Name: 在体内成像方法区分急性和慢性炎症 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: 学习使用化学发光底物鲁米诺和光泽精在小鼠体内进行无创成像，以区分急性与慢性炎症阶段。该方法通过生物发光成像技术实时监测中性粒细胞和巨噬细胞活性，为炎症疾病研究提供重要工具。

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本工作由南希·卢里·马克斯基金会资助。感谢南希·E·科尔博士对稿件的审阅。感谢黄健忠在准备本视频报告过程中的协助。

注意：所有动物实验均在经批准的机构方案和动物护理指南下进行。
1. 试剂与溶液
<ol>
	<li>皮下接种用PMA溶液：将佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯（phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA）溶于DMSO中，配制成5 mg/ml的储存液。将储存液于-20 °C保存。接种前将储存液解冻，并用PBS稀释至PMA浓度为1 mg/ml。</li>
	<li>皮下接种用LPS溶液：将脂多糖（lipopolysaccharide, LPS，来源于Salmonella enterica血清型enteritidis）溶于无菌PBS中，配制成1 mg/ml的溶液，用于皮下接种前使用。</li>
	<li>急性期成像用luminol溶液：将luminol（5-氨基-2,3-二氢-1,4-邻苯二甲酰肼二酮钠盐，sodium salt）溶于无菌生理盐水（0.9% NaCl）中，配制成10 mg/ml的溶液。该溶液可在使用前于-20 °C保存。</li>
	<li>慢性期成像用lucigenin溶液：将lucigenin（双-N-甲基吖啶硝酸盐，bis-N-methylacridinium nitrate）溶于无菌生理盐水中，配制成2.5 mg/ml的溶液。该溶液可在使用前于-20 °C保存。</li>
</ol>
2. 皮下PMA炎症模型
<ol>
	<li>将NCr裸鼠置于含1-2%异氟烷的诱导室中进行麻醉。通过观察动物失去运动反应及呼吸频率保持恒定来确认全身麻醉状态。将动物转移至连接异氟烷混合气体的鼻罩装置中，并维持其处于麻醉状态。</li>
	<li>使用异丙醇擦拭棉片清洁并消毒左侧 flank 区域的注射部位。</li>
	<li>采用无菌操作技术，将50 μl PMA接种液（含50 μg PMA）注射至左侧 flank 的皮下空间。使用异丙醇棉片吸除注射部位多余的液体。避免使用镇痛药物，因其可能影响炎症反应。</li>
	<li>将动物放回饲养笼，并密切监测其从麻醉中恢复的情况。为协助恢复，可使用加热垫保持动物体温。</li>
</ol>
3. 皮下LPS炎症模型
<ol>
	<li>在诱导室中使用1-2%异氟烷麻醉C57BL/6J小鼠。确认小鼠进入全身麻醉状态后，将其转移至提供异氟烷气体的鼻罩装置，并维持麻醉状态。</li>
	<li>使用异丙醇擦拭棉片清洁左足垫的注射部位。</li>
	<li>采用无菌操作技术，将50 μl LPS接种液（含50 μg LPS）注射至左足垫。使用异丙醇棉片吸除注射部位多余液体。避免使用镇痛药，因其可能影响炎症反应。</li>
	<li>将动物放回饲养笼，并密切监测其从麻醉中恢复的情况。在恢复期间使用加热垫以保持动物体温。</li>
</ol>
4. 炎症的生物发光成像
<ol>
	<li>使用含1-2%异氟烷混合气体的诱导室对动物进行麻醉。通过观察动物失去运动反应及呼吸频率保持恒定来确认全身麻醉状态。</li>
	<li>在动物仍处于麻醉状态下，分别通过腹腔注射（i.p.）给予鲁米诺溶液（10 mg/ml）或卢西格宁溶液（2.5 mg/ml），用于急性或慢性炎症成像。鲁米诺的最终剂量为100 mg/kg，卢西格宁为25 mg/kg。为避免某些小鼠品系可能出现的毒性，可使用较低剂量的卢西格宁（10–15 mg/kg）。毒性表现包括呼吸急促和呼吸困难。C57BL/6J品系对卢西格宁的耐受性低于NCr裸鼠品系。</li>
	<li>将动物转移至生物发光成像系统的成像室中。</li>
	<li>以每分钟一次的频率进行连续生物发光成像。每次成像参数设置为：采集时间1分钟，光圈f/stop = 1，binning = 16，延迟时间为0秒。</li>
	<li>在图像采集面板中，为实现多步连续成像，请点击序列设置按钮。在采集配置中设置足够的成像步骤，以确定最大发光信号输出（通常15个一分钟步骤即可）。15分钟的成像过程可为底物吸收和全身循环提供充足时间。</li>
	<li>成像结束后，将动物从成像室中取出并放回饲养笼。为促进其恢复，可使用加热垫保持动物体温。</li>
	<li>在采集后分析过程中，使用成像软件通过标准化的兴趣区域（ROI）计算峰值总生物发光信号。图像以辐射通量表示，单位为光子数/秒/cm2/sr，并标示最小和最大阈值。定量数据以每个ROI每秒的总光子通量（total flux）表示。</li>
</ol>

