Name: 从鼠标阻力动脉分离微血管内皮管 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-25T21:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: 学习从小鼠阻力动脉分离微血管内皮管的方法，用于研究原生微血管内皮细胞的钙信号动态。该技术保留细胞天然形态，适用于血管生物学和细胞信号传导研究。

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作者感谢 Pooneh Bagher 博士和&#160;Erika Westcott 博士在准备手稿过程中提供的编辑意见。本研究由美国国立卫生研究院下属的国家心肺血液研究所资助，项目编号为 R37-HL041026 和 R01-HL086483（授予 SSS），以及 F32-HL107050（授予 MJS）。本内容完全由作者负责，不代表美国国立卫生研究院的官方观点。

1. 仪器准备：流式细胞室、移液器和溶液
<ol>
	<li>灌流室：使用底部带有24 mm × 50 mm玻璃盖玻片的灌流室，用于灌流分离的内皮管（参见 图1A在组装腔室之前，用3% HCl和70%乙醇清洗玻璃盖玻片，再用超纯水冲洗，并用氮气吹干。</li>
	<li>移液管：本实验方案中使用三种不同类型的移液管：灌注移液管、吹打移液管和固定移液管。灌注移液管和固定移液管可在实验前预先制备，但吹打移液管应在实验当天制作，因其需根据血管直径确定管腔大小。
	<ol>
		<li>灌注移液管：为了冲洗管腔内的红细胞，使用微量移液管拉制仪将硼硅酸盐玻璃毛细管拉制成具有细长锥形末端的移液管。用镊子将末端折断，使其外径比动脉直径小约30%（约50–80 µm），并对尖端进行火焰抛光以确保光滑（参见 图1B将移液器枪头倾斜至大约45°角也有助于操作。</li>
		<li>移液吹打管：为了将平滑肌细胞和外膜从内皮管中机械分离，需使用硼硅酸盐玻璃毛细管制作移液吹打管。制备方法同上，用镊子将管端折断。提示：可使用玻璃刻痕工具，以便更轻松地整齐折断移液吹打管较厚的管壁。将移液管折断至实验当天确定的内径大小，其内径应比待分离内皮管的血管外径大约10–20 µm。将折断的管端进行火焰抛光，直至表面光滑（见 图1C).</li>
		<li>固定移液管：为了稳定流室内的内皮管，制备固定移液管以将内皮管固定在流室底部的盖玻片上。将玻璃毛细管以与灌注移液管相同的方式拉制。然后用镊子将末端折断至直径约100 µm，并进行火焰抛光，直至尖端封闭、圆润且光滑（参见 图1D注意：如果固定移液管的尖端未完全密封，液体将进入管腔，可能干扰实验结果。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>溶液：使用超纯水（18.2 MΩ）配制所有溶液2O，并通过0.2 µm滤器灭菌。确保溶液的渗透压在285-300 mOsm之间。溶液在4 °C保存时可稳定约两周。
	<ol>
		<li>灌注液：分离上腹上动脉过程中使用的盐溶液成分为（单位：mmol/L）：137 NaCl，5 KCl，1 MgCl2，10 N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸（HEPES）、10 葡萄糖、0.01 硝普钠（SNP）和 0.1% 牛血清白蛋白（BSA），pH 值为 7.4。添加一氧化氮供体 SNP 有助于松弛平滑肌细胞，从而便于动脉插管以及在研磨过程中去除平滑肌细胞。</li>
		<li>解离液：用于内皮管解离的盐溶液成分为（单位：mmol/L）：137 NaCl，5 KCl，1 MgCl2，10 HEPES，10 葡萄糖，2 CaCl₂2，以及 pH 为 7.4 的 0.1% BSA。向 1 ml&#160;此缓冲液的等分试样中加入：0.62 mg/ml&#160;木瓜蛋白酶，1.5 mg/ml&#160;胶原酶和1.0 mg/ml&#160;二硫苏糖醇。由于不同供应商提供的酶其酶活性水平可能存在差异，本研究中所用酶的产品编号已在材料表中列出以供参考。注意：在本实验方案中，解离缓冲液和含酶解离缓冲液将在不同步骤中使用。</li>
