Name: 一个 em在体外 /em从成年小鼠的肌间神经丛制备隔离肠道神经元和神经胶质 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: 了解从成年小鼠肌间神经丛分离肠道神经元和神经胶质的方法。该技术结合酶消化与细胞培养，可用于电生理学和免疫组织化学研究，为探索肠神经系统功能提供可靠模型。

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美国国立卫生研究院资助项目 DA024009，DK046367 &amp;#38; T32DA007027

所有动物护理和实验程序均符合弗吉尼亚联邦大学机构动物护理和使用委员会的规定，并经其批准。
1. 在24孔板中制备无菌的多聚-D-赖氨酸和层粘连蛋白包被的玻璃盖玻片
<ol>
	<li>第1步的所有操作均需在无菌条件下进行，即在通风橱内使用无菌试剂操作。玻璃盖玻片和双蒸水（ddH₂O）2O）应预先灭菌。培养板的制备可在神经元分离前两周内完成。</li>
	<li>在超净工作台内，使用无菌镊子将经高压灭菌的玻璃盖玻片放入24孔板的12个孔中。</li>
	<li>提前配制多聚-D-赖氨酸储备液。将5 mg多聚-D-赖氨酸加入50 ml无菌ddH2O中，涡旋混匀，分装为每份3 ml，于-20 °C保存。使用前解冻。</li>
	<li>最终浓度为每25 cm²使用1 ml聚-D-赖氨酸储备液2：将80 μl聚-D-赖氨酸原液滴加到每个玻璃盖玻片（2 cm）上2静置溶液10分钟。</li>
	<li>用真空泵去除聚-D-赖氨酸，并用无菌ddH₂O将盖玻片冲洗3次2O.</li>
	<li>在通风橱中让平板干燥至少2小时。</li>
	<li>平板可在进行层粘连蛋白包被前于 4 °C 或 -20 °C 保存。</li>
	<li>提前准备层粘连蛋白（laminin）储备液。将层粘连蛋白置于冰上解冻，并在使用过程中始终保持在冰上。将其稀释至浓度为50 μg/ml；注意不同批次的浓度差异；每批浓度均可能不同。根据批次浓度的不同，大约需使用20 ml ddH₂O2每管层粘连蛋白中将加入 O。分装（5 ml），于 -80 °C 保存。使用前在冰上解冻分装样品。</li>
	<li>用 5 μg/cm 的量将盖玻片包被2 层粘连蛋白；在每个盖玻片上加入200 μl层粘连蛋白储备液。</li>
	<li>将层粘连蛋白溶液在盖玻片上孵育1小时。</li>
	<li>吸除残留的层粘连蛋白溶液，用ddH₂O冲洗盖玻片一次2O. 避免刮擦盖玻片表面。</li>
	<li>将平板置于4 °C保存，最长可保存两周。</li>
</ol>
2. 神经元分离溶液的预先配制
<ol>
	<li>配制 Krebs 溶液（单位：mM：118 NaCl，4.6 KCl，1.3 NaH2PO4，1.2 MgSO₄4, 25 NaHCO₃3，11 葡萄糖，和 2.5 CaCl2)。加入13.79 g NaCl（分子量58.44）、0.686 g KCl（分子量74.55）、0.312 g NaH2PO4 (FW 120)，0.289 g MgSO₄4 （FW 120.4），4.20 g NaHCO₃3 (FW 84.01)、3.96 g 葡萄糖 (FW 180.2) 和 0.555 g CaCl2 (FW 111) 溶于 2 L ddH₂O20. 冷却至 4 °C。</li>
	<li>配制洗涤培养基（含10%胎牛血清（FBS）和抗生素/抗真菌剂的F12培养基）：向500 ml F12培养基中加入50 ml FBS和5 ml抗生素/抗真菌剂100倍浓缩液（Gibco）。</li>
