Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

该程序的总体目标是创建一个基于大肠杆菌的无细胞表达系统，称为转录翻译或 TX tl。这是通过首先为 TX TL 粗细胞提取物、氨基酸溶液和能量溶液制备三种初始成分来实现的。氨基酸溶液和能量溶液稍后将混合制成 TX TL 缓冲液。

第二步是校准粗细胞提取物，以确定最佳镁、钾和 DTT 浓度，以产生具有最高表达水平的 TX TL 反应。接下来，使用校准结果制作由缓冲液粗细胞提取物和 DNA 制成的三管 TX TL 系统。最后一步是使用刚刚制备的试剂执行 TX TL 反应。

最终，TX TL 用于演示合成生物学电路以及传统的无细胞表达应用。该方法可以通过提供模拟体内的体外平等环境来帮助测试合成生物学领域的电路。这项技术的影响延伸到通过消除在体内进行所有原型设计步骤的需要来提高合成生物设计的速度。

协助手术的是 Claire Hayes，我们小组的研究助理。请注意，本视频将仅介绍对拍摄至关重要的协议的选定部分。完整的协议可在文本文章中找到。

在该方案的早期，细菌细胞生长并沉淀。现在将使用微珠打浆器裂解细菌细胞。将所有含有细胞悬液的 50 ml falcon 管保存在冰上。

在本视频中，将仅演示一根试管的微珠形成。必须将珠子间歇性地分三等分加入 Falcon 管中，每次使用总珠子的三分之一。将第一等分试样的珠子加入试管涡旋中 30 秒，然后置于冰上。

以同样的方式，加入第二份珠子，涡旋，然后放在冰上。加入最后一个等分试样并涡旋后，确保微珠均匀分布，在第三个涡旋步骤后应形成浓稠的糊状物。将试管放在冰上。

使用无菌剪刀剪掉末端，准备一个 5 毫升体积的移液器吸头。要创建 3 到 4 毫米的开口，请将移液器拨至 2 毫升。将 20 个无菌珠珠管放在冰上。

使用改良的移液器验证微珠细胞溶液的高粘度。它应该是粘稠的，几乎不会从移液器吸头中出来。在喷射过程中，从 Falcon 管中取出微珠细胞溶液，然后转移到微珠管中。

在微型离心机中非常短暂地将其装满四分之三完全旋转。为了去除气泡而不重新分布微珠，请完成将微珠细胞溶液添加到试管中以形成凹弯月面。接下来，在微珠串珠管盖内侧加入一小滴微珠细胞溶液。

小心不要将溶液放入瓶盖的外唇中。否则，珠子串珠管将无法充分闭合。在平坦的表面上轻敲盖子，并确认盖子底部没有气泡。

盖上打珠管。如果作正确，盖子应密封。不应看到气泡，并且从这里开始，任何微珠细胞溶液几乎不应溢出，需要两个人才能有效地完成微珠形成。

将装满的试管交给助手进行微珠微珠加工，同时第一个演示者继续用剩余的微珠细胞溶液填充更多的微珠微珠试管。取装满珠子的珠子管，将其放在冰上。收集两个装满珠子的珠子管并在冰上放置至少一分钟后。

开始以 46 RPM 的速度在一根试管中串珠 30 秒。将倒置在冰上 30 秒，同时敲打另一根管子。重复串珠和糖霜，使每个装满的串珠管都打浆总共一分钟。

处理完所有填充的珠串管后，从 15 毫升 falcon 管构建过滤装置。首先，添加一个新的珠子串珠帽扁平部分，正面朝上到管子的底部。然后从处理过的微珠管上取下盖子，将微量色谱柱牢固地压在处理过的珠珠管的末端，直至完全密封。

折断微量色谱柱的 elucian 端并将其置于 elucian 上。末端向下进入空的珠子串珠管中。将此复合物放入 15 mL的猎鹰管中。

为所有填充的珠子打浆管构建过滤装置，并将它们保存在冰上。完全离心后，过滤装置 Falcon 管在 6， 000 G 下在 4 摄氏度下开盖 5 分钟，以从珠子中分离提取物和沉淀。离心后，验证每个微珠串珠管是否产生了可行的提取物。

正确打散的提取物不会浑浊，颗粒将具有两个不同的层，如左边的管子所示。必须丢弃右侧示例中所示的混浊管。将上清液从 non turid 试管转移到单独的 1.75 ml 微量离心管中，尽可能少地沉淀。

保持冰上，直到所有珠子串珠管都处理完毕。接下来，旋转微量离心管并收集上清液。将 500 μL 无沉淀上清液整合到新的微珠管中后。

220 RPM 和 37 摄氏度下取下盖子的试管孵育 80 分钟。这将使用微珠串珠过程中释放的内源性核酸外切酶消化剩余的核酸。孵育完成后，提取物看起来应该很浑浊。

将提取物固格在 1.75 毫升微量离心管中，每管最多 1.5 毫升，在 4 摄氏度下以 12， 000 G 离心 10 分钟。使用移液器将无沉淀上清液合并到 1.75 mL 微量离心管中以获得较小的产量，或将 15 mL的 falcon 管合并到 15 mL的 falcon 管中以获得更高的冰上产量。盖上试管并倒置充分混合。

