地蒽酚作为傅立叶的基质辅助激光解吸/离子化成像矩阵变换离子回旋共振质谱仪
2013年11月26日
蒽三酚（DT; 1,8 - 二羟基-9,10 - 二氢蒽-9 - 酮）先前已被报道作为MALDI基质为小分子的组织成像;对于使用DT的内源性脂质的对的MALDI成像协议这里所提供的组织切片由正离子的MALDI-MS在一个超高分辨率四极-FTICR仪器表面。
该程序在空间上定位牛晶状体内的多个内源性脂质。采用基质辅助激光解吸电离技术，质谱成像。首先，准备一个薄的牛晶状体组织切片并应用多矩阵，然后获取 maldi 质谱数据集。
将数据集处理成晶状体组织切片上检测到的脂质的可视化表示。这些结果可以共同确定脂类在牛晶状体内的位置和相对丰度，并产生这种分布的可视化表示。与其他方法（如脂质提取后进行 LCMS 分析）相比，maldi 质谱成像可以同时可视化多种脂质，而不会丢失其空间定位。从零下 80 摄氏度的储存中取出速冻组织标本。
从晶状体表面取下胶囊，以固定整个牛犊晶状体切片。将一两滴水滴在低温恒温器的组织切割台上。当低温恒温器平衡至最佳温度时，在镜头凝固之前快速将镜头放入水中。
将组织赤道切成 20 微米厚的切片。丢弃第一个组织切片，仅使用接近赤道平面或添加赤道平面的切片对眼晶状体组织进行成像。加入 1.5 微升甲酸以预润湿 ITO 涂层载玻片的表面。
然后小心地将组织切片转移到低温恒温器内的载玻片上。接下来，在应用 maldi 基质之前，将玻片冻干 15 分钟。使用校正液笔，在 ITO 涂层载玻片的非导电表面上添加三个示教标记。
现在使用平板扫描仪拍摄组织切片的光学图像，并将其保存为适当的格式，例如 TIFF 或 jpeg。首先，用胶带覆盖 ITO 涂层载玻片前表面的边缘，使基质不会覆盖载玻片的边缘。准备要在适当溶剂中使用的基质。
然后将基质溶液涂在组织切片的表面。使用 20 次矩阵涂层循环涂覆载玻片。或者，如果溶剂与电子基质喷雾器不兼容，可以使用气动辅助喷枪喷雾器来喷涂基质。
对于质量校准溶液，将 ES 调谐混合物标准溶液稀释 1 至 200 倍，溶于 60% 异丙醇中每分钟引入 2 微升稀释的 ES 调谐混合物溶液，放入仪器上的双模式电喷雾电离离子源中，进行四次变换离子回旋共振 ms。在正离子 ESI 模式下作 F-T-I-C-R 仪器，具有宽带检测和 1024 KB 的数据采集大小每秒。通常将 ESI 参数设置为 3， 900 伏毛细管电喷雾电压。
喷雾防护罩电压为 3， 600 伏雾化器氮气流量为每分钟 2 升。干燥的氮气流量为每分钟 4 升，温度为 200 摄氏度。还将撇渣器的一个电压设置为 15 伏。
飞行时间 0.01 秒碰撞氩气流 0.4 升/秒，源离子积累时间 0.1 秒，碰撞池离子积累 0.2 秒。现在调整 F-T-I-C-R作参数，以便在质荷比 200 至 1400 的质量范围内最大限度地提高分析灵敏度，同时保持良好的时域自由感应衰减信号。然后采集 ESI 质谱图，并使用 E es 调谐混合溶液中标准化合物的参考质量数校准仪器。
为了调整仪器以进行 MALDI作，将几个 1 微升的混合图灵和 INE 标准溶液等分试样溶解在基质溶液中，每个浓度为 1 微摩尔，然后将这些溶液直接点样到其中一个样品组织切片上。将玻片放入组织载玻片适配器中，并将适配器从 MALDI 侧加载到双 ESI maldi 离子源中。接下来，针对激光功率和每次质量扫描的 MALDI 信号累积的激光发射次数优化适当的 MALDI作参数。
在调整、校准和优化用于 maldi MSI 实验的仪器后，将要成像的组织切片的物理位置与成像软件中记录的光学图像对齐。使用三点三角测量方法对齐三个修正液标记。然后开始同步 ESI MALDI作，使每个质谱都包含 E ES 调谐混合溶液的参考质量峰，用于采集后内部质量校准。