	<li>制备肠神经元培养基（含B-27、2 mM L-谷氨酰胺、1% 胎牛血清、10 ng/ml 胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）和100倍浓度抗生素/抗真菌剂的Neurobasal A培养基）。配制GDNF储备液：将1 ml ddH2O加入10 μg GDNF中溶解，分装为50 μl每管，于-80 °C保存。配制50 ml完全神经元培养基时，混合47.5 ml Neurobasal A培养基、1 ml B-27（50倍浓度）、500 μl 胎牛血清、500 μl 200 mM L-谷氨酰胺（Gibco）、50 μl GDNF储备液和500 μl 100倍浓度抗生素/抗真菌剂液体。培养基以50 ml小批量配制，以确保GDNF的新鲜度，并避免大量昂贵的细胞培养基混合物被污染。</li>
</ol>
3. 从小鼠收获纵向肌/肌间神经丛（LMMP）标本
<ol>
	<li>在进行动物实验之前，应确保具备相应的国家和机构伦理审批。成年Swiss Webster小鼠（体重超过25 g，通常年龄超过8周）在实验前以每组6只的方式饲养。每只小鼠的组织用于回肠肠神经元和胶质细胞的分离，三只小鼠用于结肠细胞的分离。</li>
	<li>准备手术区域。准备小型手术剪刀、弯头镊子、棉签、三个200 ml玻璃烧杯以及玻璃或塑料棒（或画笔）。确保所有器械在使用前经过彻底清洗和冲洗，以尽量减少污染。此步骤可在实验前一天完成。</li>
	<li>将Krebs溶液置于冰上，并用碳氧混合气体（95%氧气，5% CO2）持续通气至少30分钟，以稳定pH值。</li>
	<li>开启各类设备并预热化学试剂至所需温度：将水浴锅加热至37 °C，离心机冷却至4 °C，将Hank's平衡盐溶液（HBSS）和0.5%胰蛋白酶置于37 °C水浴中。神经元完全培养基和冲洗液应保持冷藏。</li>
	<li>将150 ml冰冷且已通气的Krebs溶液分别加入三个标记为“脏”、“净”和“LMMP”的200 ml玻璃烧杯中。对标注为“LMMP”的烧杯持续通入碳氧混合气体。</li>
	<li>在获得伦理委员会批准后，通过颈椎脱位或CO2窒息法处死小鼠。</li>
	<li>将小鼠仰卧位放置于手术台面，用70%乙醇清洁皮肤，用镊子提起腹部皮肤。使用剪刀切开腹腔，暴露内部消化器官。</li>
	<li>通过提起一段回肠并暴露其肠系膜，将整个胃肠道组织取出。用剪刀剪断肠系膜，轻柔地分离并展开回肠和结肠，注意避免将肠系膜从回肠或结肠上撕下。</li>
	<li>在整段肠道完全展开后，于胃远端和盲肠近端处切断，取下回肠。注意：若使用结肠组织，可通过从盲肠远端至肛门近端处切除结肠进行相同操作。</li>
	<li>组织可进一步分为近端和远端结肠、空肠及回肠。本操作后续步骤以回肠组织分离为例；结肠LMMP的分离流程与此相同。将整段回肠放入标记为“脏”的玻璃容器中，内含冰冷Krebs溶液。</li>
	<li>制作用于清洗回肠的工具：使用磨刀石将一支较大的20 G针头磨钝，并将其连接至一个装有冰冷Krebs溶液的大容量注射器（10 ml）上。</li>
	<li>将回肠切成三段或更多大段以清洗粪便残留物。从烧杯中取出一段回肠，将磨钝的针头插入回肠段的一端。</li>
	<li>轻柔地将Krebs溶液注入肠段，直至所有粪便残留物被冲洗至单独的废液容器中。将清洗后的肠段转移至标记为“净”的Krebs溶液容器中。重复此步骤，直至整段回肠清洗完毕。</li>
	<li>为分离LMMP，将回肠切成约2–4 cm的小段。将一段回肠套在塑料或玻璃棒上，确保回肠贴合但不过松或过紧（约2 mm）。使用镊子轻柔去除仍附着在胃肠道（GI）组织上的残余肠系膜，开始LMMP的分离。在操作过程中，用拇指轻压固定肠道，防止其在棒上旋转。</li>
	<li>将LMMP与下方的环形肌层分离：首先用镊子边缘沿肠系膜附着线从上至下轻柔摩擦，使纵行肌层产生微小缝隙。然后使用蘸有Krebs溶液的棉签轻柔剥离纵行肌层。</li>
	<li>从纵行肌层的缝隙顶端开始，以最轻的水平划动并施加极轻微压力，直至纵行肌层开始与环形肌层分离；沿肠系膜附着线全程重复此操作。</li>
