复用荧光微阵列人类唾液蛋白质分析用高分子微球和光纤束
October 10th, 2013
我们描述了使用多路复用基于微球的抗体阵列分析唾液蛋白的过程。单克隆抗体共价连接到荧光染料编码的4.5微米聚合物用碳二亚胺化学性微球。修改后的微球沉积在光纤的微孔用荧光夹心免疫测定蛋白水平在唾液。
该程序的总体目标是使用基于微球的荧光阵列分析人唾液样品中的多种蛋白质。首先，用不同量的两种荧光染料编码微球。将不同蛋白质的捕获抗体偶联到编码的微球上。
然后，在组装的微阵列检测试剂盒上使用夹心免疫测定法在光纤束上组装多路蛋白质微阵列，检测测试唾液样品中的多种蛋白质。最终，通过荧光显微镜进行分析可以测量唾液样本中不同蛋白质的信号反应。与 Eliza 等现有方法相比，该技术的主要优势在于它能够同时分析复杂生物流体中的多种蛋白质。
虽然这种方法可以提供对人类唾液分析的见解，但它也可以应用于其他生物流感，例如血清尿液和痰液。在琥珀色玻璃小瓶中称量鸦片 TTA，并在四氢 Furin 中制备 200 毫摩尔的储备溶液。通过移液轻轻混匀，并目视验证染料是否完全溶解。
同样，通过移液轻轻混合，制备 12 毫摩尔香豆素 30 储备溶液。视觉。验证 D 是否完全溶解涡旋至微球悬浮液，然后将 60 微升转移到 1.5 毫升微量离心管中。要洗涤微球，请加入 600 微升 PBS，通过移液 20 次混合，并以 10， 000 RPM 离心 3 分钟。
用 tetra hydro furin 溶液洗涤 3 次后，去除上清液，将上颚重悬于 600 μL 工作溶液中，然后将混合物转移到新的 1.5 mL微量离心管中。用对开膜密封微量离心管，并将其放在摇床上。用铝箔覆盖，避光保护。
将 200 微升编码的微球悬浮液加入安全锁的 1.5 毫升微量离心管中。以滴加方式加入 150 微升，新鲜制备的 EDC 溶液立即加入 150 微升磺胺 NHS 溶液。通过移液充分混合并验证悬浮液是否均匀。
盖上试管，用 paraform 密封，然后将其放在摇床上。用铝箔覆盖，避光保护。将 P-B-S-S-D-S 缓冲液 reus 洗涤 3 次后，将沉淀悬浮在 200 微升 P-B-S-S-D-S 缓冲液混合物 s 中。
然后将溶液转移到 300 微升含有 60 微克捕获抗体的 P-B-S-S-D-S 缓冲液中。将 50 μL 每种类型的蛋白质捕获微球混合到新的高压灭菌微量离心管中。以 7， 000 RPM 的速度离心储备微球池 3 分钟，并去除除 100 μL 以上清液外的所有上清液。
现在，将光纤束手工切割成约 5 厘米长，使用金刚石研磨膜依次抛光两端。然后在去离子水中对抛光的样品束进行超声处理 2 分钟。要去除任何颗粒，请将一个小磁力搅拌棒放入 0.5 毫升微量离心管中。
加入 400 μL 无蛋白 PBS 缓冲液，在磁力搅拌板上搅拌 30 分钟。要去除气泡，请在 0.025 正常氯化氢溶液中蚀刻抛光纤维束的一端 150 秒。立即将刻蚀的 N 浸入去离子水中并超声处理 1 分钟。
然后用压缩空气干燥纤维束，将纤维束安装在纤维支架上，并在无气泡、无蛋白质的 PBS 缓冲液中封闭刻蚀端 1 小时，将储存的微球悬浮液的 1 微升 ALI 四边形沉积在光纤束的蚀刻端。用铝箔包裹的盒子保护装置避光。15 分钟后，悬浮液的体积会因蒸发而减小，并迫使微球进入蚀刻的微孔。
使用浸有样品溶液的棉签去除未被困在微孔中的微球。为了使蛋白质微阵列可供使用，将 200 μL 样品溶液添加到 0.5 mL 高压灭菌器微量离心管中。将载在纤维头上的蛋白质微阵列浸入溶液中，并置于摇床上。
用铝箔覆盖，避光。接下来，将蛋白质微阵列芯片浸入含有 200 μL 洗涤缓冲液的新型高压灭菌微量离心管中，并以 600 RPM 振荡 2 分钟。现在将微阵列芯片在含有生物素化检测抗体和 PBS 封闭缓冲液的 100 μL 检测抗体混合物溶液中孵育 30 分钟。
在室温下避光，用浸有无水乙醇的棉签清洁纤维束的远端。然后用压缩空气干燥纤维的两端，将纤维安装在 epi 荧光显微镜上，并通过纤维的远端成像，获取对应于鸦片 TTAC 30 和 SAP 荧光发射强度的微球图像。此处显示了七种微球类型的编码图像。
在 UTTA 编码图像中观察到两个强度水平，代表用不同数量的 UTTA 芯片编码的微球在 C 30 编码图像中观察到类似的结果。MATLAB 图像分析允许计算信号图像中不同微球的荧光强度。解码结果如图 2D 7 所示。
成功解码不同的微球。当与检测缓冲液一起孵育时，微球没有反应。当与人唾液样品一起孵育时，观察到显著的荧光反应。
为了更好地进行比较，这两个数字中的对比已调整到相同的水平。掌握该方法后，即可对人唾液样本中的不同蛋白质进行可重现的分析。显示了对同一样品进行的三次独立检测的结果。
观看本视频后，您应该对如何制备基于微球的多重蛋白质微射线并将其用于复杂的生物流体分析有很好的了解。遵循此过程。还可以分析不同复杂生物流体中的其他蛋白质生物标志物。
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概述
本文描述了一种使用多重微球基抗体阵列分析唾液蛋白的方法。该方法允许同时分析人类唾液样本中的多种蛋白，增强了传统检测方法的能力。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物技术
- 蛋白质组学
背景
- 唾液含有多种蛋白，可以提供有关健康和疾病的见解。
- 传统方法如ELISA仅限于一次分析一种蛋白。
- 多重检测可以提高效率和数据丰富度。
- 荧光微球技术为蛋白检测提供了一种新颖的方法。
研究目的
- 开发一种同时分析唾液中多种蛋白的方法。
- 提高复杂生物液中蛋白检测的灵敏度和特异性。
- 为现有的单分析物检测提供更有效的替代方案。
所用方法
- 用荧光染料对微球进行编码。
- 将捕获抗体与微球共价连接。
- 在光纤束上组装多重蛋白微阵列。
- 使用荧光夹心免疫分析法检测唾液样本中的蛋白。
主要结果
- 该方法成功检测到唾液样本中的多种蛋白。
- 荧光显微镜为不同蛋白提供了清晰的信号响应。
- 该技术在传统ELISA方法上表现出优势。
- 结果表明在临床诊断中的潜在应用。
结论
- 这种多重方法允许高效分析唾液蛋白。
- 该方法可能有助于更好地理解各种健康状况。
- 未来的研究可能扩展这种技术在其他生物液中的应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Multiplexed protein analysis in complex biofluids like saliva addresses a critical bottleneck in biomarker discovery, where traditional single-plex assays limit throughput and increase sample consumption. This microsphere-based fiber-optic array enables simultaneous quantification of multiple salivary proteins, improving assay efficiency and supporting early-stage target validation in neurodegenerative and inflammatory disease research. By providing quantitative, reproducible readouts from limited clinical samples, the method enhances predictive confidence in lead identification and preclinical de-risking workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by measuring multiple salivary protein biomarkers simultaneously in disease-relevant samples.