首先通过降低毛细管电压来衰减 ESI 信号，直到 MALDI 信号在谱图中占主导地位，而 ESI 口径信号仍然足够高，可以进行内部质量校准。接下来，为辐射激光设置一个自动提升方法。使用随机点分析。
定义要成像的组织区域并设置适当的激光 RA 步长。使用内部校准校准 MALDI 质谱进行初始比较，并使用自定义 VBA 脚本为 MSMS de isotope 选择峰和单同位素峰，并导出得到的单同位素峰列表。将测得的质荷比值输入到 Melin 9 和/或 HMDB 代谢组数据库中，以便与库条目进行质量匹配。
接下来，使用成像软件为整个组织切片中检测到的所有脂质实体生成 maldi 图像，在峰顶点处的质量过滤器宽度为百万分之一。为匹配数据库条目的所有质荷比值生成图像后，还会为所有其他峰生成图像，以寻找独特的分布模式，以便稍后针对某些特定组织（例如牛晶状体）进行研究。当使用直接解冻封片时，通常会观察到组织大面积撕裂。
IT OAS 玻片的 Preco 与乙醇或甲酸有助于在组织封片过程中保持组织切片的完整性。基质的选择和溶剂的选择都是影响 MALDI 谱图质量的重要因素。这些示例将高效基质溶剂生成的谱图与二醇基质溶剂选择不佳进行了比较。
一旦从 Maldi MSI 实验中采集了一组质谱，就可以为每个检测到的离子生成图像。每个像素代表来自组织切片表面的激光照射点。分析物的相对浓度可以在组织切片的不同部分详细说明。
在大多数实验中，数据是每个谱图内的总离子电流归一化。如果没有具有更好分析物基质的归一化区域，COC 结晶可能会为分析物带来更强的信号，从而导致数据偏斜。组织制备也会显著改变生成的图像。
如果样品太湿，则分析物将在组织上离位，并且许多空间信息将丢失。这个目镜组织成像实验的演示使用二醇作为多矩阵，通过 F-T-I-C-R-M-S 确定脂质的空间分布。可以使用二醇或其他基质以类似的方式完成不同类型组织中脂质的成像。
查看完整文字稿并访问数千部科学视频
概述
本研究介绍了一种使用二苯并蒽二醇（DT）作为基质辅助激光解吸电离（MALDI）基质对牛晶状体组织中内源性脂质进行成像的实验方案。该方法能够在不丢失空间信息的前提下，实现多种脂质的空间定位。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物化学
- 质谱法
背景
- 二蒽醇先前已被用作基质辅助激光解吸电离（MALDI）基质。
- MALDI成像技术能够实现对组织中小分子的分析。
- 内源性脂质在生物过程中发挥着关键作用。
- 传统的脂质分析方法可能会丢失空间信息。
研究目的
- 提供在MALDI成像中使用DT的详细实验方案。
- 可视化牛晶状体组织中脂质的分布情况。
- 将MALDI成像与传统的脂质提取方法进行比较。
使用的方法
- 制备牛晶状体组织的薄切片。
- 应用多种基质进行MALDI成像。
- 采集MALDI质谱数据集。
- 将数据集处理为脂质分布的可视化图像。
主要结果
- 多种内源性脂质的成功定位。
- 脂质丰度与分布的可视化呈现。
- 展示质谱成像相较于液相色谱-质谱联用（LCMS）在空间定位方面的优势。
- 揭示脂质在牛晶状体中的生物学作用。
结论
- 采用解吸电喷雾电离成像技术对脂质进行分析是有效的。
- 该方法可保留脂质的空间分布信息。
- 在多种生物研究领域具有潜在应用价值。
常见问题
行业重要性概述