		<li>灌流液：用于灌流分离的内皮小管的生理盐溶液（PSS）成分为（单位：mmol/L）：137 NaCl，5 KCl，1 MgCl₂，1.2 NaH₂PO₄，2.5 CaCl₂，10 葡萄糖，10 HEPES，用 NaOH 调节 pH 至 7.4。2，10 HEPES，10 葡萄糖和 2 CaCl2，pH 为 7.4。</li>
		<li>在开始手术操作前配制缓冲液和溶液。将溶液从4 °C取出，分装为每份50 ml&#160;将200毫升解剖缓冲液加入200毫升容器中&#160;锥形瓶并置于冰上。此外，分装 50 ml&#160;不加酶的解离缓冲液置于室温下平衡。将灌流液从4 °C取出，置于室温下平衡。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 动物准备
确保所有涉及动物的实验操作和方案均符合美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）的规定 实验动物护理和使用的指南此处所述程序已获得密苏里大学动物护理与使用委员会的批准。
<ol>
	<li>使用至少9周龄的雄性或雌性小鼠，并对每只小鼠单独进行实验。通过腹腔注射（i.p.）给予戊巴比妥钠（60 mg/kg）以麻醉小鼠。提示：在注射前将戊巴比妥用无菌生理盐水稀释至10 mg/ml，可降低过量给药的风险。</li>
	<li>麻醉会影响体温调节，因此在注射戊巴比妥后应立即为小鼠保温。将小鼠置于加热板（校准至约37 °C）上的金属载体（带通风孔的铝制篮子）中，可有效维持小鼠体温稳定。也可使用加热灯，但需注意将其放置在与小鼠适当的距离处。每5–10分钟&#160;监测一次小鼠状态，直至达到合适的麻醉深度（对脚趾或尾部夹捏无回缩反应）。若有必要，可在15–20分钟后追加一次剂量。操作时应缓慢谨慎，避免过量，尤其是对肥胖、年老或处于其他应激状态的动物更需注意。</li>
	<li>使用小型宠物电推剪小心剃除腹部区域的毛发。操作时应特别注意避免对动物造成创伤。建议将从腋窝至耻骨区域的全部毛发去除。用新的酒精棉签清除任何松散附着的毛发。</li>
	<li>将小鼠仰卧位放置，前后肢充分展开，以尽可能暴露腹壁。如有必要，可用实验室胶带以仰卧展开姿势固定四肢。</li>
</ol>
3. 胸廓内动脉上支的分离
<ol>
	<li>在耻骨区域上方的皮肤处做一个小切口。确保仅切开皮肤，避免损伤下方的腹肌；将切口向两侧延伸至相应的后肢。沿腹侧正中线向前（头侧）继续切开，直至肋骨顶部，然后将切口向两侧分别延伸至相应的前肢。</li>
	<li>轻轻提起皮肤，用剪刀剪断将皮肤与下方肌肉相连的结缔组织，从而完全暴露腹壁肌肉的整个表面（参见 图3A用室温0.9%生理盐水冲洗暴露的肌肉。</li>
	<li>由于胸骨旁脂肪组织（SEA）体积较小，需将动物置于体视显微镜下进行后续操作。用镊子提起胸骨下端的脂肪垫，并在其上做一切口。沿下缘肋骨继续切开，注意不要过深切割至下方组织。此时应可见SEA，操作时需注意避免损伤。切口完成后，用室温0.9%生理盐水冲洗暴露的组织。</li>
	<li>在将骨骼肌表层牵开后，脊髓附件（SEA）及其下方的肌肉可轻易辨认。提示：注意SEA的长度。 在体内 在分离前拉伸内皮管（分离后会沿其轴向缩短）以近似恢复其原始长度。使用镊子和剪刀，小心切除 SEA 下方的薄层肌肉组织。</li>
	<li>使用斜角镊子，将一段6-0丝线从SEA下方穿过，结扎动脉及其伴行静脉，以维持血管内压力并保留管腔内的血液，便于后续分离和清理过程中进行观察。</li>
	<li>在对侧重复 SEA 连接步骤。</li>
	<li>将两侧腹壁外斜肌缝合固定后，沿腹肌正中线做切口，分离两侧组织。</li>
	<li>沿皮肤切口方向向两侧横向延伸切口，然后沿外侧边缘垂直继续切开，以完全分离腹肌与身体。操作时应避免损伤由脊髓前动脉（SEA）供血的血管结构，以维持其加压管腔的完整性。</li>
	<li>在结扎上方切断SEA以保持密封，将分离出的肌肉和动脉置于50 ml容器中&#160;烧杯，内含10 ml&#160;4 °C 解剖缓冲液</li>
	<li>对腹部另一侧重复上述操作，并将组织置于解离缓冲液中孵育10分钟。</li>
	<li>将含有SEA的腹肌置于含有解剖缓冲液的预冷（4 °C）解剖皿中（见 图3B解剖室由一个底部铺有一层Sylgard（聚二甲基硅氧烷[PDMS]）的培养皿组成。</li>
	<li>使用昆虫针（0.15 mm）将分离的SEA和腹部肌肉拉伸至接近原位 体内 长度（如上所述），并将其固定在Sylgard上。提示：将肌肉定向，使朝向腹膜的薄层位于上方，可利用透射光照明清晰观察到SEA。</li>
