Name: 协议用于实现大肠杆菌基于TX-TL无细胞表达系统合成生物学 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 11 s
Description: 学习建立基于大肠杆菌的TX-TL无细胞表达系统，用于合成生物学研究。该协议涵盖粗细胞提取物制备、反应条件优化及蛋白质表达验证，为体外快速测试基因回路提供高效平台。

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感谢Jongmin Kim、Dan Siegal-Gaskins、Anu Thubagere和Enoch Yeung在优化本实验方案过程中提供的帮助，感谢Clare Chen和Barclay Lee在项目初期阶段的支持。本研究工作部分由美国国防高级研究计划局（DARPA/MTO）“生命铸造厂”项目资助，合同号HR0011-12-C-0065（DARPA/CMO）。Z.Z.S. 还获得了加州大学洛杉矶分校/加州理工学院医学科学家培训项目奖学金以及美国国防部空军科学研究办公室国家国防科学与工程研究生（NDSEG）奖学金（32 CFR 168a）的支持。本文所表达的观点和结论均为作者个人观点，不应被解释为代表美国国防高级研究计划局或美国政府的官方立场，无论明示或暗示。

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

本文所述的基于内源性Escherichia coli的TX-TL无细胞表达系统是一种易于操作的三管反应体系，从实验设置到数据收集可在八小时以内完成。制备所有试剂的全过程共需五天时间（其中仅一天需要大量人力），但可制得可供3,000次反应使用的粗提物以及可供10,000次反应使用的缓冲液制备试剂（图1）。此外，粗提物和缓冲液制备试剂在-80 °C下至少可稳定保存1年，因此单次制备可多次使用。4 每10 μl反应的成本为0.11美元（包含人工成本则为0.26美元），较同类商业系统降低98%（图2）。
然而，该系统仍存在一些尚未解决的局限性。每次制备的粗提细胞提取物的最终效率可能因操作者熟练程度和环境条件而异，尽管典型的产量差异通常在 5-10% 之间（图 4b）。因此，终点表达水平和表达动态在不同批次之间存在可预期的批间差异。在提取物未被完全表征或提取过程未实现完全自动化之前，这些差异可能仍将持续存在。如果使用该无细胞表达系统进行敏感的定量实验，建议使用同一批次的粗提细胞提取物完成所有实验。单批粗提细胞提取物可获得约 3000 次反应的产量，足以满足典型的实验课程需求。尽管我们推测通过扩大规模并实现流程自动化可消除变异，但此类尝试将需要大量的资源投入。
此外，尽管终点表达水平相对容易测定，但对于无细胞系统内在动力学的理解仍需进一步研究。已知资源竞争和资源限制均会影响表达动力学。例如，内源性σ70因子的有限性可能导致饱和状态，增加DNA模板所产生的表达谱类似于核苷酸或氨基酸耗竭时的情况。9,27 然而，要利用该系统，并不需要完全理解其动力学特性。对于单纯提高产量的优化，可通过机器学习方法实现。28 资源竞争与限制的相关问题可通过基于实验数据验证的数学模型加以研究。
本文所述方案已针对 BL21-Rosetta2 菌株进行优化，但可推广至其他 E. coli 菌株。BL21-Rosetta2 的某些修饰，例如敲除编码 lon 蛋白酶的基因以及引入编码稀有 tRNA 的基因，有助于实现蛋白质产量的最大化。我们曾尝试使用另外两种提取物菌株——仅含 BL21 及 BL21 trxA 敲除菌株——进行本方案，发现其蛋白质产量降低了约 50%。我们推测，使用其他菌株时产量亦会类似地减少。其他参数的改变，例如以 LB 或其他富营养肉汤替代 2xYT 培养基，也会导致蛋白质产量下降。
利用内源性和外源性转录-翻译系统及调控机制的无细胞表达系统，在蛋白质和代谢物表达以及合成生物学领域具有广泛的应用。3,29 人们可以设想，在一个用户可控的环境中，通过结合使用大肠杆菌（E. coli）内源启动子与外源提供的转录和调控元件，突破仅依赖T7调控回路的限制，实现复杂生物分子的合成。由于不受细胞分裂和代谢的限制，诸如“抑制振荡器”（repressilator）等合成回路，或青蒿素生物合成通路等代谢工程通路中的变异性可被降低或更深入理解。30,31 我们已利用这些优势实现了基因开关的构建，并深入研究了σ因子的隔离机制。9,32 此类技术还可作为“最小”或“人工”细胞的核心基础——即由提取物构成的小型化、特征明确且自给自足的功能单元。33,34 
最终，我们预期这种内源性无细胞表达系统可立即作为合成生物学的原型开发平台。该系统被称为“TX-TL 生物分子试验板”，提供了一个可控的环境，使最终将用于体内表达的合成基因线路能够进行多轮原型设计——即在基础质粒、线性或化学合成的 DNA 上进行测试，随后分析结果并快速修改。目前正开发的预测性数学模型可辅助原型设计过程。通过在非最终版本的基因线路构建中省去克隆和体内操作步骤，我们预期可将工程设计周期从目前的数周缩短至 1–3 天。

A correction to Figure 5's legend has been made for the article <a href="http://www.jove.com/video/50762/protocols-for-implementing-an-escherichia-coli-based-tx-tl-cell-free">Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology</a>. Method 1 and method 2 have been switched.Z
The figure legend was update from:
Figure 5. Effects of DNA solution on expression efficiency. a) Comparison of two different purification methods for processing plasmids. 1 nM of pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 is prepared using only a QiaPrep Spin Miniprep Kit (Purification method 1) or post-processed with a QiaQuick PCR purification kit (Purification method 2).
to
Figure 5. Effects of DNA solution on expression efficiency. a) Comparison of two different purification methods for processing plasmids. 1
nM of pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 is prepared using only a QiaPrep Spin Miniprep Kit (Purification method 2) or post-processed
with a QiaQuick PCR purification kit (Purification method 1).

A correction to Figure 5's legend has been made for the article Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology. Method 1 and method 2 have been switched.

