肠道细菌侵袭肠上皮细胞 体外 使用垂直扩散室模型显著增强

以下实验的总体目标是利用垂直扩散室（VDC）模型研究细菌与肠上皮细胞侵袭过程的相互作用。首先，使用一种特殊滤膜，其上培养有极化排列的Caco-2肠上皮细胞单层，从而在VDC中形成相互分离的顶腔和基底侧腔室。第二步，将目标细菌接种物加入顶腔室中。

在微需氧条件下进行细胞培养时，需在有氧条件下向基底外侧腔室添加培养基，随后在共培养过程中的预定时间点取出滤膜，计数与细胞相互作用或细胞内的细菌数量。最终，与标准的有氧培养条件相比，使用VDC模型可观察到相互作用及细胞内细菌数量的增加。该技术相较于现有方法（如标准的组织培养黏附与侵袭实验）的主要优势在于，该技术可在体外实现细菌与肠道上皮细胞的共培养，且培养条件更接近人体肠道内的体内环境。

演示该实验步骤的是我实验室的博士生 N Vida nas 和博士后 Dominic Mills，后者在我实验室攻读博士学位期间开发了垂直扩散室模型。首先，在培养基中，将 4 × 10⁵ 个 Caco-2 肠道上皮细胞接种到每个 0.4 微米的滤膜上，然后将细胞培养 21 天以实现极化，每 2 至 3 天更换一次培养基，以确保单层细胞的极化状态。使用伏特-欧姆电阻计测量跨上皮细胞电阻。

开始VDC共培养实验前24小时，在可变气氛培养箱中，于微需氧条件下将空肠弯曲菌接种于新鲜的血琼脂平板上进行培养。同时，在实验当天，将30毫升Bruce肉汤在相同条件下预先孵育，并将VDC半室装置以及O型环和塞子浸入消毒液中。一小时后，使用无菌的20毫升注射器将消毒液从两个半室的气体入口处冲洗通过。随后，用另一支无菌的20毫升注射器，以新鲜无菌水冲洗VDC组件及气体入口。

然后将一半的CJ幽门螺杆菌血琼脂平板培养物收获至1毫升预温育的Barella肉汤中，使菌液浓度约为每毫升10¹⁰个菌落形成单位（CFU）。在600纳米波长下测定细菌悬液的光密度，以半定量细菌菌落形成单位（CFUs），随后将细菌悬液用4毫升预温育的Bruce肉汤调整至所需的接种浓度。从此最终细菌悬液中进行系列稀释，取适当稀释度涂布于血琼脂平板，每个稀释度设三个重复，将平板置于可变气氛培养箱中培养48小时。

现在，将VDC的下半腔室平放在实验台上，并在其上安装一个O形圈。然后，从支架上取下一个带有肠上皮细胞的滤膜，用400微升无菌PBS洗涤三次。将滤膜放置在下半腔室上，确保O形圈保持原位，随后轻轻将上半腔室放低并安装到位。

将两个半腔室组装完毕后，使用环形夹具将其夹紧，并将VDC水平放置于实验台面上，使两个开口朝上。将细菌接种物加入到顶端半腔室中，然后向基底侧半腔室中加入4毫升细胞培养基。将端盖插入两个半腔室的开口中，随后将VDC放入可变气氛培养箱中。

在气体分配器附近，打开连接至气体分配器的气体供应调节阀。将分配器的管路连接到VDC基底侧半室的气体入口，然后将可变气氛培养箱的气体出口管路连接至基底侧半室末端组件上的一个出口。将基底侧半室末端组件上的另一个出口封闭。

然后非常缓慢地打开气体分配管路上的气体流量，以避免气体压力过高，并在适当的共培养期后使气体流速达到每两到五秒一个气泡。关闭连接至气体分配管路的气体供应调节器。随后，在分配管路处将气体流路吹入垂直扩散室（VDC），并断开气体入口、气体出口以及塞子与VDC的连接。

接下来，从可变气氛培养箱中取出 VDC。然后移除顶端和基底侧的上清液，并将其储存在负 80 摄氏度条件下，以供后续分析。移除环形夹具，轻柔地拆开 VDC。

从半室中取出滤膜，并将其转移至无菌的六孔细胞培养板中。随后用无菌水清洗VDC，以备下一轮实验用于计数相互作用细菌的总数。用400微升无菌PBS清洗肠上皮细胞三到五次，然后在含有Triton X-100的400微升无菌PBS中室温裂解20分钟，对细胞裂解液进行系列稀释，随后将适当稀释度的样品以三个重复接种至血琼脂平板上。

然后将平板置于可变气氛培养箱中，37摄氏度下孵育48小时，以计数侵入细菌的总数。在标准组织培养箱中，用400微升含有150微克/毫升庆大霉素的细胞培养基处理肠上皮细胞2小时，以杀灭胞外细菌。随后通过细胞裂解、连续稀释及培养，定量菌落形成单位，方法如前所述。

以下数据展示了在标准细胞培养检测条件下与使用 VDC 模型时，CJ jui 在与 Caco-2 细胞共培养 3 小时、6 小时或 24 小时后与其相互作用或侵入的数量比较。例如，在标准细胞培养条件下共培养 24 小时后，仅可观察到少于 10⁷ CFU 的 CJ Juna 与 CACO-2 细胞相互作用。然而，在 VDC 模型中共培养 24 小时后，可观察到约 10⁸ CFU 的 CJ jui 与 CACO-2 细胞相互作用，表明 CJ jui 与肠上皮细胞（IEC）的相互作用增加了近 10 倍。

在比较标准培养条件与VDC培养条件下侵入CJ jui的数量时，标准细胞培养条件下培养24小时后，可从Caco-2细胞中分离出约10的5次方个细胞内CFU的CJE jui；而在VDC模型中共培养24小时后，可从Caco-2细胞中分离出约10的7次方个细胞内CFU，细胞内CJE数量增加近100倍。在进行该操作时，重要的是在系统构建后监测基底外侧腔室的气体流速。

该技术为研究细菌致病机制的研究人员提供了途径，使其能够探究细菌与肠道上皮细胞相互作用的遗传基础，以及宿主对细菌感染的先天免疫反应。观看本视频后，您应能充分理解如何利用垂直扩散室模型来研究其他肠道细菌与肠道上皮细胞的相互作用，以及更接近人体肠道环境的实验条件。