- Operational Value: Reduces sample volume requirements and assay timelines through parallel protein detection in a single workflow.
- Predictive Value: Supports biomarker panel development and functional target validation by correlating multi-analyte responses with phenotypic outcomes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, quantitative fluorescence readouts for six proteins using encoded microspheres, enabling reproducible assay performance across runs.
- Operational Value: Facilitates assay standardization via fiber-optic bundle immobilization and automated decoding algorithms, reducing user-dependent variability.
- Scalability: Supports platform reuse for other biofluids (serum, urine, sputum) as noted in the transcript, extending utility beyond saliva.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical workflows by providing clinically relevant salivary protein data that can inform mechanistic models.
- Mechanistic De-risking: Enables pathway-level analysis through multiplexed detection, reducing ambiguity in target engagement and biological response assessments.
- Predictive Confidence: Delivers quantitative, fluorescence-based signal responses that support go/no-go decisions in early preclinical advancement.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target validation through assay development to preclinical mechanistic studies, particularly for biomarker-driven programs in neurology and inflammation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling simultaneous measurement of multiple salivary proteins linked to disease states.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized microsphere encoding, fiber-optic array assembly, and fluorescence-based quantification compatible with high-content imaging.
- Analytics: Provides quantitative dependent variable measurements (fluorescence intensity per microsphere type) that allow comparison across experimental conditions and sample groups.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity via disease-relevant salivary biomarkers that reflect systemic or local pathophysiological processes.
- Enterprise Reuse: Encodes a adaptable microsphere-based platform applicable to multiple complex biofluids, supporting cross-project standardization and reagent sharing.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation through multiplexed, quantitative protein detection in native biofluids.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization via fiber-optic immobilization and algorithmic decoding, reducing technical noise.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by maximizing data yield per sample and enabling reuse across biomarker programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by delivering multi-analyte profiles that inform mechanistic and safety-related decision-making.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsphere encoding, antibody conjugation, and fluorescence microscopy for successful assay setup and optimization.
- Dependent on fluorescence microscopy and MATLAB-based image analysis infrastructure for signal acquisition and decoding.
- Necessitates cross-team standardization of microsphere preparation, fiber-optic handling, and assay protocols to ensure reproducibility across sites.
- Adaptation to other model systems (e.g., serum, urine) requires re-validation of encoding stability and antibody performance in differing matrices.
- Practical limitations include potential microsphere leakage from microwells and signal variability due to incomplete washing or evaporation during array assembly.