在冰上保存 10 微升上清液，以便以后测量蛋白质浓度。测定产生的提取物总量，并将 S 30 B 缓冲液浸入 2 分钟，以水合必要数量的 10 个截留分子量透析盒。用最多 2.5 mL 的提取物加载包埋盒。

每个烧杯最多可容纳两个透析盒，在 4 摄氏度下透析搅拌 3 小时。有关透析后的处理步骤，请参阅书面文章。基本的转录翻译反应由三个部分组成，粗细胞提取物、缓冲液和 DNA。

尽管反应体积可能不同，但该方案利用预先编写的模板进行 10 μL 反应。这里。紫色项目表示用户输入值，蓝色项目表示使用预混液制备部分和 DNA 制备部分在硅烷中添加到反应设计实验中的其他试剂。通常，常数可以放入预混液制备部分，而变量可以放入 DNA 制备部分。

尽量减少每次实验的样品，以避免样品蒸发和实验开始时间偏差。此表显示了示例设置。为了为每个样品制备 DNA 样品，ID 将指定的 DNA 水和用户提供的物品分装到微量离心管中。

在室温下，制备由缓冲液提取物和任何全局用户提供的物品组成的预混液，这些物品保存在冰上并涡旋。添加每个项目后，向每个 DNA 样品中加入适量的预混液，并在室温下保存。将此视为反应开始时间。

旋每个样品，并在室温下以 10， 000 G 离心 30 秒，以降低残留样品并减少气泡。在 29 摄氏度的 384 孔板中运行反应。运行时间因实验而异，但通常持续不到 8 小时。

运行完成后，可以从读板器读取数据。本文提出了一种为期五天的方案，用于制备基于内源性大肠杆菌的转录翻译或 TXTL 无细胞表达系统。通过测试不同质粒加工方法和 Elucian 缓冲液的效果，优化了该系统的表达条件。

引入 TXTL 系统的某些变量应事先校准毒性，例如，在质粒加工方法的比较中，纯化方法一仅使用 kaya prep spin 小量制备试剂盒，而在纯化方法二中，质粒使用相同的小量制备试剂盒制备，然后用皮划艇进行后处理。快速 PCR 纯化试剂盒。该图显示了 8 小时后的终点荧光以及基于 12 分钟移动平均误差线的最大蛋白质生成速率，误差线是来自不同日期的四次独立运行的一个标准差。

观察到的表达差异是由于盐含量的差异。但是，其他项目可能对 TXTL 没有影响，例如 elucian 缓冲液。在无细胞表达反应中，根据一种无摩尔质粒的表达比较不同浓度的 TS 氯化物。

给出的浓度是 tris chloride 的最终浓度。在反应中使用的 elucian 缓冲液是 10 毫摩尔三氯化物误差线是来自不同日期的三次独立运行的一个标准差。该图显示了粗细胞提取物的典型校准图，针对额外的谷氨酸镁、谷氨酸钾和 DTT 水平进行了校准。

显示了 8 小时后的终点荧光以及基于 12 分钟移动平均值的最大蛋白质生成速率。请注意，每个粗细胞提取物都需要针对这三个变量进行独立校准。一般来说，结果表明，粗细胞提取物对谷氨酸镁水平最敏感，其次是谷氨酸钾水平。

根据这些图，额外谷氨酸镁的可接受范围是 4 毫摩尔，谷氨酸钾是 60 至 80 毫摩尔，DTT 是 0 至 3 毫摩尔的下侧晾空。每种粗细胞提取物制备的最终效率可能因用户熟练程度和环境条件而异。尽管典型的产量差异在 5% 到 10% 之间，但此处显示了在不同日期制备的两种粗提取物的终点荧光。

误差线是来自不同日期的三个独立运行的一个标准差。为了证明无细胞表达系统，构建了一个基于 Tet 抑制的负反馈回路，并在有和没有 TC 的相同电路运行中测试显示七倍终点表达。表达误差线 8 小时后 D-E-G-F-P 报告基因的变化是来自不同日期的 3 次独立运行的 1 个标准差。

遗传回路显示在插图中。最终图描述了竞争性粗细胞提取物的成本和表达分析。a 中的饼图根据截至 2012 年 12 月的试剂成本和每小时 14 的人工成本细分了 TX TL 无细胞表达系统的人工和材料成本。

图 B 比较了 TX 无细胞表达系统与其他商业系统的成本。成本按每微升计算，但每个试剂盒的反应体积可能不同。该系统的材料成本约为每微升反应 3 美分，与同类商用无细胞系统相比，成本降低了 98%。

图 C 显示了 TX TL 无细胞表达系统产量与其他商业系统的比较。该系统使用基于 Sigma 70 的启动子和 Lambda 噬菌体纵子或 T 7 驱动的启动子，可产生高达 0.75 毫克/毫升的报告蛋白。这些比较表明，TX TL 无细胞表达系统可以产生等量的蛋白质，因为基于 T 7 的系统为类似的商业系统增加了巨大的成本降低。

我们希望这项技术为简化合成生物学的工程过程铺平道路。