	<li>使用精细的显微解剖器械，从结扎部位的上游向下游方向操作，将脊髓前动脉（SEA）与其伴行静脉及周围组织分离，直至第一个主要分支处（1-2 cm）。然后在分支点上方和结扎部位下方稍作切割，切除脊髓前动脉。</li>
	<li>为了清除血管腔内残留的血液，插管肠系膜上动脉（SEA）并用冰冻解剖缓冲液冲洗。使用一段硅胶管，将插管移液管的后端连接至5 ml&#160;注射器中装入冰冻解剖缓冲液，并将微量移液器固定在显微操作器上，使其尖端位于解剖室中以插管SEA。</li>
	<li>待所有红细胞冲洗干净后，从灌注管中移除 SEA，并将移液管从解剖皿中提起。</li>
	<li>将SEA切成每段长1-3 mm的小段。较短的片段有助于内皮管的分离。</li>
</ol>
4. 内皮管的分离
<ol>
	<li>将12 mm × 75 mm的玻璃培养管装入半管冰冻解离缓冲液。使用斜口镊子将动脉组织片段转移至培养管中，并置于冰上。此时，将消化酶与解离缓冲液混合，定容至1 ml。&#160;在另一个12 mm × 75 mm的培养管中（见1.3.2 溶液）加入溶液，并使用加热块将溶液预热至37 °C。</li>
	<li>在解离缓冲液和酶升温的同时，小心吸除培养管中的解剖缓冲液，保留含有血管节段的小部分液体。</li>
	<li>轻轻加入不含酶的室温解离缓冲液，以洗去残留的解剖缓冲液。提示：缓慢加入解离缓冲液，使动脉组织片段保持在培养管底部，从而节省等待其重新沉降的时间。将缓冲液温度逐步升高，依次从冰上温度（4 °C）升至室温（~24 °C），再升至37 °C，以尽量减少温度冲击。</li>
	<li>小心地从培养管中吸除消化缓冲液，注意务必留下含有血管段的小部分液体。</li>
	<li>从加热块上取下含有酶的预热解离缓冲液，转移1 ml&#160;向含有血管段的培养管中加入酶溶液，然后将培养管放回加热块中。在37 °C孵育30分钟。</li>
	<li>孵育酶的过程中，准备一支吹打移液管，用矿物油反向填充，并将其固定在显微操作仪所夹持的微量注射器上。随后回拉微量注射器的活塞，使移液管吸入2 nl液体&#160;加入解离缓冲液，并将移液器吸头置于流室上方。</li>
	<li>30 分钟结束时&#160;孵育后，将培养管从加热块中取出，并参照上述方法小心吸除缓冲液。</li>
	<li>用4 ml清洗动脉节段&#160;室温解离缓冲液。注意：无需再将血管段保持在培养管底部；扰动动脉组织片段实际上有助于更有效地去除残留的酶。</li>
	<li>用1 ml移液器轻轻吸取一段血管，将其转移至灌流 chamber&#160;微量移液器，将其放入含1 ml液体的流动室中&#160;解离缓冲液的</li>
	<li>使用装有微量注射器的显微操作仪，将吹打移液管的尖端置于血管节段的一端附近。</li>
	<li>吸取血管节段（500 nl）&#160;以缓慢速度（225 nl/sec）将溶液回吸至研磨移液管中，避免对内皮细胞造成机械损伤，然后将其重新排出至腔室中。若消化成功，平滑肌细胞和外膜将与内皮管分离。</li>
	<li>重复吹打直至所有平滑肌细胞完全解离。注意过度吹打（4次或以上）可能会损伤内皮细胞（ECs），导致其对激动剂无反应。提示：使用吹打移液管应尽快将外膜与内皮管分离，以避免外膜缠绕内皮管。注意：可使用吹打移液管将分离的内皮管吸出并转移至独立的容器中。</li>
	<li>将内皮管置于流室中央，使其与流动方向一致，并移除吹打用移液管。</li>
	<li>将移液管牢固固定在安装于流动室两端的显微操作器上，并将其尖端分别置于内皮管的两端。</li>
	<li>将固定移液管缓缓下移至管状结构一端，将其压向腔室底部。以同样方式将第二根固定移液管置于管状结构的另一端。注意：固定移液管的位置需在固定效果（远离管端放置）与扩大成像/实验区域（靠近管端放置）之间权衡。将移液管置于距管两端约 50 µm 处通常效果较佳。当固定移液管刚好接触管状结构时，沿管轴方向缓慢回撤，从而将其适度拉伸至接近理想形态 体内 长度；然后将移液器按压在腔室底部以固定管子。</li>
	<li>开始灌流溶液的流动，并让内皮管静置至少20分钟&#160;平衡并贴附（参见 图3C). 使用蠕动泵维持内皮管表面持续的液体流动（灌流）。注意：一旦内皮管已黏附至流室底部（约25分钟），即可移除固定移液管，或选择保留在原位，以防止内皮管移位。</li>
