Name: 研究人外周血单核细胞对人呼吸道合胞病毒感染免疫反应的体外模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-10T21:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: 了解人外周血单核细胞对人呼吸道合胞病毒感染的免疫反应机制。本方法利用密度梯度离心分离原代人免疫细胞，并通过ELISA、qPCR或流式细胞术评估炎症通路激活，为研究RSV发病机制提供可靠的体外模型。

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RSV A2 由荷兰鹿特丹伊拉斯姆斯医学中心（Erasmus MC）的 R. de Swart 博士惠赠。MV 和 GF 得到了由荷兰政府项目编号 FES0908 资助的 Virgo 联盟以及荷兰基因组倡议（Netherlands Genomics Initiative，NGI）项目编号 050-060-452 的支持。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决定或稿件撰写过程中均未发挥任何作用。

注意：
HRSV 实验必须在生物安全二级实验室的生物安全柜中进行。由于存在生物危害，所有病毒废弃物及接触过病毒的材料均需收集并妥善处理。
使用可能被感染的人类血液时，必须采取特殊预防措施。
在整个实验方案中，必须使用无内毒素的试剂。
1. 人呼吸道合胞病毒 A2 株的培养
<ol>
	<li>在含有10%胎牛血清（FCS）和1%青霉素/链霉素（P/S）的DMEM培养基中培养HeLa或HEp-2细胞，置于175 cm²培养瓶中2 培养瓶中的细胞直至其汇合度达到约50%。</li>
	<li>用室温磷酸盐缓冲液洗涤细胞三次 (PBS</li>
	<li>解冻一管含有HRSV接种病毒储备液的冻存管 37 °C 在水浴中。将病毒原液稀释至感染复数（MOI）为0.1或更低，以防止产生缺陷性干扰颗粒（DIPs）。用4 ml/瓶感染培养基（DMEM + 1% P/S）稀释病毒原液，并加入HeLa或HEp-2细胞中。保持该体积尽可能低，但避免细胞干燥。体积越低，感染率越高。</li>
	<li>孵育2-4小时 37 °C，5% CO2每15分钟轻轻摇动一次锥形瓶，以重新分布培养基。</li>
	<li>移除接种物，用 PBS 洗涤一次。</li>
	<li>加入15 ml培养基（DMEM + 10% FCS + 1% P/S），于3–5天内孵育 37 °C，5% CO₂2在普通明场显微镜下观察细胞，检测病毒诱导的细胞病理学变化。 例如 合胞体形成、细胞死亡及悬浮细胞。</li>
	<li>当出现细胞病变效应时，通过刮取细胞收获人呼吸道合胞病毒（HRSV），并将病毒悬液收集至无菌50 ml离心管中。振荡混匀细胞悬液。刮取和振荡细胞可释放更多的病毒颗粒。</li>
	<li>在室温下以 1,800 x g 离心病毒悬液 10 分钟，以沉淀细胞碎片。HRSV 在此转速下不会沉淀，上清液可直接用于感染多个 175 cm² 培养瓶2 烧瓶中或可储存于 -80 °C 作为后续使用的接种物，分装成每份1 ml。人呼吸道合胞病毒（HRSV）必须始终在液氮中速冻，以防止感染性病毒颗粒失活。</li>
	<li>如上所述，使用上述方案制备的接种物用于感染多个175 cm²培养瓶2 培养瓶。重复完全相同的实验步骤以制备更多用于纯化的病毒。单次超速离心可纯化最多180 ml的病毒悬液。</li>
	<li>当出现细胞病变效应时，通过刮取细胞收获人呼吸道合胞病毒（HRSV），并收集上清液。将病毒悬液涡旋混匀。在室温下以1,800 × g离心10分钟，使细胞碎片沉淀。HRSV在该转速下不沉淀，保留在上清液中，将上清液按每管15 ml分装至50 ml离心管中。速冻后于-80 °C保存80 °C 直至纯化完成。</li>
</ol>