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<li>Lu, Y. C., Yeh, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LPS%2FTLR4+signal+transduction+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">LPS/TLR4 signal transduction pathway.</a> Cytokine. 42, 145-151 (2008).</li>
<li>Aitken, R. J., Buckingham, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+and+human+spermatozoa%3A+analysis+of+the+cellular+mechanisms+involved+in+luminol-+and+lucigenin-dependent+chemiluminescence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species and human spermatozoa: analysis of the cellular mechanisms involved in luminol- and lucigenin-dependent chemiluminescence.</a> J. Cell. Physiol. 151, 466-477 (1992).</li>
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<li>Zhang, N., Francis, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+detection+of+myeloperoxidase+activity+in+deep+tissues+through+luminescent+excitation+of+near-infrared+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Enhanced detection of myeloperoxidase activity in deep tissues through luminescent excitation of near-infrared nanoparticles.</a> Nat Med. , (2013).</li>
</ol>

作者声明本研究不存在利益冲突。

在本报告中，我们展示了一种用于活体动物炎症无创成像的生物发光方法。该方法利用两种发光底物——鲁米诺（luminol）和卢西格宁（lucigenin），可区分炎症的不同阶段。鲁米诺生物发光与炎症急性期中的中性粒细胞相关，而卢西格宁生物发光则由慢性期的巨噬细胞介导。鲁米诺相对分子量较小（分子量 = 177.16 g/mol）且不带电荷，能够轻易穿透血浆膜和吞噬体膜25-29。此外，鲁米诺发光对中性粒细胞内髓过氧化物酶（MPO）的活性具有特异性9。另一方面，由于卢西格宁分子较大（分子量 = 510.5 g/mol）并带有两个正电荷，其通常难以穿过细胞膜25, 27-30。
中性粒细胞和巨噬细胞在不同的亚细胞位置组装 Phox 全酶。尽管两种试剂均依赖 Phox 产生超氧阴离子（O2·-），但它们在细胞通透性和髓过氧化物酶（MPO）依赖性方面的差异，使得这些底物能够在疾病模型中区分不同类型的炎症性吞噬细胞。中性粒细胞在其胞内囊泡（吞噬体）膜上表达大部分 Phox 酶14<...