Erratum: Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

无细胞表达技术始于20世纪50年代，最初仅为单纯的翻译系统，数年后发展为利用T7噬菌体DNA实现转录-翻译偶联的系统。11,12 此后，人们开展了大量研究以优化粗细胞提取物（或称为 E. coli S30提取物）的制备。13,14 这些优化措施包括通过ATP再生或菌株改造来延长无细胞蛋白合成的持续时间，以及缩短实验周期并降低成本。15-17 此外，还存在使用重组组分替代粗细胞提取物进行表达的无细胞表达系统。5 粗细胞提取物和重组组分方法均已开发用于商业化应用。
随着合成生物学的发展，人们越来越需要一个特征明确的平台，用于测试和表达经过工程改造的生物模块与线路18,19 。该平台必须具备多功能性、特征明确、易于操作，并专注于用户提供的组分。尽管细胞无提取物系统比其他方法早发展了半个世纪，但基于大肠杆菌（E. coli）的细胞无提取物系统本质上符合这些要求，因为它们是以简化的体外（in vitro）形式再现细胞过程，避免了生长和代谢的复杂性。此外，所有在活体（in vivo）条件下对大肠杆菌（E. coli）研究所积累的基础知识均可直接应用于大肠杆菌（E. coli）的细胞无提取物系统。
尽管无细胞表达系统在合成生物学中具有应用潜力，但迄今为止，大多数无细胞表达系统的目标仍是最大化蛋白质和代谢产物的产量。这一目标通常通过T7噬菌体RNA聚合酶在T7启动子驱动下转录序列来实现。20 尽管该表达方式高效且稳定，但这些系统仅适用于高度特化的用途。其细胞调控手段有限，目标DNA模板必须重新设计以包含T7启动子，且某些序列（如核糖体复合物）无法被有效转录和组装。21,22 现有的无细胞表达系统在保持内源性调控机制的同时难以维持高产量，而这种灵活性对于合成生物学而言至关重要。
 我们开发了一种内源性 E. coli 无细胞表达系统，在保留先前系统所展现的高效蛋白质表达能力的基础上，进一步增强了灵活性，允许基于内源性以及外源性（T7 或其他）机制进行基因表达与调控。本方案最初基于 Kigawa et al. (2004) 和 Liu et al. (2005) 的方法，但进行了多项重要改进：采用谷氨酸镁和谷氨酸钾替代乙酸镁和乙酸钾以提高效率，去除2-巯基乙醇，并使用珠磨法裂解细胞。17,23,24 与均质化、基于压力的方法或超声破碎相比，珠磨法因成本更低且产率相当而被选用。23 能源物质采用3-磷酸甘油酸（3-PGA），因其相较于磷酸肌酸和磷酸烯醇式丙酮酸可获得更高的蛋白质产量。4,25 本系统在使用基于sigma70并带有λ噬菌体操纵子的启动子或T7驱动启动子时，均可产生高达0.75 mg/ml的报告蛋白，产量与其它商业系统相当。4,6 制备所有必要试剂共需五天（图1）。此外，与类似的商业无细胞系统相比，本系统可降低98%的成本——每10 μl反应的材料成本为0.11美元，若计入人工成本则升至0.26美元（图2）。