	<li>随后轻柔地环绕GI管壁操作，从顶部到底部再返回，逐步将纵行肌层完全从环形肌层上分离。操作完成后，LMMP将自然脱离剩余的GI管壁。</li>
	<li>将分离得到的薄层纵行肌条放入标记为“LMMP”的烧杯中。对所有肠段重复此操作。</li>
	<li>在一例小鼠的所有LMMP条收集完毕后，对其他用于实验的小鼠重复上述操作。重复使用前，应彻底冲洗“脏”和“净”烧杯。</li>
	<li>用3次冲洗去除LMMP中的生物污染。准备三个2 ml离心管，每管加入冰冷Krebs溶液。将LMMP条放入第一管中，在4 °C预冷的离心机中以356 × g离心30秒。小心吸除上清液，并将LMMP条转移至下一个装有新鲜冰冷Krebs溶液的离心管中。对剩余各管重复此步骤。</li>
</ol>
4. 消化 LMMP
<ol>
	<li>通过将 13 mg 2 型胶原酶和 3 mg BSA 置于 10 ml 经碳氧混合气（carbogen）鼓泡的 Krebs 溶液中，制备消化液。</li>
	<li>将清洗过的 LMMP 组织段放入消化液中，用剪刀将 LMMP 剪成微小碎片。</li>
	<li>将 LMMP 在 37 °C 水浴振荡器中消化 60 分钟，同时持续轻柔地通入碳氧混合气。</li>
	<li>消化完成后，以 356 × g 离心 8 分钟（离心机预冷至 4 °C），收集细胞。</li>
	<li>自此步骤起，所有操作均须在细胞培养超净台中的无菌条件下进行！ 所有试剂和容器在使用前均应灭菌。</li>
	<li>离心期间，将 1 ml 预热的 0.25% 胰蛋白酶溶液与 4 ml 预热的 HBSS 混合，置于无菌 50 ml 细胞培养管中，配制 0.05% 胰蛋白酶溶液。</li>
	<li>离心后，吸除并弃去上清液。切勿使用真空泵，因离心速度较低，可能导致细胞沉淀被吸走。小心取出细胞沉淀，并转移至含 5 ml 0.05% 胰蛋白酶溶液的洁净离心管中。</li>
	<li>将细胞在 0.05% 胰蛋白酶溶液中于 37 °C 水浴振荡消化 7 分钟。总胰蛋白酶处理时间不得超过 7 分钟，否则神经元将死亡。</li>
	<li>胰蛋白酶消化 7 分钟后，加入 10 ml 冷的清洗培养基以中和胰蛋白酶活性。</li>
	<li>以 356 × g 离心 8 分钟。吸除并弃去上清液。</li>
	<li>离心期间，将一片灭菌的 Nitex 滤网平衡放置于无菌 15 ml 细胞培养管管口上方。</li>
	<li>离心后，吸除并弃去上清液。用 3 ml 完全神经元培养基轻柔吹打重悬细胞混合物。此步骤及后续所有吹打操作中均应避免产生气泡。所有吹打操作均须极其轻柔。将细胞悬液经 Nitex 滤网过滤至洁净的 15 ml 细胞培养管中。</li>
	<li>可选：盖上细胞培养管管盖，置于冷藏 Hula 混匀仪（或任何可提供旋转混合的仪器）中，轻柔滚动并倾斜混匀 30 分钟。此步骤可选，但推荐执行。</li>
	<li>可选：Hula 混匀仪处理后，加入 2 ml 冷的清洗培养基洗涤细胞。</li>
	<li>以 356 × g 离心 8 分钟收集细胞。吸除并弃去上清液。</li>
	<li>用 1,200 μl 完全神经元培养基重悬细胞。使用 1 ml 塑料移液枪头轻柔吹打细胞，避免产生气泡。缓慢轻柔地移液，直至大部分团块被分散，细胞均匀悬浮于液体中。</li>
	<li>向含有预包被玻璃盖玻片的 12 个孔中，每孔加入 750 μl 完全培养基，并加入 100 μl 吹打后的细胞悬液。</li>
	<li>将神经元置于 37 °C、5% CO2 的细胞培养孵箱中孵育。</li>
	<li>每 2 天更换一半培养基。</li>
	<li>神经元在培养 1–2 天后即可用于电生理记录。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在重大竞争利益。

