2013年12月10日
人类呼吸道合胞病毒(HRSV)可导致婴幼儿严重支气管炎。严重HRSV疾病的发病机制的一部分是由宿主免疫反应引起的。用HRSV刺激人类初级免疫细胞提供了一个快速且可重复的模型系统,用于研究炎症通路的激活和感染。
本程序的总体目标是研究人类免疫细胞对呼吸道合胞病毒或RSV感染的反应。这是通过首先在hel细胞上培养传染性RSV种子完成的。在第二步中,通过超速离心纯化培养的RSV种子。
接下来,通过密度离心分离原代人血液免疫细胞。在最后一步中,通过病毒刺激分离的免疫细胞。最终,可以通过E iza QPCR或流式细胞术评估RSV感染的细胞免疫反应。
这种技术是研究呼吸道合胞病毒感染的宝贵补充。RSV对人类具有高度适应性。因此,使用人类免疫细胞研究病毒发病机制中涉及的炎症途径很重要。
虽然本视频中使用的病毒是RSV,但这种方法也可以轻松地调整以研究其他病毒,如流感病毒或鼻病毒。首先在37摄氏度水浴中加热一瓶人类RSV种子。当病毒融化后,将种子在每个瓶中的四毫升感染培养基中稀释。
保持MOI为0.1或以下,将病毒添加到hel细胞中,并尽可能少的总体积,以免细胞干燥。然后在37摄氏度和5%CO2下孵育培养物两到四小时,每15分钟摇动一次瓶子以重新分布培养基。接下来,去除接种物并用PBS洗涤细胞一次。
然后向瓶中添加15毫升培养基,并在相同的培养条件下孵育三到五天。每天在正常明场显微镜下观察细胞,以观察病毒诱导的细胞病理学变化。当观察到这些变化时,刮取细胞以收获RSV,然后将悬液收集在无菌的50毫升管中,皮质细胞,然后在室温下以1800 Gs离心10分钟以盘旋细胞碎片。
RSV在此速度下不会形成盘,因此可以将上清液在零下80摄氏度存储为一毫升的接种种子。始终快速冷冻RSV和液氮中的未来使用的配料,以防止传染性病毒颗粒的损失。要纯化RSV,首先在超速离心机的每个桶中放置一个无菌离心管。
然后向每个管的底部添加五毫升新鲜制备的过滤灭菌的蔗糖溶液。接下来,非常慢地在蔗糖溶液上方添加30毫升RSV溶液,注意不要扰动蔗糖溶液并保持层次分明。然后在流动柜中以保持无菌状态,将六个超速离心桶小心地平衡,使它们与无菌PBS的差值在0.1克以内,包括盖子。以20, 000 RCF和四摄氏度的速度将病毒旋转1.5小时。
然后当旋转完成时,使用无菌镊子小心地从桶中取出离心管。病毒颗粒将通过蔗糖层形成盘。将离心管倒入病毒废液瓶中,让管在无菌表面上倒置滴干。
不要让盘完全干燥。接下来小心地让一毫升HPSS流过盘,并再次倒置离心管以滴干HPSS。然后再次将管子倒置,小心不要让盘干燥。
现在在另一毫升HBSS中将盘三次轻轻地搅拌40次,注意避免气泡形成,因为这会破坏病毒。然后在液氮中快速冷冻病毒的配料。将病毒存储在零下80摄氏度直到定量和进一步使用。从健康志愿者的10毫升EDTA管中获得血液后,将血液稀释至室温PBS,最多稀释至50毫升管中的35毫升稀释血液。
接下来,将无菌锁定针连接到无菌50毫升注射器上,然后将密度梯度介质吸入注射器中。将针头放在稀释血液管的底部,并小心地在血液下方移入15毫升密度梯度介质,保持密度梯度和血液之间的清晰界限。现在在室温下以最大加速度分离细胞20分钟,在800 GS下以断开后分离。分离后,红细胞位于管底的盘上,顶部有银色的中性粒细胞层。
盘上方的清晰层包含密度梯度介质,而在密度梯度介质和血浆层之间的薄层包含pbmc。使用糊状移液器小心地收集pbmc,然后将细胞转移到冰上的新50毫升管中。加入冰冷的PBS至50毫升体积,并在旋转完成时将细胞盘旋。
吸取上清液,并在第二次洗涤后用50毫升冰冷的PBS洗涤盘两次,将一毫升冰冷的介质加入到盘上,计算细胞数量,并将细胞浓度调整为每毫升五倍10的六个pbmc。为了刺激pbmc活的RSV,首先将100微升pbmc加入96孔圆底板的每个孔中。然后向每个孔中加入50微升两种新鲜稀释的刺激物。
在37摄氏度和5%CO2下孵育板24小时,然后离心板,收集上清液以供后续通过Eliza分析。盘上的刺激pbmc可以通过QPCR分析或用于流式细胞术染色。在进行A-P-B-M-C刺激实验时,建议使用此方法的刺激分数方法。
条件分为标准刺激条件,如RPMI或人RSV和测试分数条件,如mial,二肽或LPS。重要的是,每个实验中始终包含负对照,如单独的RPMI和正对照,如LPS。在刺激RSV 24小时后,不同的P
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This study investigates the response of human immune cells to respiratory syncytial virus (RSV) infection, which is known to cause severe bronchiolitis in infants. The research utilizes a model system to explore the activation of inflammatory pathways triggered by the virus.