<table><tbody><tr><td>2xYT</td><td>MP生物医学</td><td>3012-032</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>3-磷酸甘油酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8877</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8937</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Bacto-agar</td><td>BD 诊断</td><td>214010</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>珠磨管（聚丙烯微量离心管）</td><td>BioSpec</td><td>522S</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>珠子，直径0.1 mm</td><td>BioSpec</td><td>11079101</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>BL21 Rosetta 2 &lt;em&gt;大肠杆菌&lt;/em&gt; 菌株</td><td>Novagen</td><td>71402</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Bradford BSA 蛋白检测试剂盒</td><td>伯乐（Bio-rad）</td><td>500-0201</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9501</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>氯霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1919</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>辅酶A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4282</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>胞苷三磷酸</td><td>USB</td><td>14121</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>比色皿，1.5 ml</td><td>Fisher</td><td>14-955-127</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>亚叶酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7878</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>GTP</td><td>USB</td><td>16800</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6147</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>K-谷氨酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1149</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Mg-谷氨酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49605</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>微型生物旋柱层析柱</td><td>Bio-Rad</td><td>732-6204</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>NAD</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6522</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Nunc 384孔光学底板</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>142761</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Nunc 封口膜</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>232701</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PEG-8000</td><td>Promega</td><td>V3011</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>磷酸氢二钾溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8584</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>磷酸二氢钾溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8709</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>RTS 氨基酸样本套装</td><td>5 端</td><td>2401530</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer透析盒，10k MWCO（试剂盒）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>66382</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>亚精胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85558</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>Fischer</td><td>BP1521</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>tRNA（来自 &lt;em&gt;大肠杆菌&lt;/em&gt;)</td><td>罗氏应用科学</td><td>MRE600</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>UTP</td><td>USB</td><td>23160</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>1 L 离心瓶</td><td>贝克曼库尔特</td><td>A98813</td><td>此规格专用于Avanti J系列；请根据所用离心机选择相应规格的等效尺寸。</td></tr><tr><td>4L 锥形瓶</td><td>Kimble Chase</td><td>26500-4000</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Avanti J-26XP 离心机</td><td>Beckman-Coulter</td><td>393127</td><td>或可使用容量为1 L的等效离心机。</td></tr><tr><td>Forma 480 轨道摇床</td><td>Thermo Scientific</td><td>480</td><td>或同等规格的6x4升胸式摇床</td></tr><tr><td>JLA-8.1000 转子</td><td>Beckman-Coulter</td><td>363688</td><td>或可容纳1 L、相当于5000 × g离心机转子。</td></tr><tr><td>Mini-Beadbeater-1</td><td>BioSpec</td><td>3110BX</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;补充材料 1. 物品配方&lt;/strong&gt;&lt;br /&gt;
&lt;em&gt;氯霉素，34 mg/ml： &lt;/em&gt;称取0.51 g氯霉素，加入乙醇定容至15 ml。过滤除菌（0.22 μm） &amp;mu;M），分装至1 ml离心管中，于-20℃保存 &amp;deg;C 以供后续使用。&lt;br /&gt;
&lt;em&gt;2xYT+P+Cm 琼脂平板： &lt;/em&gt;称取 1.24 g 2xYT、1.6 ml 1 M 磷酸氢二钾溶液、0.88 ml 1 M 磷酸二氢钾溶液、0.6 g 琼脂，加水至 40 ml。高压灭菌。冷却至 50 ℃ &amp;deg;C 并加入 40 &amp;mu;l Cm。取25 ml分装至100x15 mm培养皿中，静置冷却1小时。&lt;br /&gt;
&lt;em&gt;2xYT+P 培养基：&lt;/em&gt; 称取124 g 2xYT，加入160 ml 1 M 磷酸氢二钾溶液、88 ml 1 M 磷酸二氢钾溶液，并加水至4 L。分装为两份1.88 L和一份0.24 L。高压灭菌。&lt;br /&gt;
&lt;em&gt;Tris 碱，2 M：&lt;/em&gt; 称取60.57 g Tris碱，加水至250 ml。灭菌后室温保存备用。&lt;br /&gt;
&lt;em&gt;DTT，1 M： &lt;/em&gt;准备 2.31 g DTT，加水至 15 ml，过滤除菌（0.22 μm） &amp;mu;M），分装至1 ml离心管中，于-20 ℃保存 &amp;deg;C，以备后续使用。&lt;br /&gt;
&lt;em&gt;S30A 缓冲液： &lt;/em&gt;称取 10.88 g 谷氨酸镁和 24.39 g 谷氨酸钾，加入 50 ml 浓度为 2 M 的 Tris 溶液，用乙酸调节 pH 至 7.7，加水定容至 2 L。121°C 高压灭菌，4 °C 保存 &amp;deg;C，使用前加入4 ml 1 M DTT。&lt;br /&gt;
&lt;em&gt;S30B 缓冲液： &lt;/em&gt;称取 10.88 g 谷氨酸镁和 24.39 g 谷氨酸钾，加入 2 M Tris（调至 pH 8.2），加水定容至 2 L。121 °C 高压灭菌，4 °C 保存 &amp;deg;C，在使用前加入 2 ml 1 M DTT。&lt;br /&gt;
&lt;em&gt;HEPES： &lt;/em&gt;称取1.91 g HEPES（分子量238.21），用KOH调节pH至8，加水定容至4 ml。&lt;br /&gt;
&lt;em&gt;tRNA：&lt;/em&gt; 将30 mg tRNA溶于水，定容至600 μL &amp;mu;l.&lt;br /&gt;
&lt;em&gt;辅酶A:&lt;/em&gt; 准备 30 mg 辅酶 A（分子量 767.53）并加水至 600 μL &amp;mu;l.&lt;br /&gt;
&lt;em&gt;NAD： &lt;/em&gt;加入 34.83 mg NAD（分子量 663.43）、Tris 至终浓度 2 M（调 pH 至 7.5–8.0），加水定容至 300 mL &amp;mu;l. （加入27 &amp;mu;2 M Tris 溶液，调节溶液 pH 至 7.5–8。&lt;br /&gt;
&lt;em&gt;cAMP： &lt;/em&gt;加入42.80 mg cAMP（分子量329.22）、Tris至2 M（调pH至8），加水至200 μL &amp;mu;l. （加入 73 &amp;mu;2 M Tris 溶液调至 pH 8&lt;br /&gt;
亚叶酸（33.9 mM）：将 20 mg 亚叶酸钙盐固体（分子量 511.5）溶于 1.15 ml 水中。&lt;br /&gt;
&lt;em&gt;亚精胺：&lt;/em&gt; 准备 23.55 &amp;mu;145.25 分子量的亚精胺溶液及水至 150 微升 &amp;mu;l. 在37℃短暂融化后，于室温下制备 &amp;deg;C.&lt;br /&gt;
&lt;em&gt;3-磷酸甘油酸&lt;/em&gt; 加入1.03 g 3-磷酸甘油酸（分子量230.02）、2 M Tris（调至pH 7.5）和水，定容至3.2 ml。（加入1.73 ml 2 M Tris溶液以将pH调至7.5）。&lt;br /&gt;
&lt;em&gt;核苷酸混合液：&lt;/em&gt; 加入145 mg三磷酸腺苷二钾盐二水合物（分子量619.4）、133 mg三磷酸鸟苷二钠盐（分子量567.14）、79.4 mg三磷酸胞苷二钠盐二水合物（分子量563.16）、82.6 mg三磷酸尿苷三钠盐二水合物（分子量586.12）、15%稀释的KOH（调至pH 7.5）以及水至1.5 ml。（加入353 &amp;mu;加入15%稀释的KOH溶液，调节pH至7.5。&lt;br /&gt;
&lt;strong&gt;补充材料 2. Bradford 法测定蛋白浓度&lt;/strong&gt;
&lt;ol&gt;
	&lt;li&gt;从4℃取出Bradford试剂 &amp;deg;C，并置于室温。&lt;/li&gt;
	&lt;li&gt;准备 50 &amp;mu;1 mg/ml 和 0.1 mg/ml 的 BSA 标准品&lt;/li&gt;
	&lt;li&gt;准备40 &amp;mu;l 步骤1.47中提取物的20倍稀释液。&lt;/li&gt;
	&lt;li&gt;加入800 &amp;mu;向7个比色皿中加入l水。 &lt;/li&gt;
	&lt;li&gt;准备标准比色皿，分别用于 0 mg/ml、1 mg/ml（10 &amp;mu;l 0.1 毫克/毫升 BSA），2 毫克/毫升（20 &amp;mu;l 0.1 毫克/毫升 BSA），4 毫克/毫升（4 &amp;mu;l 1 mg/ml BSA），6 mg/ml（6 &amp;mu;l 1 mg/ml BSA）&lt;/li&gt;
	&lt;li&gt;准备用于2的实验比色皿 &amp;mu;样品 4 微升和 4 &amp;mu;样品体积。&lt;/li&gt;
	&lt;li&gt;加入200 &amp;mu;向每个比色皿中加入 Bradford 试剂 l，用移液器充分混匀。室温孵育至少 10 分钟。&lt;/li&gt;
	&lt;li&gt;使用第6.5步的比色皿在595 nm处测定吸光度并绘制标准曲线。若相关系数 r&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; &amp;< 0.95&lt;/li&gt;
	&lt;li&gt; 使用第 6.6 步的比色皿，通过 OD 595nm 测定提取物浓度。&lt;/li&gt;
&lt;/ol&gt;
&lt;strong&gt;补充材料 3. 缓冲液校准电子表格&lt;/strong&gt;&lt;br /&gt;
&lt;a href=&quot;http://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/TXTL_e(template)_calibration_JoVE.xlsx&quot; 目标=&quot;空白&quot;&gt; 参见 TXTL_e(template)_calibration_JoVE.xlsx&lt;/a&gt;. &lt;br /&gt;
&lt;strong&gt;补充材料 4. 无细胞表达运行电子表格。&lt;/strong&gt;&lt;br /&gt;
&lt;a href=&quot;http://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/TXTL_JoVE.xlsx&quot; 目标=&quot;空白&quot;&gt;请参见 TXTL _JoVE.xlsx&lt;/a&gt;.</td></tr></tbody></table>