炎症是一种高度调控的生物学反应，参与多种人类疾病的发生发展，包括微生物感染1、伤口愈合2、糖尿病3、癌症4、心血管5、神经退行性6以及自身免疫性疾病7。组织炎症需要多种免疫细胞之间的协调作用，以实现病原体清除、组织修复和疾病消退。中性粒细胞和巨噬细胞是介导组织炎症的关键免疫细胞。在炎症的急性期，中性粒细胞是应对各种有害刺激和组织损伤的首批响应者8。中性粒细胞迅速从血液循环中渗出并迁移至损伤部位，在此处通过释放抗菌颗粒和吞噬作用使入侵的微生物失活。在吞噬过程中，中性粒细胞将入侵的微生物摄入吞噬体，并在吞噬体内产生大量超氧阴离子（O2·-）。吞噬体内的超氧阴离子是多种下游活性氧（ROS）的主要来源。例如，超氧阴离子可通过自发歧化或超氧化物歧化酶（SOD）的作用转化为过氧化氢（H2O2）9,10。在中性粒细胞中，髓过氧化物酶（MPO）进一步将过氧化氢转化为具有抗菌作用的次氯酸（HOCl）11。随着炎症反应的持续，循环中的单核细胞逐渐迁移至损伤部位，并分化为成熟的巨噬细胞2，其吞噬功能有助于清除失活的病原体和细胞碎片。此外，作为炎症后期的关键调节细胞，巨噬细胞通过产生抗炎性细胞因子12以及在较低水平上生成细胞外活性氧9，促进组织修复。此阶段产生的活性氧可调控组织重塑、新生血管形成以及再上皮化过程13。
吞噬细胞NADPH氧化酶（Phox）是中性粒细胞和巨噬细胞中产生超氧阴离子的主要来源9。Phox是一种多亚基复合物，其组装受到严格调控9。全酶包含多个胞质调节亚基（p67phox、p47phox、p40phox和RAC）以及一个膜结合的异源二聚体细胞色素b558（由CYBA和CYBB亚基组成）。细胞色素b558是反应的核心，其中CYBB亚基（也称为p91phox和NOX2）负责执行主要的氧化还原链式反应9。有趣的是，该复合物在中性粒细胞和巨噬细胞中的组装位点有所不同。在静息状态的中性粒细胞中，细胞色素b558主要存在于细胞内储存颗粒的膜上14。在吞噬过程中，中性粒细胞在吞噬体上组装全酶9，该部位也存在高水平的髓过氧化物酶（MPO）活性。中性粒细胞Phox迅速消耗氧气，并通过活性氧（ROS）的产生发挥其杀菌作用，这一现象被称为呼吸爆发11。相比之下，巨噬细胞中MPO的表达水平较低，细胞色素b558主要定位于质膜15, 16。因此，中性粒细胞产生大量超氧阴离子以发挥抗微生物功能，而巨噬细胞则产生较少的超氧阴离子，主要用于调节功能15。
由于炎症是一个复杂的体内过程，针对炎症不同阶段的非侵入性成像方法将有助于对疾病模型进行定量和纵向评估。通过机制研究，我们此前已证明两种化学发光试剂——鲁米诺（5-氨基-2,3-二氢-1,4-邻苯二甲酰肼二酮）和卢西格宁（双-N-甲基吖啶硝酸盐）——可分别用于急性期和晚期（慢性）炎症的非侵入性成像17。鲁米诺可用于可视化炎症急性期中中性粒细胞髓过氧化物酶（MPO）的活性18-20，而卢西格宁生物发光则可用于评估与炎症晚期或慢性炎症相关的巨噬细胞活性17。在本研究中，我们采用两种实验性炎症模型（皮下注射PMA和皮下注射LPS）来展示这些成像技术。

<table><tbody><tr><td>佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯（PMA）</td><td>Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO</td><td>P8139</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>来自&lt;em&gt;Salmonella enterica&lt;/em&gt;血清型肠炎沙门氏菌的脂多糖</td><td>Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO</td><td>L2012</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>鲁米诺（5-氨基-2,3-二氢-1,4-邻苯二甲酰肼，钠盐）</td><td>Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO</td><td>A4685</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>卢西格宁（双-N-甲基吖啶硝酸盐）</td><td>Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO</td><td>M8010</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>配备Living Imaging 4.2软件包的IVIS Spectrum成像系统</td><td>Caliper LS/Perkin Elmer, Hopkinton, MA</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

体内成像方法区分急性与慢性炎症

In vivo Imaging Method to Distinguish Acute and Chronic Inflammation

炎症是许多人类疾病的基本特征。在本视频报告中，我们展示了非侵入性生物发光成像技术，可用于区分小鼠模型中的急性与慢性炎症。当组织受损或病原体入侵时，中性粒细胞作为第一道防线，在介导急性炎症反应中发挥重要作用。随着炎症反应的进展，循环中的单核细胞逐渐迁移至损伤部位，并分化为成熟的巨噬细胞，通过清除组织碎片和分泌抗炎性细胞因子来介导慢性炎症并促进组织修复。腹腔注射鲁米诺（luminol，5-氨基-2,3-二氢-1,4-邻苯二甲酰肼二酮钠盐）可实现对主要由组织浸润性中性粒细胞介导的急性炎症的检测。鲁米诺特异性地与中性粒细胞吞噬体内部产生的超氧阴离子发生反应，其生物发光依赖于髓过氧化物酶（MPO）介导的反应。氯化氰胺（lucigenin，双-N-甲基吖啶硝酸盐）也能与超氧阴离子反应产生生物发光。然而，氯化氰胺的生物发光不依赖于MPO，而是仅依赖于慢性炎症期间巨噬细胞中的吞噬细胞NADPH氧化酶（Phox）。因此，鲁米诺与氯化氰胺联合使用，可实现对急性和慢性炎症不同阶段中多种吞噬细胞群体的非侵入性可视化及纵向评估。鉴于炎症在多种人类疾病中具有重要作用，我们认为这种非侵入性成像方法有助于研究中性粒细胞与巨噬细胞在多种病理状态下的不同作用。