使用的动物
本方案已针对Swiss Webster小鼠进行了优化。然而，该方法也可轻松适用于其他小型哺乳动物（如大鼠）以及其他品系的小鼠。我们已成功使用C57小鼠和μ-阿片受体基因敲除小鼠进行了初步分离。但是，由于胃肠道形态存在差异，其他小鼠品系可能会出现操作困难。此外，不同小鼠品系（如C57Bl/6与Balb/c）在LMMP制备中的神经回路已知存在差异13，这可能影响最终分离所得神经元的组成比例。另外，在使用本方法时应考虑年龄因素，因为肌间神经丛中存在与年龄相关的神经元丢失现象，主要影响胆碱能神经元及其相应的胶质细胞，这种变化最早可在12月龄时观察到14。最后，当将本方案应用于其他动物物种时，需特别注意确保肌间神经丛随纵行肌层被完整剥离，而非残留于环形肌层上。
使用的组织
使用本方案可从回肠和结肠中分别培养神经元和胶质细胞。由于回肠可获取的组织量较多，且其纵行肌层较易与较厚的环形肌层分离，因此回肠组织的分离操作更为简便。在进行膜片钳记录或...

肠神经系统（ENS）是一个庞大的神经和神经胶质细胞网络，贯穿整个胃肠道（GI）的全长。ENS 在功能上调控消化的所有方面，包括蠕动、液体吸收/分泌以及对刺激的感觉， 等等 （详见综述） 1它包含超过5亿个神经元，数量多于脊髓中的神经元，并含有大脑中存在的所有神经递质类别。此外，肠神经系统（ENS）的独特之处在于，它可以在无需中枢神经系统输入的情况下进行反射性功能活动。 2了解肠神经系统（ENS）不仅对于理解其正常的生理功能至关重要，而且对于认识其在多种神经病变中的作用也具有重要意义，这些病变可能为先天性的（如先天性巨结肠）、获得性的（如恰加斯病）、继发于疾病状态的（如糖尿病性胃轻瘫）、药物诱导的（如阿片类药物所致肠功能障碍）或由损伤引起的（如术后麻痹性肠梗阻）。 1此外，肠神经元可成为病毒感染（如水痘-带状疱疹病毒）的储存库3由于肠道与大脑具有相似性，且肠道内血清素水平较高，因此用于治疗中枢神经系统疾病的药物常常对肠神经系统产生意想不到的副作用 2值得注意的是，许多神经病变，如阿尔茨海默病和帕金森病，在中枢神经元出现病变之前很久，其肠神经元已表现出类似的细胞改变，这使得肠神经系统（ENS）成为研究这些疾病发病机制的可及模型。 4因此，深入理解肠神经系统对于认识疾病状态以及预防和预测药物副作用至关重要。
传统上，肠神经系统（ENS）的神经元研究主要采用豚鼠的全层组织制备5-7或培养神经元8进行。尽管在这一大型动物中研究神经元具有操作便利的优势，但该模型存在诸多局限性，包括缺乏基因修饰品系、缺乏针对该物种的特异性试剂，以及饲养和购买这些实验动物的高昂成本。小鼠肠神经系统模型的建立具有独特优势，例如可利用多种基因敲除系统、可与细胞培养技术联合使用的大量已建立的研究方法，以及能够为豚鼠模型提供验证支持。
肠神经系统（ENS）由三个贯穿整个胃肠道的神经丛组成：位于纵行肌与环形肌之间的外层肌间神经丛，主要负责肠道的蠕动功能；以及分别位于黏膜下层和黏膜层内的黏膜下神经丛和黏膜内神经丛，主要调控液体的吸收与分泌以及刺激的感知1。本方法首先通过剥离胃肠道外层肌肉组织，获得纵行肌-肌间神经丛（LMMP）标本。该方法显著减少了因黏膜层参与分离过程而引起的污染问题。因此，该技术特别适用于研究肠神经系统对运动功能的神经调控，而非其分泌功能。
本文所述方法可获得肠神经元与胶质细胞的混合培养物。根据既往电生理学和免疫细胞化学观察结果，至少存在两种不同类型的神经元9。胶质细胞的存在具有显著优势，因为它们不仅是重要的独立研究对象，还能促进肠神经元的存活10，并维持神经元细胞表面受体的天然表达状态11。此外，肠胶质细胞的缺陷可能导致胃肠道运动功能异常的疾病状态，这类疾病被称为“神经-胶质病变”（neuro-gliopathies）12。因此，本文所建立的肠神经系统（ENS）培养体系包含了多种适合深入研究的细胞类型。
该方法的优势在于分离操作简便、所需工具成本低廉，且经验丰富的实验人员可在较短时间内掌握该技术。该方法的局限性包括从大量组织中获得的总体细胞产量较低，以及无法获取来自黏膜层和黏膜下神经丛的肠神经系统神经元。该实验方案对于从事膜片钳电生理学、免疫组织化学、单细胞PCR及其他相关研究方法的科研人员将具有显著优势。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Fisherbrand 细胞培养盖玻片（12 mm 直径）</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-82</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Poly-D-lysine</td><td>Sigma</td><td>P6407- 5 mg</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>24孔细胞培养板</td><td>CELLTREAT</td><td>229124</td><td>可使用任意品牌</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>BD Biosciences</td><td>354 232</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td>可在实验室配制&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>15 ml 无菌离心管</td><td>Greiner Bio-one</td><td>188261</td><td>可使用任意品牌</td></tr><tr><td>50 ml 无菌离心管</td><td>Greiner Bio-one</td><td>227261</td><td>可使用任意品牌</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP358-212</td><td>MW 58.44</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP366-500</td><td>MW 74.55</td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4 &lt;/sub&gt;.2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fisher Chemicals</td><td>S369-3</td><td>MW 137.99</td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7506-500G</td><td>MW 120.4</td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6014-5KG</td><td>MW 84.01</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Fisher Chemicals</td><td>D16-1</td><td>MW 180.16</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5080-500G</td><td>MW 147.02</td></tr><tr><td>F12 培养基</td><td>Gibco</td><td>11330</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Quality Biological Inc.