用于合成生物学的基于 escherichia coli 的 tx-tl 无细胞表达系统的实施方案

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

理想的无细胞表达系统理论上可以模拟 在体内 受控的细胞环境 体外 平台1 这对于以受控方式表达蛋白质和基因线路，以及为合成生物学提供原型设计环境具有重要意义。2,3 为实现后一目标，保留内源性大肠杆菌转录-翻译机制的无细胞表达系统能够更准确地模拟 在体内 细胞动力学，优于基于T7 RNA聚合酶转录的系统。我们描述了一种高效的内源性 大肠杆菌 基于转录-翻译（TX-TL）的无细胞表达系统，其蛋白质产量可与基于T7的系统相当，且成本较类似的商业系统降低98%。4,5 缓冲液和粗制细胞提取物的制备方法，以及三管式TX-TL反应的实施过程均被详细描述。整个方案的准备工作需时五天，单次制备所获得的材料足以进行多达3000次的单个反应。制备完成后，每次反应从设置到数据采集与分析耗时不足8小时。可外源添加大肠杆菌以外的调控与转录机制， 大肠杆菌，例如 lac/tet 阻遏蛋白和 T7 RNA 聚合酶，可进行补充。6 mRNA和DNA降解速率等内源性特性也可进行调整。7 TX-TL 无细胞表达系统已成功应用于大规模电路组装、生物现象研究，以及在 T7 和内源性启动子下表达蛋白质。6,8 配套的数学模型可获取。9,10 该系统在合成生物学中具有独特应用，可作为原型设计平台，即“TX-TL 生物分子试验板”。

