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该程序的总体目标是从成年小鼠肌间神经丛中分离功能可行的神经元和 CLIA。这是通过首先用聚赖氨酸和层粘连蛋白包被无菌细胞培养表面来实现的。第二步是准备溶液和手术区域进行肌间神经丛分离。

接下来，去除胃肠道并分离所需的切片以创建纵向肌肉肌间神经丛准备。最后一步是在胶原酶和胰蛋白酶中依次消化 LMMP，然后将细胞接种在预编码的细胞培养表面上。最终，电生理学、免疫细胞化学和单细胞 PCR 可用于研究肠道神经元、神经胶质细胞或这两种细胞类型之间的相互作用的影响。

演示该程序的是所有实验室的博士后研究员 Trisha Har Smith 博士，协助她的是所有实验室的博士生 Joy Gombe。与现有技术相比，该技术的主要优点是神经元和神经胶质细胞来自成年小鼠。这允许功能齐全的神经元和神经胶质细胞，它们可能来自转基因动物。

虽然这种方法可以深入了解神经元的电特性。它还可以应用于其他方法，例如免疫细胞化学、单细胞 PCR 和实时钙成像。通过将安乐死的小鼠置于手术表面的背卧中来开始此过程。

接下来，用 70% 乙醇清洁腹部皮肤。然后用一把镊子提起，用剪刀打开腹腔，露出内部消化器官。之后，提起一段回肠以露出中间膜。

去除胃肠道，用剪刀剪断肠系膜。然后轻轻地取出并解开回肠和结肠。小心不要在全长肠解开后将肠系膜从回肠和结肠中拉出。

通过切开胃远端和盲肠近端的肠道来切除回肠。该程序也可以通过从盲肠远端到肛门近端切除结肠来对结肠组织进行。接下来将回肠切成三个或更多大块。

轻轻地将 kreb 溶液擦过肠道切片，直到所有粪便都被清除到单独的废物容器中。将清洁切片放入标有 clean 的 Krebs 容器中，并重复这些程序，直到清洁整个回肠。要移除 LMMP，请将回肠切成 2 到 4 厘米的小段。

然后，将一段回肠放在塑料或玻璃棒上。回肠应紧贴，但不能松动或拉紧。用拇指轻轻地将管子固定到杆上，防止胃肠道围绕杆旋转。

然后用镊子轻轻去除仍附着在胃肠道上的肠系膜碎片。之后，将 LMMP 与下面的圆形肌肉分开。首先沿着从上到下连接肠系膜的整条线轻轻摩擦镊子的边缘。

随后，轻轻地在纵向肌上形成一个间隙。然后用棉签轻轻梳理纵肌，从间隙顶部开始，使用最轻的水平笔触，同时施加非常轻的压力，直到纵肌开始与圆形肌分离。沿着 mesentary 连接点沿整个条带执行此作。

接下来，从上到下再向后轻轻地绕过 GI 管。随着纵肌一直围绕管子与圆形肌缓慢分离。完成后，LMMP 会自然地从剩余的 GI 管中脱落。

然后将所得的纵向肌肉薄条放入标有 LMMP 的烧杯中，并在此过程中对所有段重复这些程序。将 LMMP 片段的冲洗液放入消化液中。然后用剪刀将 LMMP 剪成小块。

接下来，将它们消化 60 分钟。在 37 摄氏度的水浴中，用摇摇杯轻轻鼓泡。消化完成后，在离心机中以 356 Gs 离心 8 分钟，冷却至 4 摄氏度，收集细胞。

同时，在细胞培养罩中加入 1 毫升加热的 0.25% 胰蛋白酶和 4 毫升加热的 HBSS 到无菌 50 毫升细胞培养管中，制备 0.05% 胰蛋白酶溶液。离心后，弃去上清液，小心去除细胞沉淀，并将其放入装有 5 毫升 0.05%tryin 溶液的干净试管中。接下来，在 37 摄氏度水浴中用 0.05% tryin 溶液振荡消化细胞 7 分钟，然后用 10 ml 冷冲洗培养基中和试用素。

tripsin 处理 7 分钟后，然后以 356 gs 离心细胞 8 分钟。同时，将灭菌的 TX 网片的平衡部分放在无菌的 15 毫升细胞培养管上。离心后，弃去上清液，轻轻重悬细胞混合物，以 3 mL 为单位触发细胞混合物。

完整的 neuron media。所有改变都应非常温和地进行为避免产生气泡，然后通过 NYX 网将细胞溶液过滤到 15 毫升干净的细胞培养管中。以 356 g 的离心速度离心 8 分钟，收集细胞。

之后，取出并丢弃上清液。将细胞重新悬浮在 1200 μL 完全神经元培养基中。接下来，使用 1 毫升塑料移液器吸头轻轻地去除细胞。

小心不要产生气泡，缓慢而轻柔地移液，直到大部分块被打碎，细胞悬浮成液体。现在，将 750 μL 的完整培养基添加到包含预编码玻璃盖玻片的 12 个孔中。然后加入 100 微升额定电池溶液。

将神经元在 37 摄氏度的细胞培养箱中孵育，二氧化碳变化为 5%。每两天服用一半的细胞培养基。神经元在培养一到两天后就可以进行电生理记录。

这里显示的是肠道神经元的免疫组织化学特征。Lea 从小鼠中分离出来。纵向肌肉共聚焦显微镜检查显示小鼠整个回肠山纵向肌肉准备中的神经元特异性 β 3 微管蛋白染色。

这些是从 LMMP 制剂中分离的细胞，其中包含对钙结合呈阳性染色的神经元，并且此处显示的视黄细胞胶质细胞用神经胶质细胞特异性标志物 GFAP 可视化。然而，当省略一抗时，未见染色。这是从小鼠纵肌中分离出来的神经元和神经胶质细胞彼此靠近生长。

共聚焦显微镜图像显示绿色神经元和红色 ggl 很容易彼此相邻生长，并且似乎在体外相互作用。该图显示了电流钳模式下培养的肠道神经元和 CLIA 的电生理学。所有神经元在当前注射时都表现出动作电位。

CLIA 没有动作电位，但在电流注入下确实显示出较大的电势。从小鼠回肠培养的神经元是电生理异质性群体。在电流钳制模式下，向神经元注入 0.09 纳安培的电流会产生动作电位。

A HP 阴性神经元在刺激后立即返回到静息膜电位。而 A HP 阳性神经元在刺激后显示 A HP，其中静息膜电位下降到基线以下，然后慢慢恢复到初始值。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在四个小时内完成。

尝试此程序时，请务必记住尽可能保持玻璃器皿和手术器械清洁。同时轻轻迭代和鼓泡细胞，并在此过程后每两天更换一半的细胞培养基。可以进行电生理学和免疫细胞化学等方法，以回答其他问题，例如肠道中的离子通道如何对药物治疗做出反应，并了解蛋白质在神经元和 lia 中的表达，以及这两种细胞类型的相互作用如何在发展后被各种治疗改变。

这项技术为神经生物学领域的研究人员探索转基因动物肠道神经系统神经病和 g 神经病的基本功能铺平了道路。看完这个视频，你应该对如何从成年小鼠肠道神经系统的 TER 神经丛中分离神经元和神经胶质细胞有一个很好的了解。