</td><td>110-001-101HI</td><td>可使用任意品牌</td></tr><tr><td>抗生素/抗真菌素 100倍液</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Neurobasal A 培养基</td><td>Gibco</td><td>10888</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>200 mM L-谷氨酰胺</td><td>Gibco</td><td>25030164</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）</td><td>Neuromics</td><td>PR27022</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>尖头解剖剪刀</td><td>Fisher Scientific</td><td>8940</td><td>可使用任意品牌</td></tr><tr><td>解剖组织镊</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-812-41</td><td>可使用任意品牌</td></tr><tr><td>棉签</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-101</td><td>可使用任意品牌</td></tr><tr><td>250 ml 刻度玻璃烧杯</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB-100-250</td><td>可使用任意品牌</td></tr><tr><td>2 L 玻璃锥形瓶</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB-500-2000</td><td>可使用任意品牌</td></tr><tr><td>塑料棒（儿童画笔）</td><td>Crayola</td><td>05 3516</td><td>可使用任意品牌</td></tr><tr><td>Carbogen</td><td>Airgas</td><td>UN 3156</td><td>5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>10 ml 鲁尔锁注射器</td><td>Becton Dickinson</td><td>309604</td><td>可使用任意品牌</td></tr><tr><td>21 G × 1 1/2 英寸皮下注射针头</td><td>Becton Dickinson</td><td>305167</td><td>可使用任意品牌</td></tr><tr><td>胶原酶 II 型</td><td>Worthington</td><td>LS004174</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00440</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>2 ml 微量离心管（Eppendorf 管）</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-864-252</td><td>可使用任意品牌</td></tr><tr><td>Nitrex 网筛 500 &amp;micro;M</td><td>Elko Filtering Co</td><td>100560</td><td>可使用任意品牌</td></tr><tr><td>移液器套装</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-377-328</td><td>可使用任意品牌</td></tr><tr><td>磨刀石</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9681212</td><td>可使用任意品牌</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>LabGard ES 425 生物安全柜（细胞培养罩）</td><td>Nuaire</td><td>NU-425-400</td><td>可使用任意品牌</td></tr><tr><td>10 L 摇动水浴锅</td><td>Edvotek</td><td>5027</td><td>可使用任意品牌</td></tr><tr><td>微量离心机 5417R</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td>可使用带尺寸适配器的单一大型离心机</td></tr><tr><td>Allegra 6 系列离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td>366816</td><td>可使用任意品牌</td></tr><tr><td>HuluMixer 样品混合器</td><td>Invitrogen</td><td>15920D</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>AutoFlow 水套式 CO2 培养箱</td><td>Nuiare</td><td>NU-4750</td><td>可使用任意品牌</td></tr><tr><td>分析天平</td><td>Mettler Toledo</td><td>XS104</td><td>可使用任意品牌</td></tr></tbody></table>