我们介绍了一种为期五天的实验方案，用于制备基于内源性大肠杆菌（Escherichia coli）的TX-TL无细胞表达系统。试剂（粗提细胞提取物和缓冲液）制备的示例时间线见图1。试剂制备完成后，可在-80 °C下保存长达一年。试剂制备完毕后，实验的设置与实施可在8小时以内完成。
此外，我们优化了TX-TL无细胞表达系统的表达条件。对于用户自行添加的其他组分，例如缓冲液或DNA溶液，应预先校准其毒性。例如，由于盐含量不同，质粒的不同处理方法会导致表达量差异。我们还测试了Tris-Cl洗脱缓冲液对反应效率的影响（图5）。
粗品细胞提取物校准的一个示例（参见步骤 4.1 至 4.9）如图所示 图 4a总体而言，我们的实验表明，粗制细胞提取物对谷氨酸镁水平最为敏感，其次是对谷氨酸钾水平。为演示该无细胞表达系统，我们构建并测试了一个基于负反馈回路的系统 tet 抑制26 (图6在无细胞表达系统中，同一电路在有无 aTc 的条件下运行，八小时表达后 deGFP 报告蛋白的终点表达量变化达 7 倍。尽管本实验无需全局诱导剂或阻遏剂，但如有需要，可在“主混合物制备”步骤中添加。
<img alt="实验时间线示意图；粗提细胞提取物、缓冲液制备、氨基酸溶液时间安排。" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig1.jpg" data-altupdatedat="1762173717000" data-alt="图 1"> 
图 1. 粗提细胞提取物、氨基酸溶液和能量溶液制备的时间线。 上述为该实验方案典型操作的五天时间安排，已优化以适应过夜孵育和日间操作步骤。
<img alt="显示无细胞系统成本构成的饼图；柱状图：成本与蛋白质表达分析。" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig2.jpg" data-altupdatedat="1762173717000" data-alt="图 2"> 
图 2. 不同粗提物无细胞系统的成本与表达分析。a) TX-TL 无细胞表达系统的人力与材料成本构成。基于2012年12月的试剂价格，以及每小时14美元的人力成本。 b) TX-TL 无细胞表达系统与其他商业系统的成本比较。成本按每微升（μL）计算，尽管各试剂盒的反应体积可能不同。 c) TX-TL 无细胞表达系统与其他商业系统的产量比较。蛋白质表达产量依据制造商标准测定。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/50762fig2large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看高清大图</a>。
<img alt="生物样品制备；微量管，离心机；蛋白质纯化，实验设置。" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig3.jpg" data-altupdatedat="1762173717000" data-alt="图 3"> 
图 3. 珠磨管的装载与处理。a) 细胞-珠混合液正确黏度的示例。细胞-珠混合液的黏度受多种因素影响，包括加入的 S30A 缓冲液体积、加入的珠粒数量以及在冰上放置的时间。b) 珠磨管在快速台式离心前的装载状态。离心可去除装载过程中积聚的气泡。c) 台式离心后气泡上浮的情况。气泡大小不一，可用移液器吸头刺破或移除。d) 封盖前完全装满的珠磨管。珠磨管内形成弯月面，管帽足以覆盖液体并导致少量溢出。e) 正确装载的滤器装置。这些装置可重复使用。f) 正确与不正确处理的珠磨管对比。左侧管为处理良好的样品——其上层较小且界限清晰，上清液非常透明；右侧管则不理想，表现为较厚、浑浊的第二层及不透明的上清液。不理想的样品不应进行后续处理。
<img alt="比较不同 Mg、K、DTT 浓度以及提取物 1 和 2 的最大荧光强度的柱状图。" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig4.jpg" data-altupdatedat="1762173717000" data-alt="图 4"> 
图 4. 粗提物制备的特性。a) 粗细胞提取物的典型校准曲线。依次对粗提物中额外添加的 Mg-谷氨酸盐、K-谷氨酸盐和 DTT 水平进行校准。图中显示了反应 8 小时后的终点荧光值，以及基于 12 分钟滑动平均计算的蛋白质生成最大速率。根据这些曲线，额外添加的 Mg-谷氨酸盐适宜范围为 4 mM，K-谷氨酸盐为 60–80 mM，DTT 为 0–3 mM。请注意，每批粗提物均需针对这三个变量独立校准。b) 不同批次提取物之间的差异。图中显示了在不同日期制备的两批粗提物的终点荧光值；误差条表示在不同日期进行的三次独立实验的标准差。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/50762fig4large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看高清大图</a>。
<img alt="纯化方法比较；柱状图；蛋白质分析；最大强度；Tris-Cl 浓度研究。" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig5.jpg" data-altupdatedat="1762215414000" data-alt="图 5"> 
图 5. DNA 溶液对表达效率的影响。a) 两种不同质粒纯化方法的比较。使用仅 QiaPrep Spin Miniprep 试剂盒（纯化方法 1）或在此基础上追加 QiaQuick PCR 纯化试剂盒处理（纯化方法 2）制备 1 nM 的 pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500。图中显示反应 8 小时后的终点荧光强度，以及基于 12 分钟滑动平均计算的最大蛋白质合成速率。误差线表示在不同日期进行的四次独立实验的标准差。b) 洗脱缓冲液（Tris-Cl）的影响。在无细胞表达反应中比较不同浓度 Tris-Cl 对 1 nM pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 表达的影响。图中所示为反应体系中 Tris-Cl 的终浓度；所用洗脱缓冲液为 10 mM Tris-Cl。误差线表示在不同日期进行的三次独立实验的标准差。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/50762fig5large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看高清大图</a>。
<img alt="PCR 准备表格、DNA 载体图谱以及显示有无 aTc 时随时间变化的蛋白质表达荧光强度图。" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig6.jpg" data-altupdatedat="1762173717000" data-alt="图 5"> 
图 6. 负反馈回路的典型 TX-TL 实验结果。a) 无细胞表达反应的典型设置。比较负反馈回路的“开启”与“关闭”状态，并包含阳性和阴性对照。b) 负反馈回路的质粒图谱。c) 代表性实验结果。数据来源于 a) 和 b) 所示实验，信号已扣除阴性对照值。插图显示所用基因线路。误差条表示在不同日期进行的三次独立实验的标准差。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/50762fig6large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看高清大图</a>。
<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>名称</td>
 <td>浓度</td>
 <td>用量</td>
 <td>灭菌方式</td>
 <td>备注</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>氯霉素 (Cm)</td>
 <td>34 mg/ml（溶于乙醇）</td>
 <td>1 ml</td>
 <td>过滤灭菌 (0.22 μM)</td>
 <td>可配制较大体积，于 -20 °C 保存以备后续使用。</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>含P和氯霉素的2xYT琼脂平板 (2xYT+P+Cm 琼脂平板)</td>
 <td>31 g/L 2xYT，40 mM 磷酸氢二钾，22 mM 磷酸二氢钾，34 μg/ml 氯霉素</td>
 <td>1 个平板</td>
 <td>高压灭菌</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>含P的2xYT培养基 (2xYT+P 培养基)</td>
 <td>31 g/L 2xYT，40 mM 磷酸氢二钾，22 mM 磷酸二氢钾</td>
 <td>4 L</td>
 <td>高压灭菌</td>
 <td></td>
 </tr>
</tbody>
</table>
表1. 粗提细胞提取物方案第1天所用试剂。
<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>名称</td>
 <td>浓度</td>
 <td>用量</td>
 <td>灭菌方式</td>
 <td>备注</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris 碱</td>
 <td>2 M</td>
 <td>250 ml</td>
 <td>过滤灭菌（0.22 μM）或高压灭菌</td>
 <td>可于室温保存。</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DTT</td>
 <td>1 M</td>
 <td>6 ml</td>
 <td>过滤灭菌（0.22 μM）</td>
 <td>可配制较大体积，分装后于 -20 °C 保存以备后续使用。</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>S30A 缓冲液</td>
 <td>14 mM 谷氨酸镁，60 mM 谷氨酸钾，50 mM Tris，pH 7.7</td>
 <td>2 L</td>
 <td>高压灭菌</td>
 <td>使用醋酸滴定至 pH 7.7。使用前加入 DTT 至终浓度为 2 mM。4 °C 保存。</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>S30B 缓冲液</td>