基质辅助激光解吸/电离成像（MALDI-IMS）可实现组织切片中内源性脂质的空间定位，有助于在早期药物发现中进行靶点验证和机制性风险评估。在超高分辨率傅里叶变换离子回旋共振质谱（FTICR-MS）中使用二蒽醇（dithranol）作为基质，可提高对低分子量化合物的检测能力，同时降低化学噪声，从而增强脂质生物标志物鉴定的预测可信度。该方法通过直接从组织样本获得可重复、无需标记的分子分布信息，支持检测方法开发和筛选准备，为临床前研究中的立项或终止决策提供依据。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过绘制与疾病相关的组织模型中内源性脂质分布图，实现对脂质介导的治疗假设的验证。
- 操作价值：提供无需标记、具有空间分辨率的脂质谱型，支持功能靶点验证和通路风险评估。
- 预测价值：利用高分辨率傅里叶变换离子回旋共振质谱（FTICR-MS）检测，减少基质干扰导致的假阳性，提高脂质靶点筛选的可靠性。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：从单个组织切片生成定量、多重的脂质检测结果，能够在不丢失空间信息的情况下实现并行化合物筛选。
- 操作价值：通过标准化的基质涂布（例如，溶剂中的二蒽酮）和仪器校准流程，提供可重复的基质辅助激光解吸电离成像质谱（MALDI-IMS）数据。
- 检测适用性：通过生成稳定且高保真的质谱图，支持可扩展的脂质筛选工作流程，适用于数据库比对和图像生成。
转化与临床前研究
- 转化连续性：通过保留基于提取的方法（如液相色谱-质谱联用，LCMS）中丢失的空间信息，将发现阶段的脂质定位与临床前验证相联系。
- 机制性风险降低：阐明脂质在组织生理中的作用（例如牛晶状体），为生物标志物的相关性及通路调控策略提供依据。
- 基于风险评估的推进：基于空间分辨的脂质调控模式支持“推进/终止”决策，减少因未预期的组织特异性效应导致的后期研发失败。
流程与工作流整合
该方法通过提供具有空间分辨的脂质数据，阐明作用机制并指导检测设计，从而整合到从早期靶点验证、先导化合物鉴定到临床前评价的整个发现流程中。
- 发现生物学：通过可视化组织切片中内源性脂质的动态变化，支持假设验证和通路解析。
- 筛选：通过标准化基质应用和傅里叶变换离子回旋共振质谱（FTICR-MS）数据采集，实现可直接用于检测的、可重复的脂质谱分析。
- 分析：提供高分辨率质荷比测量（1 ppm 质量滤宽）及同位素峰选择，通过与HMDB或METLIN数据库匹配，实现可靠的脂质鉴定。
- 转化研究：在组织处理过程中避免分析物的错位，保持从发现研究到临床前研究的空间连续性。
- 企业级复用：建立可重复使用的基质辅助激光解吸电离成像质谱（MALDI-IMS）平台，用于跨多种组织类型的脂质筛选，减少对破坏性提取方法的依赖。
运营与企业影响
- 科学价值：通过傅里叶变换离子回旋共振质谱（FTICR-MS）降低基质背景并解析分析物信号，提高靶点验证的可信度。
- 操作价值：采用标准化组织制备、基质喷涂（20个循环）以及ES调谐混合物进行内标校准，提升实验重复性。
- 战略价值：通过在单次实验中实现并行脂质检测，减少对连续LCMS运行的需求，提高资本使用效率。
- 项目组合影响：揭示组织特异性的脂质分布，为靶点的安全性和有效性特征提供依据，支持基于风险调整的优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备组织冷冻切片、基质应用以及在电喷雾电离/基质辅助激光解吸电离双模式下操作傅里叶变换离子回旋共振质谱仪（FTICR-MS）的专业技术。
- 依赖于获取超高分辨率的傅里叶变换离子回旋共振质谱仪（FTICR-MS）设备，以及为基质辅助激光解吸电离（MALDI）信号积累优化的激光参数。
- 需要跨团队统一组织贴附的标准操作流程（例如，使用甲酸预润湿氧化铟锡（ITO）载玻片），以防止分子脱位。
- 需考虑溶剂与基质的相容性（例如，避免在解冻贴附过程中导致组织撕裂的溶剂）。
- 受限于样品制备过程中组织完整性的问题，可通过在载玻片上预先涂覆乙醇或甲酸来缓解。
