地蒽酚作为傅立叶的基质辅助激光解吸/离子化成像矩阵变换离子回旋共振质谱仪
2013年11月26日
蒽三酚（DT; 1,8 - 二羟基-9,10 - 二氢蒽-9 - 酮）先前已被报道作为MALDI基质为小分子的组织成像;对于使用DT的内源性脂质的对的MALDI成像协议这里所提供的组织切片由正离子的MALDI-MS在一个超高分辨率四极-FTICR仪器表面。
该程序在空间上定位牛晶状体内的多个内源性脂质。采用基质辅助激光解吸电离技术，质谱成像。首先，准备一个薄的牛晶状体组织切片并应用多矩阵，然后获取 maldi 质谱数据集。
将数据集处理成晶状体组织切片上检测到的脂质的可视化表示。这些结果可以共同确定脂类在牛晶状体内的位置和相对丰度，并产生这种分布的可视化表示。与其他方法（如脂质提取后进行 LCMS 分析）相比，maldi 质谱成像可以同时可视化多种脂质，而不会丢失其空间定位。从零下 80 摄氏度的储存中取出速冻组织标本。
从晶状体表面取下胶囊，以固定整个牛犊晶状体切片。将一两滴水滴在低温恒温器的组织切割台上。当低温恒温器平衡至最佳温度时，在镜头凝固之前快速将镜头放入水中。
将组织赤道切成 20 微米厚的切片。丢弃第一个组织切片，仅使用接近赤道平面或添加赤道平面的切片对眼晶状体组织进行成像。加入 1.5 微升甲酸以预润湿 ITO 涂层载玻片的表面。
然后小心地将组织切片转移到低温恒温器内的载玻片上。接下来，在应用 maldi 基质之前，将玻片冻干 15 分钟。使用校正液笔，在 ITO 涂层载玻片的非导电表面上添加三个示教标记。
现在使用平板扫描仪拍摄组织切片的光学图像，并将其保存为适当的格式，例如 TIFF 或 jpeg。首先，用胶带覆盖 ITO 涂层载玻片前表面的边缘，使基质不会覆盖载玻片的边缘。准备要在适当溶剂中使用的基质。
然后将基质溶液涂在组织切片的表面。使用 20 次矩阵涂层循环涂覆载玻片。或者，如果溶剂与电子基质喷雾器不兼容，可以使用气动辅助喷枪喷雾器来喷涂基质。
对于质量校准溶液，将 ES 调谐混合物标准溶液稀释 1 至 200 倍，溶于 60% 异丙醇中每分钟引入 2 微升稀释的 ES 调谐混合物溶液，放入仪器上的双模式电喷雾电离离子源中，进行四次变换离子回旋共振 ms。在正离子 ESI 模式下作 F-T-I-C-R 仪器，具有宽带检测和 1024 KB 的数据采集大小每秒。通常将 ESI 参数设置为 3， 900 伏毛细管电喷雾电压。
喷雾防护罩电压为 3， 600 伏雾化器氮气流量为每分钟 2 升。干燥的氮气流量为每分钟 4 升，温度为 200 摄氏度。还将撇渣器的一个电压设置为 15 伏。
飞行时间 0.01 秒碰撞氩气流 0.4 升/秒，源离子积累时间 0.1 秒，碰撞池离子积累 0.2 秒。现在调整 F-T-I-C-R作参数，以便在质荷比 200 至 1400 的质量范围内最大限度地提高分析灵敏度，同时保持良好的时域自由感应衰减信号。然后采集 ESI 质谱图，并使用 E es 调谐混合溶液中标准化合物的参考质量数校准仪器。
为了调整仪器以进行 MALDI作，将几个 1 微升的混合图灵和 INE 标准溶液等分试样溶解在基质溶液中，每个浓度为 1 微摩尔，然后将这些溶液直接点样到其中一个样品组织切片上。将玻片放入组织载玻片适配器中，并将适配器从 MALDI 侧加载到双 ESI maldi 离子源中。接下来，针对激光功率和每次质量扫描的 MALDI 信号累积的激光发射次数优化适当的 MALDI作参数。
在调整、校准和优化用于 maldi MSI 实验的仪器后，将要成像的组织切片的物理位置与成像软件中记录的光学图像对齐。使用三点三角测量方法对齐三个修正液标记。然后开始同步 ESI MALDI作，使每个质谱都包含 E ES 调谐混合溶液的参考质量峰，用于采集后内部质量校准。
首先通过降低毛细管电压来衰减 ESI 信号，直到 MALDI 信号在谱图中占主导地位，而 ESI 口径信号仍然足够高，可以进行内部质量校准。接下来，为辐射激光设置一个自动提升方法。使用随机点分析。
定义要成像的组织区域并设置适当的激光 RA 步长。使用内部校准校准 MALDI 质谱进行初始比较，并使用自定义 VBA 脚本为 MSMS de isotope 选择峰和单同位素峰，并导出得到的单同位素峰列表。将测得的质荷比值输入到 Melin 9 和/或 HMDB 代谢组数据库中，以便与库条目进行质量匹配。
接下来，使用成像软件为整个组织切片中检测到的所有脂质实体生成 maldi 图像，在峰顶点处的质量过滤器宽度为百万分之一。为匹配数据库条目的所有质荷比值生成图像后，还会为所有其他峰生成图像，以寻找独特的分布模式，以便稍后针对某些特定组织（例如牛晶状体）进行研究。当使用直接解冻封片时，通常会观察到组织大面积撕裂。
IT OAS 玻片的 Preco 与乙醇或甲酸有助于在组织封片过程中保持组织切片的完整性。基质的选择和溶剂的选择都是影响 MALDI 谱图质量的重要因素。这些示例将高效基质溶剂生成的谱图与二醇基质溶剂选择不佳进行了比较。
一旦从 Maldi MSI 实验中采集了一组质谱，就可以为每个检测到的离子生成图像。每个像素代表来自组织切片表面的激光照射点。分析物的相对浓度可以在组织切片的不同部分详细说明。
在大多数实验中，数据是每个谱图内的总离子电流归一化。如果没有具有更好分析物基质的归一化区域，COC 结晶可能会为分析物带来更强的信号，从而导致数据偏斜。组织制备也会显著改变生成的图像。
如果样品太湿，则分析物将在组织上离位，并且许多空间信息将丢失。这个目镜组织成像实验的演示使用二醇作为多矩阵，通过 F-T-I-C-R-M-S 确定脂质的空间分布。可以使用二醇或其他基质以类似的方式完成不同类型组织中脂质的成像。
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概述
本研究提出了一种使用二氢芴（DT）作为MALDI基质来成像牛晶状体组织中内源性脂质的协议。该方法允许多种脂质在不失去其空间关系的情况下进行空间定位。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物化学
- 质谱分析
背景
- 二氢芴之前已被用作MALDI基质。
- MALDI成像能够分析组织中的小分子。
- 内源性脂质在生物过程中扮演着关键角色。
- 传统的脂质分析方法可能会丢失空间信息。
研究目的
- 提供在MALDI成像中使用DT的详细协议。
- 可视化牛晶状体组织中的脂质分布。
- 比较MALDI成像与传统的脂质提取方法。
使用的方法
- 制备薄的牛晶状体组织切片。
- 应用多基质进行MALDI成像。
- 获取MALDI质谱数据集。
- 将数据集处理成脂质分布的可视化表现形式。
主要结果
- 成功定位多种内源性脂质。
- 脂质丰度和分布的可视化表现。
- 展示了相对于LCMS的空间定位优势。
- 对牛晶状体中脂质角色的洞察。
结论
- 使用DT进行MALDI成像对于脂质分析是有效的。
- 该方法保留了脂质的空间信息。
- 在各种生物学研究领域中的潜在应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Matrix-assisted laser desorption/ionization imaging (MALDI-IMS) enables spatial mapping of endogenous lipids in tissue sections, supporting target validation and mechanistic de-risking in early drug discovery. The use of dithranol as a matrix on ultrahigh-resolution FTICR-MS improves detection of low-molecular-weight compounds while reducing chemical noise, enhancing predictive confidence in lipid biomarker identification. This approach supports assay development and screening readiness by providing reproducible, label-free molecular distributions directly from tissue, informing go/no-go decisions in preclinical research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of lipid-mediated therapeutic hypotheses by mapping endogenous lipid distributions in disease-relevant tissue models.
