从小鼠阻力动脉中分离微血管内皮管

本实验的总体目标是从小鼠腹壁上表腹壁动脉（SEA）中分离出内皮细胞管，以研究天然完整微血管内皮的细胞内和细胞间信号动态。该过程首先从小鼠腹部骨骼肌壁中分离出SEA；第二步，对血管进行轻柔且适度的消化处理，随后小心地进行TAT处理，以分离平滑肌细胞和外膜，从而获得内皮细胞管。

在最后一步中，将小管固定在灌流 chamber 中，并用生理盐水溶液进行 superfusion。最终，可利用共聚焦成像来观察天然完整的微血管内皮小管中的钙信号。该技术相较于现有方法（如内皮细胞培养）的主要优势在于，构成小管的内皮细胞保持了其天然形态、蛋白质表达以及反应性。内皮层对于全身的血流调控至关重要。

应用该技术可使我们研究介导血流控制的细胞间信号传导事件，以及这些信号在血管功能障碍期间可能发生的异常变化。首先分离SEA，需在麻醉小鼠的耻骨区域上方皮肤处做一个小切口，然后沿两侧分别向后肢方向横向延伸切口，再沿腹侧中线向肋骨顶部纵向延伸切口，并进一步向四肢方向横向扩展切口。随后轻轻提起皮肤，切断皮肤与下方肌肉之间的结缔组织，从而暴露整个腹部肌群的表面。

用室温生理盐水冲洗暴露的肌肉。然后在体视显微镜下，提起位于胸骨底部的脂肪垫。切开脂肪垫，并沿最下方的肋骨进行切口。

此时应可见脊髓前动脉（SEA），操作时需注意不要损伤动脉，用更多室温生理盐水冲洗暴露的组织。在牵开骨骼肌表层后，观察 SEA 的长度，然后小心地切除动脉下方的薄层肌肉。接下来，使用弯头镊子将一段六零丝线从脊髓旁动脉（SCA）下方穿过。

然后结扎动脉及其相邻的静脉，以维持其压力并使血液保留在血管腔内。在对侧结扎脊颈动脉（SCA）后，沿腹肌中线做切口以分离两侧组织，然后向两侧横向延伸切口，方法与皮肤切口相同。继续沿外侧边缘垂直延长切口，完全将腹肌与身体分离。

然后在结扎部位上方剪断小肠系膜动脉（SEA），以保持其完整性，并将分离出的肌肉和动脉置于含有10毫升4摄氏度解剖缓冲液的50毫升烧杯中。从腹部另一侧分离肌肉后，将组织在解剖缓冲液中孵育10分钟。接着，将含有小肠系膜动脉（SEA）的腹部肌肉放置于一个4摄氏度、内涂一层Cyl Guard并盛有解剖缓冲液的培养皿中。使用0.15毫米的昆虫针将SEA及其肌肉拉伸至先前记录的大致体内长度。

将 SEA 固定在圆筒护罩上，调整肌肉方向，使朝向腹膜的薄层位于上方。然后从结扎处的上游位置向下游端开始，清除 SEA 及其伴行静脉和周围组织约一到两厘米的覆盖，直至第一个主要分支位置。在分支位置上方和结扎位置下方分别剪断 SEA。

接下来，使用一段弹性管将移液管的后端连接至含有冰冻解剖缓冲液的5 mL注射器。将灌注用移液管尖端固定在解剖腔内，并对 SEA 进行灌注。待所有红细胞被冲洗干净后，将 SEA 从灌注移液管上取下，并将移液管从解剖皿中移除，以分离出内皮管。

首先，用冰浴的解剖缓冲液填充一支 12 × 75 毫米的玻璃培养管至半满。然后将 SEA 切成 1 至 3 毫米大小的组织块，用斜口镊子将动脉组织块转移至培养管中，并将试管置于冰上。接下来，在另一支 12 × 75 毫米的培养管中，将消化酶与解离缓冲液混合，总体积为 1 毫升，并使用加热块将酶溶液预热至 37 °C。

从4摄氏度环境中取出含有动脉组织片段的培养管，置于室温下回温，同时将酶溶液加热至37摄氏度。小心吸除培养管中现已升至室温的解剖缓冲液，保留少量液体以确保血管节段仍悬浮其中。随后缓慢加入不含酶的室温解离缓冲液至血管节段中，使动脉组织片段保持在培养管底部，以充分洗去残留的解剖缓冲液。

当酶溶液达到 37 摄氏度后，再次吸出含有血管段的培养管中的解离缓冲液，仅保留含有血管段的小体积液体。随后将 37 摄氏度的酶溶液转移至培养管中，并将培养管置于加热块中，在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。孵育期间，准备一支用矿物油回填的滴定移液管，对移液管进行划痕，干净利落地折断，用镊子火焰将移液管折断，抛光移液管尖端，并将其固定在安装于显微操作器上的微型注射器上。

然后回抽微量注射器活塞，吸取2纳升解离缓冲液，将移液管尖端移至孵育结束后的流室上方。按照刚刚演示的方法小心吸取缓冲液后，用4毫升室温解离缓冲液冲洗动脉节段。接着，用1毫升微量移液器轻柔吸取一段血管，将该血管段放入含有1毫升解离缓冲液的流室中。

将灌流吸管的尖端置于血管段一端附近，然后以大约 225 纳升/秒的速度将血管段吸入灌流吸管中，以避免对内皮细胞造成机械损伤，随后将血管重新排出至腔室中。若消化成功，平滑肌细胞和外膜将与内皮管分离。应尽快将外膜移离内皮管，以防其与管状结构缠绕，然后重复上述灌流操作，直至所有平滑肌细胞完全分离。

最后一次操作后，将分离的内皮管置于流动腔室中央，使其沿流动方向对齐，并移除触发移液管。将固定用移液管固定在安装于流动腔室两端的显微操作器上，然后将其尖端分别置于内皮管的两端。依次将固定移液管从管的两端相对位置缓慢下移，将内皮管压向腔室底部，位置距离管的每一端约50微米。

当固定移液管刚刚接触管状结构时，沿管的轴线缓慢回撤移液管，将其拉伸至接近体内的实际长度。将移液管压向腔室底部以固定该管状结构，随后启动蠕动泵，使灌流液持续恒定地流经内皮管。在此微分干涉相差图像中，显示的是 SEA 来源的单个内皮细胞管，在室温下以每分钟三毫升的流速用灌流缓冲液灌流一小时后的状态。

本视频展示了在1微摩尔乙酰胆碱刺激下，负载Fluo-4的内皮细胞管的钙离子响应。这些代表性荧光图像是在乙酰胆碱刺激内皮细胞管后不同时间点采集的。请注意细胞内钙离子随时间发生的振荡变化。

在进行该操作时，必须注意避免在三重定位和固定过程中对血管内皮管造成机械损伤，因为内皮细胞极为脆弱，容易受损。观看本视频后，您应能较好地掌握如何从小鼠上腹壁浅动脉中分离内皮管，从而研究天然完整的微血管内皮结构。