</ol>
5. 染料加载与钙成像
<ol>
	<li>为了观察细胞内钙反应，在室温（约 24 °C）下用 fluo-4 AM 染料对内皮管进行染色。停止灌流槽中的液体流动，并将 fluo-4 AM 加入腔室中，终浓度为 10 µM。孵育 10 分钟，使染料进入细胞，随后用新鲜的 PSS 溶液对内皮管进行 20 分钟的灌流，以确保去除细胞外残留染料，并完成细胞内染料的去酯化。</li>
	<li>进行钙成像。本研究使用配备旋转盘共聚焦成像系统的 upright 显微镜（见图 2），在室温条件下进行。采用 491 nm 激光激发荧光钙染料，并使用增强型数字相机采集发射波长在 500–550 nm 范围内的图像。</li>
</ol>

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<li>Jackson, W. F., Huebner, J. M., Rusch, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+isolation+and+characterization+of+single+vascular+smooth+muscle+cells+from+cremasteric+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Enzymatic isolation and characterization of single vascular smooth muscle cells from cremasteric arterioles.</a> Microcirculation. 4, 35-50 (1997).</li>
</ol>

本文介绍了从 SEA 中分离内皮管及其用于观察其组成性内皮细胞（ECs）内 Ca2+ 信号事件的方法。该操作流程改编自最初用于分离仓鼠提睾肌小动脉内皮管的方法8。通过采用本文所述技术的微小变异，我们已从多种血管床中成功分离出内皮管，包括：仓鼠提肌的供血动脉和颊囊小动脉10、小鼠上腹壁上动脉6,7,9、小鼠肠系膜动脉和脑动脉以及淋巴微血管（未发表观察结果；其中肠系膜血管分离方法参见文献12，脑血管分离方法参见文献13）。从新的血管床中分离内皮管可能需要对原始方案进行调整。若分离不成功，建议首先调整消化时间：若内皮管难以从小血管平滑肌细胞和外膜中分离，则延长消化时间；若内皮管无法保持完整，则缩短消化时间。若调整消化时间无效，可尝试调整消化酶浓度或消化温度。另一种选择是减小吹打移液管的内径，以增强去除平滑肌细胞时的剪切力。也可尝试提高液体喷射速度以达到类似效果，但更易损伤样本。需认识到，在那些内皮细胞之间缺乏足够连接蛋白连接的血管中，可能无法分离出完整的内皮管。
在酶消化后分离平滑肌细胞最初是使用手动移液器完成的8。我们采用微注射器系统优化了吹打程序，从而能够稳定地分离出更长的内皮管状结构（最长可达3 mm）6。使用该系统时，需用矿物油从后端填充吹打移液管，以在控制液体流动的活塞与含有血管段的PSS之间形成连续的液柱。由于液体不可压缩，且微注射器活塞提供恒定驱动力，当血管段被迫通过移液管尖端时，所产生的剪切力保持恒定。相比之下，常用于细胞解离的手动方法（例如&#160;挤压巴斯德移液管末端的橡胶球）涉及空气压缩，会导致驱动力压力不稳定，从而引起移液管尖端施加的剪切力产生变异。
微血管内皮功能研究中采用管状结构制备具有多种优势。其一是分离过程可获得明确且均一的内皮细胞（ECs）和血管平滑肌细胞的原代细胞群体。由于内皮细胞仍以管状结构保持物理连接，因而与保留其原有形态的单个平滑肌细胞明显区分 &#34;C&#34; 如果在吹打过程中细胞保持松弛状态，则可轻松区分不同类型的细胞。 例如&#160;在获取用于实时 PCR 和免疫组织化学等分子技术的样本时10由于可以从单个血管（或如SEA中所述的双侧血管）分离出多个血管段，因此可从同一只动物的相同血管中获取分子数据和功能数据。从而能够将分子表达与微血管内皮的功能行为相关联。此外，可独立于血流动力学因素（压力、血流）以及血液中携带的血管活性物质的影响，解析微血管内皮固有的细胞内和细胞间信号事件。例如&#160;激素），或来自周围的平滑肌细胞（例如&#160;通过肌内皮耦联14-16），神经17或组织实质18.
