利用共聚焦光片显微镜对整只小鼠大脑进行微米级分辨率光学断层成像

本实验的总体目标是以微米级分辨率重建并可视化完整的小鼠大脑。首先，对固定的小鼠大脑进行脱水处理，并将其整合到四面体系列中；第二步是使用苯甲醚对样品进行透明化处理。

接下来，使用共聚焦光片显微镜对大脑进行成像。最后一步是使用软件对获取的图像堆栈进行对齐和拼接。最终，可以利用多分辨率可视化工具浏览重建的图像体积。

该技术相较于共聚焦或光学显微镜等其他方法的主要优势在于，仅需数天即可完成对小鼠全脑体积的成像。该方法有助于解答神经科学领域中的关键问题，例如不同类型神经元在整个大脑中的分布情况。这种金属帽是否为脑自主性中的精细结构提供了新的见解？

该方法也可应用于小鼠胚胎或果蝇足部，表明该操作流程具有可重复性。本方案由我实验室的一名研究生完成。开始本实验前，需通过心脏灌流法对小鼠脑组织进行标准固定处理，随后在脱水与透明化步骤前进行过夜后固定。

随后，由于脱水溶剂四氢呋喃（THF）会强烈淬灭XFP荧光，需通过色谱柱使用碱性活化氧化铝过滤以去除过氧化物，并避免色谱柱破裂，否则会降低过氧化物的去除效率。即使THF在过滤前已含有稳定剂，该稳定剂也会被氧化铝保留。需要注意的是，不含稳定剂的THF可能会生成大量过氧化物，具有爆炸性和危险性。

接下来，用纯水中的一系列THF对整只小鼠脑进行脱水。然后将装有样品的瓶子置于旋转轮上，以避免光照。用铝箔包裹瓶子。

最后，使用过滤漏斗和氧化铝过滤清除溶剂。然后将样品置于100% DBE中进行透明处理，分别在3小时和6小时后更换溶液，直至脑组织呈现透明状态。通常在第二次更换DBE溶液1小时后，采用此处所示方法之一将其固定于倾斜的成像板上。

通过琼脂糖圆盘直接安装，或经由琼脂糖扬声器进行直接安装时，应轻柔地将样品浸入其中一个尖端，以使用琼脂糖圆盘浸入法。该圆盘由6%琼脂糖凝胶制成，覆盖在尖端上。然后用丙烯酸胶水将样品轻轻固定在琼脂糖圆盘上，并静置约一分钟，待胶水固化后完成安装。

使用agros烧杯浸入法，将含有3% agros凝胶的烧杯浸至尖端。然后将样品轻轻放置在烧杯底部。采用上述方法固定样品后，用镊子将成像板放入样品室中。

然后用透明溶液充满腔室。接下来，准备进行断层扫描。首先移除狭缝以尽可能收集荧光信号，然后用低激光功率照射样本。

为防止光漂白，使用软件驱动的微定位系统在 x、y 和 z 三个方向上移动样品。针对每个方向，确定样品在相机视场范围内被照明时的最小和最大坐标。然后将确定的坐标作为参数输入至预断层扫描子程序中。

同时指定在断层扫描及Z方向预扫描采样步骤中相邻堆栈之间的距离。最后，启动预断层扫描，该过程将按照前一步骤中设定的Z方向采样参数，采集每个堆栈中的图像。开始采集前，首先使用微定位系统将样品移出光片范围。

然后增加激光功率，并停止所有扫描系统的运动，以便仅照亮视野中心的一条固定线。接下来，安装狭缝并利用透明溶液产生的自发荧光信号进行对准。此时应在视野中心清晰地看到狭缝线。

现在重新激活扫描系统。降低激光功率，并使用微定位系统将样品移入光片内。注意，使用狭缝时的激光功率将高于不使用狭缝时的功率。

由于空间滤波器会阻挡不可忽略的光通量，需使用控制软件调节扫描和d扫描系统的振幅和偏移，直至图像清晰明亮。然后为实验设置合适的Z轴步长，并运行断层扫描采集软件。样品的三维体积将被成像为多个平行且部分重叠的图像栈，并以分层的文件夹结构保存图像。

为了使拼接软件能够处理完整的立方体体积数据，需使用合成的黑色图像补全所获取的体积数据。这些合成图像应与采集图像具有相同的类型和尺寸，但像素强度为零，可通过自动化软件生成。接着，启动已安装插件 VA A 3D、Terra、Stitcher 和 tarly 的软件，并加载 Terra Stitcher 插件。选择包含成像体积数据的目录，并指明各轴相对于参考右手坐标系的相对方向以及体素尺寸。

现在启动拼接的第一部分。软件将计算各图像堆栈对之间的相对位移，并为所有堆栈共同找到一个整体最优的排列位置，可选择以单分辨率或多分辨率格式保存拼接后的体积数据。该阶梯结构可支持使用 tarly 插件进行多分辨率可视化。

在这两种情况下，如果高分辨率图像大于几吉字节，还需选择多栈保存模式，并指定各个子栈的大小，以便实现对存储数据的高效访问。现在启动拼接的第二部分。

该软件将合并对齐的图像序列，并以单序列或多序列模式保存。完成后，关闭 Terra Stitcher 插件。接下来，加载 terra fly 插件。

选择包含多层多分辨率体积数据的文件夹，并指定孔洞尺寸和轴向方向。体积数据将以最低分辨率加载。如需放大至更高分辨率，只需使用鼠标滚轮即可。

此外，也可以双击图像上的特定位置，或选择围绕已有的解剖标志进行放大，或直接指定感兴趣区域的坐标。如需返回低分辨率视图，只需使用鼠标滚轮即可。该所述方案可用于对完整的小鼠大脑或切除的脑组织部分进行微米级分辨率的三维重建，且无需进行物理切片。

作为代表性结果，此处展示了出生后第10天的L七GFP小鼠的完整小脑。所有浦肯野细胞神经元均用EGFP标记。进一步放大后，可观察到小脑皮层典型的层状结构，继续放大则可清晰区分每个浦肯野细胞的胞体。

因此，该描述的方案可用于在各种神经发育研究中筛选神经元的空间组织。作为第二个代表性结果，此处我们可以看到来自成年大腿的UN切片脑组织的图像，该样本来自一只GFPM小鼠。在这种转基因动物中，EGFP在少数随机分布的神经元亚群中表达。

此处显示的是大脑的右半部分。随着我们不断放大，神经元的突起结构变得可分辨。该结果表明，所描述的实验方案能够在整个成年小鼠大脑中实现微米级分辨率的成像，从而为在细胞分辨率下研究全脑解剖结构提供了可能。

在神经退行性疾病的动物模型中，一旦掌握该技术，若操作得当，可在三到四天内完成。在进行该操作时，重要的是要记住，必须对脱水和清洗溶液进行适当过滤，以保持 GFP 荧光。本文介绍的多分辨率可视化工具也可用于分析通过其他技术（如显微光学切片断层成像）获得的非常大的数据集。

观看本视频后，您应能够充分掌握如何对固定的小鼠脑组织进行染色、评级和透明化处理，使用共聚焦层光显微镜成像，并通过搭载 Tely 插件的虚拟现实 3D 技术对重建的体积图像进行可视化观察。