序列进行传播2,3。其他PRV毒株具有不同的微生物学特性，可能在两个方向上传播（如PRV-Becker和PRV-Kaplan）4,5&#160;.&#160;本实验方案将仅针对PRV152。通过在外周部位（例如肌肉）注射该病毒，可限制病毒通过特定神经元群进入脑内。随后在整个脑组织中观察到的eGFP信号分布模式，即可揭示与最初被感染细胞相连接的神经元。由于伪狂犬病病毒介导的跨突触示踪具有广泛的分布特性，使得在已识别网络中解析特定连接关系变得困难。因此，我们提出一种灵敏且可靠的方法，结合使用生物素标记的葡聚糖胺（BDA）和霍乱毒素B亚基（CTb），以验证通过PRV152鉴定出的细胞之间的连接关系。选择辣根过氧化物酶联合DAB（3,3'-二氨基联苯胺）对BDA和CTb进行免疫化学检测，是因为该方法能够有效显示包括远端树突在内的细胞突起结构6-11。

注射 PRV152 到肌肉后约 72 小时，初级运动神经元中应开始出现微弱的 eGFP 染色信号。病毒的复制及跨突触转运具有滴度和时间依赖性4注射后约90小时，eGFP染色将显示出强烈的信号nd 感染细胞的顺序。更长的存活时间将揭示 3rd 但高阶细胞的存活时间受限于伪狂犬病病毒（PRV）的致死性，接种后约5天内动物即死亡。
图1a 显示了在将PRV152注射到七块喉肌中的两块肌肉后94小时，支配喉部的运动神经元所在的疑核中感染PRV152并表达eGFP的神经元。由于病毒通过支配被感染肌肉的神经元进入脑内，其他发声运动神经元群，如舌下神经核，不表达eGFP（图1b）。
图2 显示病毒向2的逆行运输nd 在初次感染后，脑干神经元在疑核中呈顺序性感染。注射为单侧进行，脑干中呈现的标记模式显示同侧疑核和孤束核被感染。图2a</st...

跨突触示踪已成为一种强大的工具，用于通过多突触环路分析调控外周靶标的中枢传出通路。本文介绍了一种利用跨突触伪狂犬病病毒识别并定位功能性脑环路的实验方案，随后结合经典示踪技术，验证该环路中已鉴定神经元群之间的特定连接。