一个 体外 成年小鼠肌间神经丛分离肠神经元和胶质细胞的制备

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

肠神经系统是一个贯穿整个胃肠道的庞大神经元和胶质细胞网络，功能上调控胃肠道的运动。本文描述了一种从肌间神经丛中分离并培养混合神经元和胶质细胞群体的方法。原代培养物可维持超过7天，期间神经元与胶质细胞之间可形成连接。从小鼠回肠或结肠中剥离带有附着肌间神经丛的纵行肌条，将其从下方的环形肌层上分离，并进行酶消化处理。在无菌条件下，通过离心后将分离出的神经元和胶质细胞群体保留在沉淀中，并接种于盖玻片上。24至48小时内出现神经突起的生长，可通过泛神经元标记物鉴定神经元。培养两天后，通过膜片钳实验可观察到分离的神经元产生动作电位。此外，肠胶质细胞可通过GFAP染色进行鉴定。在5至7天内，神经元和胶质细胞可形成紧密相邻的网络结构。可利用免疫组织化学、电生理学、钙成像和单细胞PCR等方法对肠神经元进行个体化和直接研究。此外，该方法也可应用于基因修饰动物。该技术操作简便且成本低廉。总体而言，本方案以易于操控的方式暴露肠神经系统各组分，有助于我们更深入地了解肠神经系统在正常和疾病状态下的功能。

在分离LMMP来源的细胞后，神经元及其他细胞类型尚不明显。可见存活的圆形细胞，其表型不明确，同时存在未完全消化的组织碎片和结缔组织产生的组织碎屑。这些碎片无需担心，大部分将在两天后的首次换液时被清除。在此之前切勿尝试清洁玻片，否则会同时去除健康且有活力的细胞。
培养一天后，神经元将开始出现 neurite 外延生长。此时神经元的特异性鉴定可能仍不明确。只要细胞已足够贴壁，能够转移至实验腔室，则培养一天后即可用于电生理学研究。然而，细胞在培养两天后贴壁更牢固，更适合进行功能研究（如电生理学、钙成像），最佳时间为培养后的第 2 至 5 天左右。
培养约一周后，神经元的形态特征变得明显（图1）。约十天后可观察到理想的免疫细胞化学特征，此时神经元具有较长的突起，并以近乎“神经节样”的方式生长，其间散布着胶质细胞（图2）。该染色结果提示，利用此方法可能有助于研究这些细胞之间的突触相互作用。
培养一天后，神经元可通过...

我们展示了一种用于直接研究肠神经系统中神经元和胶质细胞组分的细胞培养方案。该方法通过取自成年小鼠肌间神经丛的神经元/胶质细胞混合培养，在盖玻片上建立培养体系，从而能够利用电生理学、免疫组织化学等方法对单个神经元和胶质细胞的功能进行检测。 等等.