重要的是，由于内皮细胞是从特定的微血管中 freshly 分离得到的，因此不存在因培养内皮细胞而可能导致的表型改变19-21。例如，培养的内皮细胞会丧失毒蕈碱受体的表达，从而改变其钙信号谱型。此外，内皮细胞的电生理特性在培养过程中也可能发生变化22。由于单个内皮细胞之间仍通过功能性的缝隙连接通道相互耦合，内皮管成为研究细胞间电信号和 Ca2+ 信号传导的理想模型6,7。还应认识到，分离的平滑肌细胞可方便地用于膜片钳技术，以获得与微血管功能相关的互补性数据23。
内皮管模型的一个主要局限性在于，随着温度升高，制备的样本稳定性下降。尽管我们的肠系膜动脉（SEA）来源样本在室温（约24 °C）下以及在32 °C条件下数小时内均表现出良好的稳定性和健康状态，但在37 °C时，其形态和功能在不到一小时内即出现退化9。内皮管的第二个重要局限性是失去了肌内皮连接及其固有的信号传导结构域，而这些结构域在完整血管壁中对内皮细胞（EC）功能至关重要14-16。还应认识到，尽管较长的管段有助于研究较远距离的细胞间信号传递6，但随着管段长度增加，制备过程变得更加复杂，因为周围平滑肌细胞和外膜组织更难完全解离。我们发现，长度超过1-2 mm的管段在流动腔室中也更难定位和固定。相反，虽然较短的管段（例如 <1 mm）适用于研究Ca2+和电信号8，但在流动腔室中进行灌流时难以维持其完整性。最后，即使双侧管段分离达到最佳状态，其样本量仍不足以使用Western blot进行传统的蛋白质表达定量分析，尽管免疫标记可提供蛋白质表达水平和定位的信息。尽管存在上述局限性，内皮管仍是一种新颖的实验模型，有助于深入理解微血管内皮细胞在体内的功能机制in vivo。

在本实验方案中，我们描述了从小鼠胸腹壁动脉（SEA）中分离内皮细胞管的方法。SEA起源于胸内动脉，为前腹部肌群提供富氧血液。我们选择SEA作为研究模型，是因为它提供了相对较长且无分支的微血管节段，非常适合研究内皮在调控和协调平滑肌细胞舒张过程中所涉及的细胞间信号传导事件。对于关注骨骼肌以外组织的研究者，我们发现该技术可轻松适用于从脑、肠道及淋巴系统的微血管中获取内皮细胞管。
该方法的关键特征在于，可分离出完整长度（1-3 mm）的微血管内皮组织，并将其固定在玻璃盖玻片上，置于灌流 chamber 中，用PSS溶液进行表面灌流，随后用于Ca2+ 信号成像7-9或进行电生理穿刺以记录电信号6,8。在灌流 chamber 内，管状结构的上半部分暴露于灌流液中，可对实验干预产生反应，而下半部分（与盖玻片接触）则受到保护，保持静息状态。除了可用于研究细胞内和细胞间Ca2+信号事件外，内皮管还可用于定量实时PCR以评估基因表达6,10、免疫组织化学分析蛋白表达6,10，以及电生理研究以明确电传导的生物物理特性6,11。
内皮细胞管制备法在研究内皮功能方面具有多种优势。首先，分离过程可简单区分两种细胞群体：内皮细胞（保持管状结构）和平滑肌细胞（单个解离；静息状态下通常呈&#34;C&#34;形）。这使得研究人员能够选择性地取样并研究各自细胞对血管功能贡献的独特特性。其次，该模型能够解析内皮固有的信号事件，而不受血流、周围平滑肌、神经及实质组织的影响。第三，内皮细胞在新鲜分离状态下被研究，从而避免了因细胞培养导致的基因或蛋白表达改变。

<table><tbody><tr><td>氯化钠</td><td>Fisher</td><td>S642-212</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>硫酸镁</td><td>Sigma</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>亚硝基铁氰化钠</td><td>Sigma</td><td>431451</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>USB Products</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>木瓜蛋白酶</td><td>Sigma</td><td>P-4762</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶</td><td>Sigma</td><td>C-8051</td><td></td></tr><tr><td>二硫赤藓醇</td><td>Sigma</td><td>D-8255</td><td></td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃（灌流和固定用移液管）</td><td>Warner Instruments</td><td>G150-4</td><td></td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃（吹打用移液管）</td><td>World Precision Instruments</td><td>4897</td><td></td></tr><tr><td>纳升级注射器微量注射泵</td><td>World Precision Instruments</td><td>B203MC4</td><td>已从Nanoliter 2000升级为Nanoliter 2010</td></tr><tr><td>Micro4控制器</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYS-MICRO4</td><td></td></tr><tr><td>12 mm × 75 mm 