跨突触示踪已成为一种强大工具，用于通过多突触环路分析调控外周靶标的中枢传出通路。这一……

本实验的总体目标是发现投射到特定外周靶点的分布细胞所构成的中枢前运动网络，并进一步验证这些脑内细胞之间的特异性连接。该目标首先通过外周肌肉注射跨突触病毒载体逆行感染前运动环路来实现；实验的第二步是利用荧光显微镜观察被感染的细胞。第三步是通过向运动前神经环路中先前已鉴定的节点注射单突触示踪剂，以确认大脑中特定的连接关系。最终，结合跨突触病毒示踪技术与传统的单突触神经解剖学方法，结果可揭示分布式的运动前神经网络中各细胞之间的连接方式。该技术相较于传统单突触神经示踪等现有方法的主要优势在于，能够在麻醉小鼠中识别出分布式神经网络的节点，并解析该网络内细胞之间的特异性连接。通过修剪毛发并使用聚维酮碘和70%酒精交替消毒至少三次来准备手术区域。现在在喉部区域做皮肤切口，暴露目标肌肉。例如，要暴露环甲膜喉肌，需先去除覆盖其上的胸骨舌骨肌部分，并用Vet Bond组织粘合剂封闭所有被切断的肌肉。接下来，用新解冻的 PR RV 溶液填充 10 微升纳米填充微量注射器系统。缓慢排出死体积，并确认溶液从微量注射器尖端流出。将液体作为生物危害性废物丢弃，并小心地将其安装到立体定位仪上。使用微定位装置，小心地将针尖插入目标肌肉中。然后缓慢注射，直至观察到轻微肿胀。接着将注射器移至下一个目标肌肉（本例中为侧环杓关节肌），重复上述操作。注射操作仅需穿刺每块肌肉一次。注射速率需根据肌肉大小和注射体积进行调整。例如，向环甲肌内注射时，应在同一位置以每秒4纳升的速度注射5次，每次200纳升，每次注射间隔1分钟，以充分填充该肌肉。撤出微量注射器后，使用 Vet Bond 组织粘合剂封闭筋膜的切口。待所有注射完成后，用 Vet Bond 组织粘合剂闭合伤口。持续观察动物，直至其恢复胸卧位。然后根据你所在机构的动物使用指南，按需提供镇痛、食物、水和护理。EGFP表达及PRV感染神经元的分析步骤在文字版实验方案中有详细说明。组织处理过程与本视频稍后介绍的内容非常相似。首先麻醉成年小鼠，保护其眼睛，并固定头部位置。然后按照前述方法，使用聚维酮碘和70%酒精交替擦拭，准备手术区域。现在进行头皮切口，并将头皮向脑部方向牵开。定位目标区域。在相应立体定位坐标处，使用钻头进行小范围开颅。例如，通过PRV示踪在成年小鼠中鉴定出的喉部连接运动皮层的坐标位于bgma外侧1.2毫米、头侧0.2毫米处。接下来，配制7.5%的生物素化葡聚糖胺无菌水溶液。然后，用足量BDA溶液填充NanoJet II微注射系统，以满足计划中的注射需求。缓慢清除死腔，并确认溶液正从微移液管尖端流出。使用微定位装置，小心地将微移液管尖端插入目标脑区，缓慢注入BDA溶液。根据需要标记的脑区大小调整注射速率。例如，在成年小鼠喉部相连的运动皮层区域，应在四个不同位置，每隔0.2毫米进行注射，每个位置注射4.6纳升，共注射12次。最终注射体积应根据目标区域的大小进行调整。需注意示踪剂可能从注射核心扩散至脑组织中，并沿标记神经元的突起扩散。使用无菌生理盐水清洁并润湿颅骨开窗区域，然后使用 Vet Bond 组织粘合剂闭合头皮切口。持续监测动物，直至其呈现胸卧位。随后根据您所在机构的动物护理指南，给予镇痛、食物、水及必要的护理。六天后，可将霍乱毒素亚基 B 注射到动物的肌肉中。三天后，处死动物以进行分析。在冷冻切片机上以 40 微米厚度切片，并将切下的漂浮切片保存在 0.1 摩尔 PBS 中。用 PBS 配制的 0.3% 过氧化氢避光振荡孵育切片 30 分钟以淬灭背景。用 PBS 清洗切片三次，每次五分钟。然后在室温下用新鲜配制的 A b, C 溶液孵育一小时。接着用磷酸盐缓冲液清洗切片三次，每次十分钟。然后在含有DAB、过氧化氢和氯化镍的磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中振荡孵育切片8分钟。细胞内的DAB反应产物应呈黑色。接下来，在含有0.3%吐温20和来自Vector Stain Elite试剂盒的正常兔血清的PBS中，于室温下振荡孵育30分钟以封闭切片。随后，将封闭后的切片在室温下与羊抗CTB抗体一起振荡孵育2小时。然后用PBS再洗涤切片三次，每次洗涤5分钟。使用VE试剂盒中的兔抗二抗，室温下振荡孵育切片1小时。用PBS洗涤切片3次，每次5分钟，然后在新配制的A、b、C溶液中室温反应30分钟。再用磷酸盐缓冲液洗涤切片3次，每次10分钟，随后孵育切片8分钟。在显色液中，细胞内的DAB反应产物应呈棕色。现在将切片置于超粘附载玻片（super frosts plus slides）上，通过梯度酒精系列对组织进行脱水，随后用二甲苯进行两次透明处理。然后用中性树胶（paramount）封片，并进行成像分析。注射 PRV 152 后 72 小时，可在初级运动神经元中开始观察到微弱的 EGFP 荧光信号，90 小时后染色信号变得明显。在将 PRV 152 注入七块喉肌中的两块后 94 小时，可观察到包含喉运动神经元的疑核。这是因为病毒通过支配受感染肌肉的神经元进入脑内。其他运动神经元池（如舌下神经核）在90小时后不表达EGFP。可在二级细胞中观察到EGFP。这些脑干神经元是在疑核初次感染后被染色的。注射为单侧进行，脑干中呈现的标记模式显示同侧疑核被感染。疑核和孤束核的网状中间神经元也受到感染，并对EGFP呈现强染色。这些中间神经元连接多个结构，包括喉运动神经元池和对侧疑核。然而，由于该病毒仅逆向传播，其传出靶点仍无法标记。PRV 的存活时间有限，但可在运动皮层中感染的第三级及更高级神经元中观察到 EGFP 染色，这些神经元在对侧于外周注射位点处表达 EGFP。推测只有构成喉部肌肉运动皮层表征的细胞群体被感染。在迷走神经背核水平，由箭头指示的BDA标记的轴突与逆行标记的CTB阳性运动神经元接触，这些运动神经元因向喉肌注射示踪剂而被标记（呈棕色）。这些轴突在喉运动神经元的树突附近以及喉运动神经元胞体附近形成膨大结构和假定的终末棒状突起。尚需进一步的电镜或电生理实验来确定这些膨大结构是否代表突触连接。在喉部相连的运动皮层中进行双侧BDA注射后可见黑色信号，由于BDA不具有方向特异性，因此传入和传出连接均可能被标记。例如，在丘脑中可同时观察到顺行标记的投射区域和逆行标记的细胞体。丘脑细胞由箭头指示，内囊则作为定位标记。请务必注意，操作伪狂犬病病毒和DAB时可能具有极高危险性，必须采取诸如灭菌等防护措施。所有接触过PRV或DAB的材料均需使用10%漂白液处理。在进行本实验操作时，应始终按照所在机构的相关规定，妥善处理生物危害性固体和液体废弃物。

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