从鼠标阻力动脉分离微血管内皮管

该程序的总体目标是从小鼠上腹动脉或 SEA 中分离内皮细胞管，以研究天然完整微血管内皮的细胞内和细胞间信号动力学。这是通过首先从小鼠腹部骨骼肌壁中分离 SEA 来实现的。在第二步中，对血管进行温和的体细胞消化，然后仔细地进行 TAT 以将平滑肌细胞和外膜从内皮细胞管中解离出来。

在最后一步中，将管子固定在流动室中，并与生理盐水溶液超级融合。最终，共聚焦成像可用于可视化天然完整微血管内皮管中的钙信号传导。与培养内皮细胞等现有方法相比，该技术的主要优点是构成管的内皮细胞并保持其天然形态、蛋白质表达和反应性，内皮是全身血流控制不可或缺的一部分。

这项技术的应用使我们能够研究介导血流控制的细胞间信号传导事件，以及它们在血管功能障碍期间如何出错。为了首先分离 SEA，在麻醉小鼠耻骨区域正上方的皮肤上做一个小切口，将切口沿每个方向横向延伸到相应的后肢，然后沿着腹侧中线继续切口到胸腔顶部，进一步将切口沿每个方向横向延伸到相应的四个肢体。现在轻轻提起皮肤并切断将皮肤固定到底层肌肉的结缔组织，露出腹部肌肉组织的整个表面。

用室温盐水冲洗暴露的肌肉。然后在立体显微镜下，提起位于胸骨底部的脂肪垫。穿过脂肪垫并沿着下肋骨切开。

SEA 现在应该是可见的，注意不要损坏动脉，用更多的室温盐水溶液冲洗暴露的组织。骨骼肌的顶层缩回后，记下 SEA 的长度，然后小心地切除动脉下方的薄肌肉层。接下来，使用倾斜的镊子将一段 6 oh silk 缝合线穿过 SCA 下方。

然后结扎动脉及其相邻静脉，以保持其加压并保持血液保留在血管腔内。在对侧结扎 SCA 后，沿腹部肌肉中线切开，将两侧分开，然后像皮肤一样向每个方向横向延伸切口。沿外缘垂直继续切口，将腹部肌肉与身体完全分离。

然后切下结扎上方的 SEA 以保持密封，并将分离的肌肉和动脉放入含有 10 毫升 4 摄氏度解剖缓冲液的 50 毫升烧杯中。将肌肉与腹部另一侧分离后，将组织在解剖缓冲液中孵育 10 分钟。现在，将含有 SEA 的腹肌放入涂有一层 cyl guard 并含有解剖缓冲液的 4 摄氏度培养皿中 使用 0.15 毫米的昆虫针将 SEA 和肌肉拉伸到先前记录的近似体内长度。

将 SEA 固定到导向肌肉的 cyl guard，使面向腹膜的薄层位于顶部。然后从连接的上游部位向下游末端工作，从其成对的静脉和周围组织中清除约 1 到 2 厘米的 SEA，直到第一个主要分支部位。在分支部位上方和连接下方切割 SEA。

接下来，使用一根弹性管将移液器的后端连接到装有冰冷解剖缓冲液的 5 毫升注射器上。将插管移液器吸头固定在解剖室内并插管 SEA。然后，一旦所有红细胞都被冲出，从插管移液管中取出 SEA，并从解剖皿中取出移液管以分离内皮管。

首先，将冰冷的解剖缓冲液填充 12 x 75 毫米的玻璃培养管中。然后将 SEA 切成 1 到 3 毫米的小块后，使用倾斜的镊子将动脉块转移到培养管中，并将管子放在冰上。接下来，将消化酶与解离缓冲液混合到单独的 12 x 75 毫米培养管中，最终体积为 1 mL，并用加热块将酶溶液预热至 37 摄氏度。

从 4 摄氏度中取出含有动脉碎片的培养管，并将其置于室温下加热，同时酶溶液升温至 37 摄氏度。小心地从培养管中吸出现在室温的解剖缓冲液，留下包含容器段的小体积。现在慢慢地向血管段中加入室温、不含酶的解离缓冲液，使动脉块保留在培养管的底部，以洗去任何残留的解剖缓冲液。

一旦酶溶液达到 37 摄氏度，再次从含有容器段的培养管中吸出解离缓冲液，留下少量包含容器段的样品。现在将 37 度的酶溶液转移到培养管中，并将培养管在加热块中于 37 摄氏度下孵育 30 分钟。在孵育过程中，准备一个用矿物油回填的升�移液器，在移液器上划痕，彻底断裂，用镊子火打破移液器，抛光移液器的尖端并将其固定在安装在微型纵器中的微型注射器上。

然后缩回微型注射器柱塞，向移液器中注入 2 纳升解离缓冲液，并在孵育结束时将移液器吸头放在流通室上。如刚才所示，小心吸出缓冲液后，用 4 毫升室温解离缓冲液洗涤动脉段。接下来，用 1 毫升微量移液器轻轻吸出一个容器段，并将容器放入装有 1 毫升解离缓冲液的流动室中。

将移液管的尖端放在容器段的一端附近，然后以每秒约 225 纳升的速度将容器段吸入移液管中，以免对内皮细胞造成机械应力，将容器喷射回腔室。如果消化成功，平滑肌细胞和外膜将从内皮管中分离出来。尽快将外膜从内皮管上移开，以防止其缠结在管中，然后重复刚才所示的作，直到所有平滑肌细胞都解离。

在最后一次迭代后，ASEE 并将分离的内皮管放置在流动室的中心，沿流动方向对齐并取出触发移液管。将固定移液管固定在安装在流动室两端的微型纵器中，然后将它们的尖端放在内皮管的相应末端。将固定移液管一次一个地放在管的相对端，将管子压在腔室底部，距离管子的每一端约 50 微米。

就像固定移液管接触试管时，沿试管的轴线慢慢缩回试管，将其延伸到其近似体内长度。将移液管压在腔室底部以固定管子，然后使用蠕动泵开始流出 Superfusion 溶液，以保持 Superfusion 溶液通过内皮管的恒定流量。在该差异干涉对比图像中，显示了来自 SEA 的分离内皮细胞管，随后在室温下以每分钟 3 毫升的速度使用 superfusion 缓冲液进行 1 小时的超级输注。

这部电影展示了流感 oh 4 负载的内皮细胞管对 1 微摩尔乙酰胆碱刺激的钙反应。这些代表性荧光图像是在乙酰胆碱内皮管刺激后的不同时间点收集的。注意细胞内钙如何随时间振荡。

在尝试此程序时，重要的是要记住避免在三重定位和固定过程中机械损坏内皮管，因为内皮细胞非常脆弱且容易损坏。看完这个视频，你应该对如何从小鼠上腹上动脉分离内皮管有一个很好的了解，从而研究天然完整的微血管内皮。