我们进行了纵向生物发光成像，以评估实验性炎症模型中的急性和慢性炎症。佛波醇-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯（PMA）是一种强效的蛋白激酶C（PKC）激动剂，可激活Phox以产生活性氧超氧阴离子，并引发强烈的急性炎症反应21。在NCr裸鼠皮下注射50 mg PMA后，注射部位迅速出现皮肤刺激和急性炎症18, 22, 23。我们连续4天每日进行成像，首次成像在PMA注射后3小时即开始。图1展示了使用luminol和lucigenin作为底物的纵向生物发光成像结果。在炎症早期（3小时），我们观察到显著的luminol生物发光信号，表明PMA注射部位中性粒细胞髓过氧化物酶（MPO）活性较高。在炎症早期阶段未观察到明显的lucigenin生物发光信号。从第2天开始，出现结痂现象，因此发光强度降低。随着伤口愈合过程逐渐明显（图1A，第3天和第4天），我们观察到lucigenin生物发光信号持续增强（图1B）。这些结果表明，luminol生物发光与炎症的急性期相关，而lucigenin生物发光则与炎症后期的组...

我们描述了一种用于区分炎症阶段的非侵入性成像方法。全身递送的鲁米诺可显示依赖于中性粒细胞中髓过氧化物酶（MPO）活性的急性炎症区域。相比之下，注入的双甲酰胺（lucigenin）则可实现对依赖于巨噬细胞中NADPH氧化酶（Phox）活性的慢性炎症的可视化成像。

炎症是许多人类疾病的基本特征。在本视频报告中，我们展示了非侵入性生物发光成像技术，该技术可……

本实验的总体目标是在活体小鼠中直观区分急性与慢性炎症。通过皮下注射四种物质——ball 12 me state、13 乙酸或 PMA，以诱发强烈的急性炎症反应。随后，通过腹腔注射化学发光底物 luminol 或 lucigen，从而在炎症部位诱导产生光信号。鲁米诺发光表明急性炎症。而卢西根发光则揭示晚期或慢性炎症区域，随后将动物放入生物发光成像仪中，以可视化化学发光底物在炎症部位产生的发光信号。接着进行连续的成像步骤，以捕获最大发光强度，用于定量分析，并在不同时间点重复成像过程，以追踪不同的炎症反应。最终，纵向成像结果表明，根据两种发光底物的发射动力学，炎症反应存在差异。鉴于炎症在多种人类疾病中的重要作用，我们相信这种非侵入性成像方法有助于研究中性粒细胞和巨噬细胞在多种病理条件下的不同作用。本次实验操作将由Mrs.塔尼娅·托珀（Tanya Topper）以及实验室的成像技术。按照文本方案中的描述，首先准备试剂和溶液，对NCR裸鼠进行麻醉，并通过观察其运动消失和呼吸频率恒定来确认全身麻醉状态。将动物转移至提供异氟烷混合气体的鼻罩，以维持麻醉状态。使用异丙醇擦拭棉片清洁并消毒左侧 flank 部位的注射位点。采用无菌技术，将 50 µL PMA 接种液注射至皮下组织。注射部位为左侧 flank。使用异丙醇棉片去除注射部位多余的液体。将动物放回饲养笼中，并密切监测其从麻醉状态中的恢复情况。为辅助恢复，在动物麻醉后可使用加热垫以保持其体温。 同前，准备进行腹腔注射，急性炎症成像使用每毫升10毫克的鲁米诺溶液，慢性炎症成像使用每毫升2.5毫克的卢西根溶液。最终剂量为鲁米诺每千克体重100毫克，卢西根每千克体重25毫克。对于卢西根，可使用较低剂量以避免潜在的毒性。对于某些小鼠品系，将动物转移至生物发光成像系统的成像室中。以每分钟一次的频率进行连续生物发光成像，每次成像的采集时间为一分钟。光圈值设为1，二乘二合并设为16，延迟时间为0秒。在图像采集面板中，点击序列设置按钮以启用顺序多步成像。在采集方案中设置15个成像步骤，每个步骤持续1分钟，以确定最大发光强度输出。15 分钟的成像过程可为底物吸收和全身循环提供充足的时间。图像采集完成后，将动物从成像室转移至饲养笼中。为协助动物恢复，可使用加热垫以保持其体温。在采集后分析过程中，使用成像软件通过标准化的感兴趣区域（ROI）计算峰值总生物发光信号。图像以辐射值呈现，并标示最小和最大阈值。定量数据以每秒光子数（photons per second）的总通量表示。佛波醇-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯（PMA）是一种强效的蛋白激酶C激动剂，可激活中性粒细胞产生超氧阴离子，并引发强烈的急性炎症反应。在NCR裸鼠中皮下注射PMA后，注射部位迅速出现皮肤刺激和急性炎症。这些图像展示了炎症早期阶段使用鲁米诺（luminol）和荧光素（lu

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科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

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