培养管</td><td>Fisher</td><td>14-961-26</td><td></td></tr><tr><td>三轴显微操作器</td><td>Siskiyou Corp</td><td>DT3-100</td><td>用于固定和定位固定移液管</td></tr><tr><td>灌流腔室</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-27N</td><td></td></tr><tr><td>100–1,000 &amp;micro;l 移液器</td><td>Eppendorf</td><td>3120000062</td><td>用于将消化后的血管段转移至灌流腔室</td></tr><tr><td>1 ml 移液器吸头</td><td>Fisher</td><td>02-707-405</td><td>用于将消化后的血管段转移至灌流腔室</td></tr><tr><td>直立显微镜</td><td>Olympus</td><td>BX51W1</td><td>具体显微镜型号由用户自行决定</td></tr><tr><td>转盘共聚焦系统</td><td>Yokogawa</td><td>CSU-X1</td><td>共聚焦成像为可选步骤</td></tr><tr><td>XR/TURBO EX 相机</td><td>Stanford Photonics</td><td>XR/TURBO EX</td><td>符合我们的需求；可根据用户情况调整</td></tr><tr><td>Piper 控制软件</td><td>Stanford Photonics</td><td></td><td>TURBO EX 相机的成像软件</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Leica</td><td>MZ8</td><td>可根据用户情况调整</td></tr><tr><td>Sylgard</td><td>Dow Corning</td><td>184</td><td></td></tr><tr><td>显微解剖剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>Dumont 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>#5/45</td><td></td></tr><tr><td>微型昆虫针</td><td>Austerlitz</td><td>M 尺寸 0.15 mm</td><td></td></tr><tr><td>GP Millipore Express PLUS 膜</td><td>Millipore</td><td>SCGPT05RE</td><td></td></tr><tr><td>移液管刻痕装置</td><td>Austin Flameworks</td><td>小型手持刻痕工具</td><td>austinflameworks.com</td></tr><tr><td>紧凑型宠物修剪器</td><td>Wahl Clipper Corp.</td><td>Model 9966</td><td>每次使用后应彻底清洁以延长使用寿命</td></tr></tbody></table>

从小鼠阻力动脉中分离微血管内皮管

Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries

阻力血管对血流的调控作用在于调节氧气和营养物质的供应，同时伴随代谢废物的清除，例如在骨骼肌运动时即体现此功能。内皮细胞（ECs）衬于所有阻力血管的内膜，对血管直径（例如&#160;依赖内皮的血管舒张）的调控起关键作用，从而影响组织血流量的大小和分布。内皮细胞通过细胞内Ca2+信号传导来调节血管阻力，该过程可导致扩散性自体活性物质（例如&#160;一氧化氮和花生四烯酸代谢产物）的生成1-3以及细胞超极化4,5，进而引发平滑肌细胞松弛。因此，理解内皮细胞Ca2+信号动态变化是阐明血流调控机制的关键步骤。分离内皮管可消除血管腔内血液以及周围平滑肌细胞和血管外神经带来的混杂因素，这些因素通常会影响内皮细胞的结构与功能。本文介绍一种优化后的实验方案，用于从小鼠腹壁上动脉（SEA）中分离内皮管。
为从麻醉小鼠中分离血管内皮管，需结扎SEA 原位 以维持血管腔内的血液（便于解剖过程中观察），并切除整片腹肌组织。将腹壁下动脉（SEA）从周围的骨骼肌纤维和结缔组织中分离，冲洗血管腔内的血液，并进行轻度酶消化，随后通过轻柔吹打去除外膜、神经和平滑肌细胞。这些新近分离的完整内皮组织可保持其天然形态，内皮细胞（ECs）之间仍保持功能上的耦联，能够通过缝隙连接进行细胞间化学和电信号的传递6,7除了为钙信号传导和膜生物物理学提供新的见解外，这些制备方法还能够在天然微血管内皮中进行基因表达和蛋白质定位的分子研究。

钙反应可通过乙酰胆碱（ACh）在新分离的内皮管中引发。本视频中，一条加载了荧光钙指示剂的内皮管 10 µM fluo-4 AM 通过灌流刺激 1 µM ACh（视频 1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50759/SochaandSegal_movie1.avi" target="_blank">点击此处观看视频</a>染料在491 nm处被激发，使用增强型电荷耦合器件相机记录500–550 nm的发射光。以每秒120帧的速度采集持续25秒的图像序列，之后可进行平均处理例如 至 40 帧/秒）。随时间变化的代表性荧光图像如图所示。 图 4.