 <td>14 mM 谷氨酸镁，60 mM 谷氨酸钾，约 5 mM Tris，pH 8.2</td>
 <td>2 L</td>
 <td>高压灭菌</td>
 <td>使用 2 M Tris 滴定至 pH 8.2。使用前加入 DTT 至终浓度为 1 mM。4 °C 保存。</td>
 </tr>
</tbody>
</table>
表2. 粗提细胞提取物方案第二天所用试剂。
<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td colspan="4">Falcon</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>1</td>
 <td>2</td>
 <td>3</td>
 <td>4</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>空的 50 ml Falcon（g）</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>含有沉淀的 50 ml Falcon（g）</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>沉淀质量 （含沉淀的 50 ml Falcon - 空的 50 ml Falcon）（g）</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>需加入的 S30A 缓冲液体积 （沉淀质量 × 0.9）（ml）</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>需加入的磁珠总质量 （沉淀质量 × 5.0）（g）</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
</tbody>
</table>
表3. S30A缓冲液和珠质量计算器，用于粗提细胞提取物方案的第3天。
<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>名称</td>
 <td>浓度</td>
 <td>体积</td>
 <td>灭菌方式</td>
 <td>备注</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HEPES</td>
 <td>2 M, pH 8</td>
 <td>4 ml</td>
 <td>无需灭菌</td>
 <td>调节 pH 至 8，需用 KOH 滴定。</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>核苷酸混合液</td>
 <td>156 mM ATP 和 GTP，94 mM CTP 和 UTP，pH 7.5</td>
 <td>1.5 ml</td>
 <td>无需灭菌</td>
 <td>调节 pH 至 7.5，需用 KOH 滴定。</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>tRNA</td>
 <td>50 mg/ml</td>
 <td>600 μl</td>
 <td>无需灭菌</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CoA</td>
 <td>65 mM</td>
 <td>600 μl</td>
 <td>无需灭菌</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NAD</td>
 <td>175 mM，pH 7.5–8</td>
 <td>300 μl</td>
 <td>无需灭菌</td>
 <td>调节 pH 至 7.5–8，需用 2 M Tris 滴定。</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>cAMP</td>
 <td>650 mM，pH 8</td>
 <td>200 μl</td>
 <td>无需灭菌</td>
 <td>调节 pH 至 8，需用 2 M Tris 滴定。</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>亚叶酸</td>
 <td>33.9 mM</td>
 <td>300 μl</td>
 <td>无需灭菌</td>
 <td>尽管仅需 300 μl，补充材料中的配方为 1.15 ml。</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>亚精胺</td>
 <td>1 M</td>
 <td>150 μl</td>
 <td>无需灭菌</td>
 <td>4 °C 保存，加热至 37 °C 溶解。</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>3-磷酸甘油酸（3-PGA）</td>
 <td>1.4 M，pH 7.5</td>
 <td>3.2 ml</td>
 <td>无需灭菌</td>
 <td>调节 pH 至 7.5，需用 2 M Tris 滴定。</td>
 </tr>
</tbody>
</table>
表4. 能量溶液制备方案所需试剂。
 附录材料 1. 物品配方。 
氯霉素，34 mg/ml：取0.51 g氯霉素，加入乙醇至15 ml。经滤膜（0.22 μm）过滤除菌，分装至1 ml离心管中，于-20 °C保存备用。
 2xYT+P+Cm 琼脂平板：称取 1.24 g 2xYT、1.6 ml 1 M 磷酸氢二钾溶液、0.88 ml 1 M 磷酸二氢钾溶液、0.6 g 琼脂，加水至 40 ml。高压灭菌。冷却至 50 °C 后加入 40 μl 氯霉素（Cm）。分装 25 ml 至 100 x 15 mm 培养皿中，静置冷却 1 小时。
 2xYT+P 培养基： 配制 124 g 2xYT、160 ml 1 M 磷酸氢二钾溶液、88 ml 1 M 磷酸二氢钾溶液，并加水至 4 L。分装为 2 份 1.88 L 和 1 份 0.24 L。高压灭菌。 
 Tris 碱，2 M：称取 60.57 g Tris 碱，加水至 250 ml。灭菌后室温保存备用。
 DTT，1 M：称取 2.31 g DTT，加水至 15 ml。过滤除菌（0.22 μM），分装至 1 ml 离心管中，-20 °C 保存备用。
 S30A 缓冲液：称取 10.88 g 谷氨酸镁和 24.39 g 谷氨酸钾，加入 50 ml 2 M Tris 溶液，用乙酸调节 pH 至 7.7，加水定容至 2 L。121 °C 高压灭菌，4 °C 保存，使用前加入 4 ml 1 M DTT。
 S30B 缓冲液：称取 10.88 g 谷氨酸镁和 24.39 g 谷氨酸钾，加入 2 M Tris（调至 pH 8.2），加水定容至 2 L。经高压灭菌后，4 °C 保存，使用前加入 2 ml 1 M DTT。
 HEPES：取1.91 g HEPES（分子量238.21），用KOH调节pH至8，并加水至4 ml。
 tRNA： 准备 30 mg tRNA 并加水至 600 μl。
 CoA： 准备 30 mg 的 CoA（分子量 767.53）并加水至 600 μl。
 NAD：加入34.83 mg NAD（分子量663.43）、2 M Tris（调至pH 7.5–8）以及水，定容至300 μl。（加入27 μl 2 M Tris以将溶液调至pH 7.5–8）。
 cAMP：加入 42.80 mg cAMP（分子量 329.22）、2 M Tris（调至 pH 8）和水至终体积 200 μl。（加入 73 μl 2 M Tris 溶液以将 pH 调至 8）。
 亚叶酸（33.9 mM）：向20 mg亚叶酸钙盐固体（分子量511.5）中加入1.15 ml水。
 亚精胺（Spermidine）：取23.55 μl亚精胺（分子量145.25），加水至150 μl。先在37 °C短暂融化，然后在室温下配制。 
 3-磷酸甘油酸（3-PGA）：称取1.03 g 3-磷酸甘油酸（分子量230.02），加入2 M Tris（调至pH 7.5）和水，定容至3.2 ml（加入1.73 ml 2 M Tris溶液以调节pH至7.5）。
核苷酸混合物：加入145 mg三磷酸腺苷二钾盐二水合物（分子量619.4）、133 mg三磷酸鸟苷二钠盐（分子量567.14）、79.4 mg三磷酸胞苷二钠盐二水合物（分子量563.16）、82.6 mg三磷酸尿苷三钠盐二水合物（分子量586.12），加入15%稀释的KOH（调至pH 7.5），加水至1.5 ml。（加入353 μl 15%稀释的KOH使溶液pH达到7.5）。
补充材料 2. Bradford 测定法。
<ol>
<li>从 4 °C 取出 Bradford 试剂，置于室温下平衡。</li>
<li>配制 50 μl 浓度为 1 mg/ml 和 0.1 mg/ml 的 BSA 标准品。</li>
<li>配制 40 μl 来自步骤 1.47 的提取物的 20 倍稀释液。</li>
<li>向 7 个比色皿中各加入 800 μl 水。</li>
<li>配制标准曲线比色皿：0 mg/ml、1 mg/ml（10 μl 0.1 mg/ml BSA）、2 mg/ml（20 μl 0.1 mg/ml BSA）、4 mg/ml（4 μl 1 mg/ml BSA）、6 mg/ml（6 μl 1 mg/ml BSA）。</li>
<li>配制实验组比色皿：分别加入 2 μl 和 4 μl 样品。</li>
<li>向每个比色皿中加入 200 μl Bradford 试剂，用移液器充分混匀。室温孵育至少 10 分钟。</li>
<li>使用步骤 6.5 中的比色皿在 OD 595 nm 处测定标准曲线；若 r2 &lt; 0.95，则舍弃该标准曲线。</li>
<li>使用步骤 6.6 中的比色皿在 OD 595 nm 处测定提取物浓度。</li>
</ol>
补充材料 3. 缓冲液校准电子表格。
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/TXTL_e(template)_calibration_JoVE.xlsx" target="_blank"> 请参见 TXTL_e(template)_calibration_JoVE.xlsx</a>。
补充材料 4. 无细胞表达运行电子表格。
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/TXTL_JoVE.xlsx" target="_blank">参见 TXTL_JoVE.xlsx</a>。