肠神经系统是一个贯穿整个胃肠道的庞大神经元和胶质细胞网络，其功能上控制着……

本实验的总体目标是从成年小鼠肠肌间神经丛中分离出具有正常功能活性的神经元和 CLIA。首先，需用多聚赖氨酸和层粘连蛋白包被无菌的细胞培养表面；第二步，准备用于肠肌间神经丛分离的溶液及手术区域。接下来，去除胃肠道并分离所需肠段，以制备纵行肌肌间神经丛（LMMP）组织。最后一步是依次用胶原酶和胰蛋白酶消化LMMP，随后将细胞接种至预编码的细胞培养表面。最终，可通过膜片钳电生理记录、免疫细胞化学以及单细胞PCR等方法，研究肠神经元、胶质细胞或这两类细胞间相互作用的影响。演示该实验操作的是Trisha Har Smith博士，她是我实验室的博士后研究员，协助她的是我实验室的博士生Joy Gombe。该技术相较于现有技术的主要优势在于，神经元和胶质细胞来源于成年小鼠。这使得所获得的神经元和胶质细胞具有完全的功能性，并且这些细胞有可能来自基因修饰动物。尽管该方法可用于研究神经元的电学特性，但也同样适用于其他方法，如免疫细胞化学、单细胞 PCR 和实时钙成像。开始此操作时，将已处死的小鼠仰卧置于手术台面上。接着，用70%乙醇清洁腹部皮肤。然后用镊子提起皮肤，用剪刀剪开腹腔以暴露内脏消化器官。之后，提起一段回肠以暴露肠系膜。取出胃肠道，用剪刀剪开肠系膜。然后轻柔地分离并展开回肠和结肠。在完全展开整段肠道后，注意不要牵拉回肠和结肠上的肠系膜。通过在胃远端和盲肠近端处切断肠道，移除回肠。此操作也可通过移除从盲肠远端至肛门近端的结肠组织来完成。接下来将回肠切成三个或更多较大的片段。轻轻将克雷布斯液（Krebs solution）通过肠段，直至所有粪便物质被清除至单独的废液容器中。将清洁后的肠段放入标记为“清洁”的克雷布斯液容器中，并重复上述操作，直至整个回肠清洁完毕。为去除纵行肌肌间神经丛（LMMP），将回肠切成2至4厘米长的小段。随后，将一段回肠放置在塑料或玻璃棒上。回肠应贴合紧密，但不可过松或过紧。用拇指轻轻将肠管固定在棒上，以防止胃肠道绕棒旋转。然后用镊子轻轻去除仍附着在胃肠道上的肠系膜组织。接着，将纵行肌肌层（LMMP）与下方的环形肌分离，方法是先用镊子边缘从肠段顶端到底端，沿肠系膜原先附着的整条线轻轻摩擦。随后，轻柔地在纵行肌层上制造一个小间隙。然后，从间隙顶端开始，用沾有石蜡油的棉签沿水平方向以最轻的力度轻轻剥离纵行肌，施加极轻微的压力，直至纵行肌刚开始与环形肌分离为止。沿肠系膜附着缘全程重复此操作。接着，从上至下再返回，轻柔地沿消化道管壁操作。随着纵行肌层逐渐与环行肌层完全分离，环绕管壁一周后，LMMP 组织将自然地从残留的消化道管壁上脱离下来。然后将得到的纵行肌薄条放入标记为LMMP的烧杯中，并对本步骤中的所有节段重复上述操作。将LMMP节段转移至消化液中。随后用剪刀将LMMP剪成微小碎片。接下来，在37°C水浴中加入摇床并用碳氧混合气（carbogen）轻轻吹泡

an-vitro-preparation-isolated-enteric-neurons-glia-from-myenteric

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科研

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神经科学

一个<em在体外</em从成年小鼠的肌间神经丛制备隔离肠道神经元和神经胶质

本文介绍了一种从脊髓中分离小鼠胚胎运动神经元的替代方法。该方法基于以下原理：凝集素能够与低亲和力神经生长因子受体p75NTR结合。这种基于凝集素的预铺板技术可实现与针对p75NTR的特异性抗体相似的纯化效果。...

基于凝集素的小鼠胚胎运动神经元的分离与培养

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本视频演示了一种在单根神经纤维上进行电生理记录的实验方案 体外 小鼠结直肠-神经制备...

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从小鼠成年肠道黏膜下层和固有层中分离肠胶质细胞

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小鼠胚胎神经干细胞的分离与培养

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从小鼠中枢神经系统多个区域分离和提取胶质细胞

本方案介绍了一种从胚胎第17天小鼠脑组织中制备中枢神经系统细胞培养物的独特方法，适用于神经（免疫）学研究。该模型可通过多种实验技术进行分析，包括实时荧光定量PCR（RT-qPCR）、显微镜检查、酶联免疫吸附测定（ELISA）和流式细胞术。...

建立来自小鼠胚胎脑组织的神经元与胶质细胞混合培养体系以研究感染与先天免疫

本方案概述了从成年小鼠脊髓中分离纯化星形胶质细胞和小胶质细胞的方法，可用于后续的RNA分析和细胞培养等应用。方案包括详细的细胞解离方法及操作步骤，旨在提高分离细胞的质量和得率。...

从成年小鼠脊髓中分离纯化的星形胶质细胞和小胶质细胞 体外 检测与转录组学研究

了解从成年小鼠肌间神经丛分离肠道神经元和神经胶质的方法。该技术结合酶消化与细胞培养，可用于电生理学和免疫组织化学研究，为探索肠神经系统功能提供可靠模型。

一个体外成年小鼠肌间神经丛分离肠神经元和胶质细胞的制备

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