<img alt="显示微移液管装置的静态平衡示意图，以及显示毛细作用过程的显微图像。" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50759/50759fig1.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图1. 分离内皮管时所用的灌流室和移液管。 A) 组装好的灌流室，以24 mm × 50 mm的玻璃盖玻片作为底部。 B) 拉制（左）以及拉制、折断、抛光并成角（右）的套管移液管示例。该移液管用于在解剖后冲洗动脉管腔内的红细胞。比例尺 = 200 µm。 C) 拉制（左）以及拉制、折断并抛光（右）的吹打移液管示例。该移液管的内径由动脉的外径决定。比例尺 = 200 µm。 D) 拉制（左）以及拉制、折断并抛光（右）的固定移液管示例。该移液管的尖端呈圆钝状并完全封闭，用于在灌流室中固定内皮管。比例尺 = 200 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50759/50759fig1highres.jpg" target="_blank">点击此处查看高分辨率图像</a>。
<img alt="用于光学激发的显微镜装置；包括横河转盘单元、显微镜和用于分析的透镜。" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50759/50759fig2.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 用于成像 Ca2+ 信号的转盘共聚焦显微镜。 A) 用于钙成像的直立显微镜。B) (a) 带有 (b) 增强型电荷耦合器件相机的共聚焦转盘单元。C) 用于成像的浸液物镜 (a) 63X (NA = 1) 和 (b) 20X (NA = 0.5)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50759/50759fig2highres.jpg" target="_blank">点击此处查看高分辨率图像</a>。
<img alt="心脏组织解剖过程、移植块制备、胶原纤维微观结构、显微镜图像。" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50759/50759fig3.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. 腹直肌及上腹壁浅动脉的分离。 A) 腹直肌暴露并用室温0.9%生理盐水冲洗的麻醉小鼠。红色箭头标记了位于脂肪垫下方的上腹壁浅动脉（SEA）进入每侧腹直肌的位置（i.e. 血管应在此处结扎）。比例尺 = 1 cm。 B) 在解剖腔中固定并进行显微解剖的单侧分离腹直肌及上腹壁浅动脉。红色箭头指示上腹壁浅动脉的第一个主要分支点（i.e. 血管清理应在此处停止）。比例尺 = 1 cm。 C) 来自上腹壁浅动脉的分离内皮细胞管。室温孵育1小时后拍摄的微分干涉差显微图像。内皮管以3 ml/min流速持续灌注灌注缓冲液。比例尺 = 50 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50759/50759fig3highres.jpg" target="_blank">点击此处查看高分辨率图像</a>。
<img alt="显示随时间变化的细胞层中钙信号改变的荧光显微镜图像系列。" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50759/50759fig4.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图4"> 
图4. 内皮细胞管中的钙荧光。内皮管在1 µM乙酰胆碱刺激下的代表性荧光图像。A) 刺激前的荧光图像。B) 乙酰胆碱给药时的内皮管荧光图像，t=0 秒。C) t=5 秒时的内皮管荧光图像。D) t=10 秒时的内皮管荧光图像。E) t=15 秒时的内皮管荧光图像。F) t=20 秒时的内皮管荧光图像。比例尺 = 40 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50759/50759fig4highres.jpg" target="_blank">点击此处查看高分辨率图像</a>。

我们介绍一种用于在原生、完整的微血管内皮中观察和操控钙信号的方法。从供应骨骼肌的小阻力动脉中 freshly 分离出的内皮管保留了体内的形态结构以及相邻细胞间和细胞内的动态信号传导。该内皮管也可由其他组织和器官的微血管制备而来。

阻力血管对血流的调控作用可调节氧气和营养物质的供应，同时协调代谢产物的清除……