本五日方案详细说明了从头开始创建和运行一种高效的内源性大肠杆菌（Escherichia coli）为基础的TX-TL无细胞表达系统所需的全部步骤、设备及补充软件。使用试剂时，该方案在8小时或更短时间内即可完成反应的设置、数据采集与处理。

用于合成生物学的基于 Escherichia coli 的 TX-TL 无细胞表达系统的实施方案

理想的无细胞表达系统理论上可在受控的体外平台中模拟体内细胞环境。1 这对于以受控方式表达蛋白质和基因线路，以及为合成生物学提供原型设计环境具有重要意义。2,3 为实现后一目标，保留内源性大肠杆菌（Escherichia coli）转录-翻译机制的无细胞表达系统，相较于基于T7 RNA聚合酶转录的系统，能够更准确地反映体内细胞动态。本文描述了一种高效、基于内源性大肠杆菌的转录-翻译（TX-TL）无细胞表达系统的制备与操作流程，该系统可产生与基于T7的系统相当的蛋白表达量，且成本较类似商业系统降低98%。4,5 缓冲液和粗细胞提取物的制备方法，以及三管式TX-TL反应的操作步骤均被详细说明。整个方案准备耗时五天，单次制备所得材料最多可用于3000次单独反应。制备完成后，每次反应从设置到数据采集与分析耗时不足8小时。可额外添加大肠杆菌外源的调控机制和转录元件，例如lac/tet阻遏蛋白和T7 RNA聚合酶。6 mRNA和DNA降解速率等内源性特性也可进行调整。7 TX-TL无细胞表达系统已成功应用于大规模线路组装、生物学现象探究，以及在T7和内源性启动子调控下表达蛋白质。6,8 配套的数学模型亦已建立。9,10 所得系统在合成生物学中具有独特应用价值，可作为原型设计平台，即“TX-TL生物分子试验板”。

