基于聚合物微球和光纤束的人类唾液蛋白质多重荧光微阵列分析

本实验的总体目标是利用基于微球的荧光阵列分析人唾液样本中的多种蛋白质。首先，使用不同比例的两种荧光染料对微球进行编码。然后将针对不同蛋白质的捕获抗体偶联到已编码的微球上。

然后利用已组装的微阵列上的夹心免疫测定法，在光纤束上构建多重蛋白质微阵列，用于检测唾液样本中的多种蛋白质。最终通过荧光显微镜分析，可测量唾液样本中不同蛋白质的信号响应。该技术相较于ELISA等现有方法的主要优势在于，能够对复杂生物流体中的多种蛋白质进行同步分析。

尽管该方法可用于分析人类唾液，也可应用于其他生物流体，如血清、尿液和痰液。在琥珀色玻璃小瓶中称取刚果红TTA，用四氢呋喃配制200毫摩尔的储备溶液。用移液器轻轻混匀，并通过目视确认染料已完全溶解。

同样，通过移液轻轻混合，配制12毫摩尔的香豆素30储备液。肉眼观察确认D完全溶解后，将微球悬浮液涡旋混匀，然后转移60微升至1.5毫升微量离心管中。洗涤微球时，加入600微升PBS，通过移液混合20次，然后在10,000 RPM下离心3分钟。

用四氢呋喃溶液洗涤三次后，弃去上清液，将沉淀物重悬于600 µL工作液中，并将混合液转移至新的1.5 mL微量离心管中。用封口膜密封微量离心管，并置于摇床上，用铝箔包裹以避光。

向一个安全锁扣式1.5毫升微量离心管中加入200微升编码微球悬浮液。逐滴加入150微升新配制的EDC溶液，随后立即加入150微升磺基NHS溶液。用移液器充分混匀，并确认悬浮液均匀一致。

盖上管盖，用多聚甲醛密封，并将其置于摇床上。用铝箔包裹以避光。经过三次 P-B-S-S-D-S 缓冲液重复洗涤后，将沉淀重悬于 200 微升的 P-B-S-S-D-S 缓冲液混合液中。

然后将溶液转移至含有60微克捕获抗体的300微升PBS-Tween缓冲液中。将每种类型的蛋白捕获微球各50微升加入一个新的灭菌微量离心管中。以7,000转/分钟离心储备微球混合液3分钟，弃去上清液，仅保留100微升。

现在将光纤束手工切割至约五厘米长，使用金刚石研磨膜依次抛光两端。然后将抛光后的光纤束在去离子水中超声处理两分钟。为去除任何颗粒，将一个小的磁力搅拌子放入0.5毫升微量离心管中。

加入 400 µL 无蛋白的 PBS 缓冲液，在磁力搅拌器上搅拌 30 分钟。为去除气泡，将抛光后的光纤束一端浸入 0.025 N 盐酸溶液中刻蚀 150 秒。随后立即将刻蚀后的 N 浸入去离子水中超声处理 1 分钟。

然后用压缩空气干燥光纤束，将光纤束安装在光纤支架上，并将刻蚀端浸入无气泡、无蛋白的 PBS 缓冲液中孵育一小时。取一微升储存的微球悬浮液，滴加到光纤束的刻蚀端。用包裹铝箔的盒子将装置遮光保护。15 分钟后，由于蒸发作用，悬浮液体积减少，从而迫使微球进入刻蚀形成的微孔中。

使用浸有样品溶液的拭子去除未被捕获在微孔中的微球。为使蛋白质微阵列准备好使用，将200微升样品溶液加入0.5毫升高压灭菌的微量离心管中。将装载在光纤上的蛋白质微阵列浸入该溶液中，并置于摇床上。

用铝箔覆盖以避光。接着，将蛋白质微阵列浸入含有 200 µL 洗涤缓冲液的新的 autoclave 微量离心管中，在 600 RPM 条件下振荡 2 分钟。随后，将微阵列在 100 µL 检测抗体混合液中孵育 30 分钟，该混合液包含生物素标记的检测抗体和 A PBS 封闭缓冲液。

在避光的室温条件下，使用浸透无水乙醇的棉签清洁光纤束的远端。然后用压缩空气吹干光纤的两端，将光纤安装到落射荧光显微镜上，通过光纤的远端进行成像，获取对应于鸦片TTAC 30和SAP荧光发射强度的微球图像。此处展示了七种微球类型的编码图像。

在 UTTA 编码图像中观察到两个强度水平，分别代表用不同量 UTTA 染料编码的微球。在 C 30 编码图像中也观察到类似结果。通过 MATLAB 图像分析，可计算信号图像中不同微球的荧光强度。解码结果如图 2D 所示。

成功解码了不同的微球。微球在与检测缓冲液孵育时无响应。当与人唾液样本孵育时，观察到显著的荧光响应。

为了便于比较，这两张图的对比度已调整至相同水平。掌握该方法后，即可对人唾液样本中的不同蛋白质进行可重复的分析。图中展示了同一样本三次独立检测的结果。

观看本视频后，您应能充分了解如何制备基于微球的多重蛋白微阵列，并将其用于复杂生物流体的分析。遵循本实验方案，还可对不同复杂生物流体中的其他蛋白生物标志物进行检测。