本实验的总体目标是从小鼠腹壁上表腹壁动脉（SEA）中分离出内皮细胞管，以研究天然完整微血管内皮的细胞内和细胞间信号动态。该过程首先从小鼠腹部骨骼肌壁中分离出SEA；第二步，对血管进行轻柔且适度的消化处理，随后小心地进行TAT处理，以分离平滑肌细胞和外膜，从而获得内皮细胞管。在最后一步中，将小管固定在灌流 chamber 中，并用生理盐水溶液进行 superfusion。最终，可利用共聚焦成像来观察天然完整的微血管内皮小管中的钙信号。该技术相较于现有方法（如内皮细胞培养）的主要优势在于，构成小管的内皮细胞保持了其天然形态、蛋白质表达以及反应性。内皮层对于全身的血流调控至关重要。应用该技术可使我们研究介导血流控制的细胞间信号传导事件，以及这些信号在血管功能障碍期间可能发生的异常变化。首先分离SEA，需在麻醉小鼠的耻骨区域上方皮肤处做一个小切口，然后沿两侧分别向后肢方向横向延伸切口，再沿腹侧中线向肋骨顶部纵向延伸切口，并进一步向四肢方向横向扩展切口。随后轻轻提起皮肤，切断皮肤与下方肌肉之间的结缔组织，从而暴露整个腹部肌群的表面。用室温生理盐水冲洗暴露的肌肉。然后在体视显微镜下，提起位于胸骨底部的脂肪垫。切开脂肪垫，并沿最下方的肋骨进行切口。此时应可见脊髓前动脉（SEA），操作时需注意不要损伤动脉，用更多室温生理盐水冲洗暴露的组织。在牵开骨骼肌表层后，观察 SEA 的长度，然后小心地切除动脉下方的薄层肌肉。接下来，使用弯头镊子将一段六零丝线从脊髓旁动脉（SCA）下方穿过。然后结扎动脉及其相邻的静脉，以维持其压力并使血液保留在血管腔内。在对侧结扎脊颈动脉（SCA）后，沿腹肌中线做切口以分离两侧组织，然后向两侧横向延伸切口，方法与皮肤切口相同。继续沿外侧边缘垂直延长切口，完全将腹肌与身体分离。然后在结扎部位上方剪断小肠系膜动脉（SEA），以保持其完整性，并将分离出的肌肉和动脉置于含有10毫升4摄氏度解剖缓冲液的50毫升烧杯中。从腹部另一侧分离肌肉后，将组织在解剖缓冲液中孵育10分钟。接着，将含有小肠系膜动脉（SEA）的腹部肌肉放置于一个4摄氏度、内涂一层Cyl Guard并盛有解剖缓冲液的培养皿中。使用0.15毫米的昆虫针将SEA及其肌肉拉伸至先前记录的大致体内长度。将 SEA 固定在圆筒护罩上，调整肌肉方向，使朝向腹膜的薄层位于上方。然后从结扎处的上游位置向下游端开始，清除 SEA 及其伴行静脉和周围组织约一到两厘米的覆盖，直至第一个主要分支位置。在分支位置上方和结扎位置下方分别剪断 SEA。接下来，使用一段弹性管将移液管的后端连接至含有冰冻解剖缓冲液的5 mL注射器。将灌注用移液管尖端固定在解剖腔内，并对 SEA 进行灌注。待所有红细胞被冲洗干净后，将 SEA 从灌注移液管上取下，并将移液管从解剖皿中移除，以分离出内皮管。首先，用冰浴的解剖缓冲液填充一支 12 × 75 毫米的玻璃培养管至半满。然后将 SEA 切成 1 至 3 毫米大小的组织块，用斜口镊子将动脉组织块转移至培养管中，并将试管置于冰上。接下来，在另一支 12 × 75 毫米的培养管中，将消化酶与解离缓冲液混合，总体积为 1 毫升，并使用加热块将酶溶液预热至 37 °C。从4摄氏度环境中取出含有动脉组织片段的培养管，置于室温下回温，同时将酶溶液加热至37摄氏度。小心吸除培养管中现已升至室温的解剖缓冲液，保留少量液体以确保血管节段仍悬浮其中。随后缓慢加入不含酶的室温解离缓冲液至血管节段中，使动脉组织片段保持在培养管底部，以充分洗去残留的解剖缓冲液。当酶溶液达到 37 摄氏度后，再次吸出含有血管段的培养管中的解离缓冲液，仅保留含有血管段的小体积液体。随后将 37 摄氏度的酶溶液转移至培养管中，并将培养管置于加热块中，在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。孵育期间，准备一支用矿物油回填的滴定移液管，对移液管进行划痕，干净利落地折断，用镊子火焰将移液管折断，抛光移液管尖端，并将其固定在安装于显微操作器上的微型注射器上。然后回抽微量注射器活塞，吸取2纳升解离缓冲液，将移液管尖端移至孵育结束后的流室上方。按照刚刚演示的方法小心吸取缓冲液后，用4毫升室温解离缓冲液冲洗动脉节段。接着，用1毫升微量移液器轻柔吸取一段血管，将该血管段放入含有1毫升解离缓冲液的流室中。将灌流吸管的尖端置于血管段一端附近，然后以大约 225 纳升/秒的速度将血管段吸入灌流吸管中，以避免对内皮细胞造成机械损伤，随后将血管重新排出至腔室中。若消化成功，平滑肌细胞和外膜将与内皮管分离。应尽快将外膜移离内皮管，以防其与管状结构缠绕，然后重复上述灌流操作，直至所有平滑肌细胞完全分离。最后一次操作后，将分离的内皮管置于流动腔室中央，使其沿流动方向对齐，并移除触发移液管。将固定用移液管固定在安装于流动腔室两端的显微操作器上，然后将其尖端分别置于内皮管的两端。依次将固定移液管从管的两端相对位置缓慢下移，将内皮管压向腔室底部，位置距离管的每一端约50微米。当固定移液管刚刚接触管状结构时，沿管的轴线缓慢回撤移液管，将其拉伸至接近体内的实际长度。将移液管压向腔室底部以固定该管状结构，随后启动蠕动泵，使灌流液持续恒定地流经内皮管。在此微分干涉相差图像中，显示的是 SEA 来源的单个内皮细胞管，在室温下以每分钟三毫升的流速用灌流缓冲液灌流一小时后的状态。本视频展示了在1微摩尔乙酰胆碱刺激下，负载Fluo-4的内皮细胞管的钙离子响应。这些代表性荧光图像是在乙酰胆碱刺激内皮细胞管后不同时间点采集的。请注意细胞内钙离子随时间发生的振荡变化。在进行该操作时，必须注意避免在三重定位和固定过程中对血管内皮管造成机械损伤，因为内皮细胞极为脆弱，容易受损。观看本视频后，您应能较好地掌握如何从小鼠上腹壁浅动脉中分离内皮管，从而研究天然完整的微血管内皮结构。

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