本实验的总体目标是构建一种基于大肠杆菌的无细胞表达系统，称为转录-翻译（transcription-translation，TX-TL）系统。该目标通过首先制备TX-TL系统的三个初始组分来实现：粗制细胞提取物、氨基酸溶液和能量溶液。氨基酸溶液和能量溶液后续将被混合，以制备TX-TL缓冲液。第二步是校准粗制细胞提取物，以确定最佳的镁、钾和DTT浓度，从而在TX-TL反应中实现最高水平的表达。接下来，利用校准结果制备由缓冲液、粗制细胞提取物和DNA组成的三管TX-TL系统。最后一步是使用刚刚制备的试剂执行TX-TL反应。最终，TX-TL 可用于演示合成生物学回路以及传统的无细胞表达应用。该方法通过提供一个模拟体内环境的体外等效系统，有助于在合成生物学领域中测试回路。该技术的意义在于，通过消除所有原型设计步骤必须在体内进行的需求，显著加快合成生物学设计的进程。协助本操作的是本组的研究助理 Claire Hayes。请注意，本视频仅展示对拍摄至关重要的部分实验步骤。完整方案请参见配套的文字文章。在本实验方案的前期步骤中，细菌细胞已被培养并离心收集。现在将使用珠磨器裂解细菌细胞。所有含有细胞悬液的50毫升离心管均需置于冰上。本视频中，仅演示一个试管的珠磨过程。需将磁珠分三次等量加入 Falcon 管中，每次加入总量的三分之一。加入第一份磁珠后，涡旋震荡 30 秒，然后置于冰上。同样地，加入第二份等分的珠子，涡旋混匀，然后置于冰上。加入最后一份等分珠子并涡旋后，确保珠子均匀分散，第三次涡旋后应形成较厚的糊状物。将离心管置于冰上。使用无菌剪刀剪去一个五毫升移液器吸头的末端，以制备该吸头。通过将移液器调至两毫升，形成一个三到四毫米的开口。将20个无菌珠磨管置于冰上。使用改装后的移液器验证磁珠细胞溶液的高黏度。溶液应具有高黏性，几乎无法从移液器尖端流出。在排液过程中，将磁珠细胞溶液从Falcon管中取出，并转移至制珠管中。将溶液填充至四分之三满，在微型离心机中短暂离心。为去除气泡且不重新分布珠粒，继续向管中加入珠粒细胞溶液，形成凹形弯月面。接着，将极少量的珠粒细胞溶液滴加至珠粒包埋管盖内侧。注意不要将溶液沾到管盖外缘，否则珠子封闭管无法充分闭合。将管盖轻敲于平坦表面，并确认管盖底部无气泡存在。盖紧珠磨管。若操作正确，管盖应严密封闭。不应有可见气泡，且此后几乎不应有珠-细胞溶液溢出，高效完成珠磨过程需要两人配合操作。将装满的试管交给助手进行微珠包埋，同时第一位演示者继续用剩余的微珠细胞溶液填充更多的微珠包埋试管。取装满的微珠包埋试管并置于冰上。待收集到两支装满的微珠包埋试管且已在冰上放置至少一分钟后。将装有珠子的离心管在46 RPM条件下振荡30秒。振荡后立即将其倒置于冰上30秒，同时对另一管进行振荡。重复珠子振荡与冰上放置步骤，使每根装有珠子的离心管总振荡时间达到1分钟。处理完所有装满珠子的珠磨管后，使用一个15毫升离心管构建过滤装置。首先，将一个新的珠磨管盖子平面朝上放置于管底。然后取下已处理的珠磨管的盖子，并将微型层析柱牢固地压在已处理的珠磨管末端，直至完全密封。折断微型层析柱的流穿端，并将流穿端朝下放入一个空的珠子收集管中。将此组合放入15毫升离心管中。为所有装有珠子的珠磨管构建过滤装置，并将其置于冰上。离心完成后，将过滤装置中的Falcon管去盖，在4°C、6,000 G条件下离心5分钟，以分离提取物和沉淀物与珠子。离心后，确认每根珠磨管均已产生可用的提取物。充分振荡后的提取物不应浑浊，且沉淀应呈现两个明显分层，如左侧试管所示。如右侧示例所示的浑浊试管必须弃去。将非浑浊试管中的上清液转移至各个1.75毫升微量离心管中，尽可能避免带入沉淀。所有珠子装填管处理完毕前，始终置于冰上。随后，离心微型离心管，收集上清液。将500微升无沉淀的上清液合并至新的珠子装填管中。将离心管去除管盖后，在 220 RPM 和 37 摄氏度条件下孵育 80 分钟。此步骤将利用珠磨过程中释放的内源性外切核酸酶降解残留的核酸。孵育完成后，提取物应呈现浑浊状态。将提取物收集至1.75毫升微量离心管中，每管不超过1.5毫升，在4°C下以12,000 G离心10分钟。使用移液器将不含沉淀的上清液收集到冰上的1.75毫升微量离心管（用于较小产量）或15毫升Falcon管（用于较大产量）中。盖紧管盖，并通过倒置充分混匀。将10微升上清液置于冰上保存，用于后续测定蛋白浓度。确定所获得提取物体积总量，并将所需数量的10 kDa分子量截留透析盒浸入S30B缓冲液中2分钟以进行水化。每透析盒中加入最多2.5毫升提取物。每个烧杯最多可容纳两个盒式组件，在 4°C 下透析搅拌三小时。透析后的处理步骤请参见书面文章。一个基本的转录翻译反应包含三个部分：粗细胞提取物、缓冲液和 DNA。尽管反应体系的体积可以有所变化，本方案采用预先编写好的模板来进行10微升的反应。紫色部分表示需要用户输入的数值，蓝色部分表示需额外添加到反应中的试剂，请在“主混合液制备”部分和“DNA制备”部分中进行实验设计。通常可将恒定组分填入主混合液制备部分，而将可变组分填入DNA制备游戏副本。尽量减少每次实验的样本数量，以避免样本蒸发和实验起始时间偏差。本表展示了样本设置示例。为准备每个样本的DNA，需将指定的DNA、水及用户自备物品加入微量离心管中进行分装。在室温下配制主混合液，包含缓冲液、粗提物以及任何用户提供的全局添加物，配制过程中保持冰浴并涡旋混匀。每加入一种组分后，将适量的主混合液加入各DNA样品中，并于室温下放置。以此作为反应的起始时间。将每个样品涡旋混匀，并在室温下以10,000 G离心30秒，以收集残留样品并减少气泡。在384孔板中于29摄氏度下进行反应。运行时间根据实验而异，但通常少于八小时。实验运行结束后，可通过酶标仪读取数据。本文介绍了一种为期五天的内源性大肠杆菌（e coli）转录翻译（TXTL）无细胞表达系统的制备方案。该系统的表达条件通过测试不同质粒处理方法和elucian缓冲液的影响进行了优化。引入TXTL系统的某些变量应预先校准其毒性，例如，在质粒处理方法的比较中，纯化方法一仅使用kaya prep spin质粒小提试剂盒，而纯化方法二则先使用相同的质粒小提试剂盒制备质粒，随后用kayak Quick PCR纯化试剂盒进行后续处理。该图显示了八小时后的终点荧光值，以及基于12分钟滑动平均计算的最大蛋白生产速率，误差条表示在不同日期进行的四次独立实验的标准差。观察到的表达差异源于盐含量的不同。然而，其他成分可能对 TXTL 无影响，例如 elucian 缓冲液。通过基于一阿摩尔质粒表达的无细胞表达反应，比较了不同浓度的 TS 氯化物。所给出的浓度为三氯甲烷的终浓度。反应中使用的鲁米那缓冲液为10毫摩尔三氯甲烷，误差线表示在不同日期进行的三次独立实验的标准差。该图显示了粗细胞提取物的典型校准曲线，已针对额外的谷氨酸镁、谷氨酸钾和DTT水平进行了校准。八小时后的终点荧光强度，以及基于12分钟滑动平均值计算的蛋白质生成最大速率如图所示。请注意，每批粗制细胞提取物均需针对这三个变量独立校准。总体而言，结果表明粗制细胞提取物对谷氨酸镁水平最为敏感，其次为谷氨酸钾水平。根据这些图示，额外添加的谷氨酸镁的适宜范围为 4 毫摩尔，谷氨酸钾为 60 至 80 毫摩尔，DTT 为 0 至 3 毫摩尔，倾向于较低水平。每批粗制细胞提取物的最终效率可能因操作人员熟练程度和环境条件而异。尽管典型的产量差异在 5% 至 10% 之间，此处展示了在不同日期制备的两批粗制提取物的终点荧光值。误差线表示在不同日期进行的三次独立实验的标准差。为验证无细胞表达系统，构建了一个基于Tet抑制的负反馈回路，并在有无TC的条件下测试了同一电路，结果显示终点表达量相差七倍。表达八小时后D-E-G-F-P报告基因的变化，误差线表示在不同日期进行的三次独立实验的标准差。遗传回路如插图所示。该最终图示展示了不同粗提物在成本和表达水平上的分析结果。图a中的饼状图根据2012年12月的试剂成本和每小时14美元的人工成本，分解了TX-TL无细胞表达系统的材料与人工成本。图B比较了TX无细胞表达系统与其他商业系统的成本。成本按每微升计算，尽管各试剂盒的反应体积可能有所不同。该系统的材料成本约为每微升反应3美分，相较于类似的商业无细胞系统，成本降低了98%。图C展示了TX-TL无细胞表达系统与其他商业系统的产量比较。该系统使用基于Sigma 70并带有Lambda噬菌体操纵子的启动子或T7驱动的启动子，均可产生高达每毫升0.75毫克的报告蛋白。这些比较表明，TX-TL无细胞表达系统能够产生与T7系统相当的蛋白产量，同时相比类似的商业系统可降低巨大成本。我们希望这一技术能够为简化合成生物学中的工程化过程铺平道路。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

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