- Operational Value: Provides label-free, spatially resolved lipid profiles that support functional target validation and pathway de-risking.
- Predictive Value: Increases confidence in lipid target selection by reducing false positives from matrix interference through high-resolution FTICR-MS detection.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, multiplexed lipid readouts from single tissue sections, enabling parallel compound screening without spatial information loss.
- Operational Value: Delivers reproducible MALDI-IMS data through standardized matrix application (e.g., dithranol in solvent) and instrument calibration protocols.
- Assay Readiness: Supports scalable lipid screening workflows by producing stable, high-fidelity mass spectra suitable for database matching and image generation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links discovery-phase lipid localization to preclinical validation by preserving spatial context lost in extraction-based methods like LCMS.
- Mechanistic De-risking: Clarifies lipid roles in tissue physiology (e.g., bovine lens) to inform biomarker relevance and pathway modulation strategies.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables go/no-go decisions based on spatially resolved lipid modulation patterns, reducing late-stage attrition due to unanticipated tissue-specific effects.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical evaluation by providing spatially resolved lipid data that informs mechanistic understanding and assay design.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by visualizing endogenous lipid dynamics in tissue sections.
- Screening: Enables assay-ready, reproducible lipid profiling via standardized matrix application and FTICR-MS data acquisition.
- Analytics: Delivers high-resolution mass measurements (1 ppm mass filter width) and isotopic peak selection for confident lipid identification via HMDB or METLIN database matching.
- Translational Research: Maintains spatial continuity from discovery to preclinical work by avoiding analyte delocalization during tissue processing.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable MALDI-IMS platform for lipid screening across tissue types, reducing reliance on destructive extraction methods.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves target validation confidence by reducing matrix background and resolving analyte signals via FTICR-MS.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized tissue preparation, matrix coating (20 cycles), and internal calibration using ES tuning mix.
- Strategic Value: Increases capital efficiency by enabling parallel lipid detection in single experiments, reducing need for sequential LCMS runs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by revealing tissue-specific lipid distributions that inform target safety and efficacy profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue cryosectioning, matrix application, and FTICR-MS operation in dual ESI/MALDI mode.
- Depends on access to ultrahigh-resolution FTICR-MS instrumentation and optimized laser parameters for MALDI signal accumulation.
- Necessitates cross-team standardization of tissue mounting (e.g., ITO slide pre-wetting with formic acid) to prevent delocalization.
- Involves adaptation considerations for solvent-matrix compatibility (e.g., avoiding solvents that cause tissue tearing during thaw mounting).
- Limited by tissue integrity challenges during preparation, which can be mitigated by pre-coating slides with ethanol or formic acid.