2. 人呼吸道合胞病毒（HRSV）的纯化
注意：在使用超速离心机之前，需了解其为一种潜在危险的设备。请阅读操作手册，并在有经验人员的监督下进行首次超速离心操作。
<ol>
	<li>用70%乙醇清洁超速离心桶，并在生物安全柜中晾干。</li>
	<li>在每个离心桶中放置一个无菌离心管。</li>
	<li>配制30% (w/v) 蔗糖的PBS溶液，经0.2 μm滤器过滤除菌后，向每根离心管底部加入5 ml。为加快实验流程，可将含蔗糖溶液的离心管冷冻保存，注意保持无菌状态。</li>
	<li>若蔗糖溶液未冷冻，则需非常小心地将30 ml HRSV溶液缓慢加至蔗糖溶液上方，使用移液器时应缓慢操作，避免扰动蔗糖层，保持清晰的界面。若离心管已冷冻，则将病毒悬液倾注于冻结的蔗糖表面，随后让其自然融化。</li>
	<li>使用无菌PBS非常小心地平衡六个超速离心桶。将天平置于超净工作台内以维持无菌环境。加液至离管口下方3–5 mm处，防止离心过程中离心管塌陷。将离心桶平衡至质量差异不超过0.1 g，并确保包含螺口盖一起称重，以防盖子之间存在微小差异。</li>
	<li>在超速离心机中以20,000 rcf、4 °C离心1.5小时。</li>
	<li>使用无菌镊子小心从离心桶中取出离心管。病毒颗粒会穿过蔗糖层并形成沉淀，而细胞分泌的可溶性因子（e.g. 细胞因子）则保留在上清液中。倾斜离心管以去除全部液体，将其倒置在无菌表面上（e.g. 培养皿）晾干，但注意不要使沉淀完全干燥。</li>
	<li>向沉淀中小心加入1 ml Hank's平衡盐溶液（HBSS），轻轻倾斜离心管以去除HBSS。再次将离心管倒置在无菌表面上晾干，避免沉淀完全干燥。</li>
	<li>通过上下吹打40次，用1 ml HBSS重悬沉淀。操作时应尽量避免产生气泡，以免破坏病毒颗粒。</li>
	<li>将病毒分装，液氮速冻后于-80 °C保存备用。每次实验应使用新的分装病毒，反复冻融会降低病毒的感染滴度。解冻时始终在37 °C进行，因为HRSV在-20 至 15 °C之间稳定性较差。</li>
</ol>
3. 人呼吸道合胞病毒（HRSV）的定量
注意：为确保数据可重复，至少重复定量实验3次，每次设2个复孔。
3.1. A549 细胞的感染
<ol>
	<li>在24孔板中培养A549细胞至汇合。</li>
	<li>用1 ml PBS在室温下洗涤A549细胞两次。</li>
	<li>在低血清培养基中制备HRSV的5倍系列稀释液。加入 100 μl 将稀释后的病毒液加入两孔中。至少进行4次稀释（例如 4倍、20倍、100倍和500倍）。另设两个接种最高病毒剂量的孔（用于同型对照），以及两个模拟感染孔。</li>
	<li>将细胞在5% CO₂条件下孵育2小时2, 37 °C每15分钟轻轻摇动24孔板，以防止干燥。</li>
	<li>移除病毒悬液，用 1 ml 磷酸盐缓冲液在室温下洗涤细胞 1 次。</li>
	<li>配制4% (w/v) 牛血清白蛋白（BSA）于低血清培养基中。过滤除菌（0.2 μm 滤膜）并加入 500 μl 向每个孔中加入。</li>
	<li>在5% CO₂条件下孵育2, 37 °C 22 小时。</li>
</ol>
3.2. FACS 准备
<ol>
	<li>移除培养基，并用 1 ml 室温 PBS 洗涤细胞一次。</li>
	<li>每孔加入 200 μl 预热的胰蛋白酶（37 °C），在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 10 分钟。</li>
	<li>在显微镜下观察细胞是否脱落。若细胞已脱落，加入 800 μl DMEM + 10% FCS + 1% P/S 以中和胰蛋白酶，重悬细胞。</li>
	<li>将细胞转移至锥形、非组织培养处理的 96 孔板中，在室温下以 400 × g 离心 5 分钟，用 200 μl 冷 PBS 重悬沉淀。</li>
	<li>在 4 °C 下以 400 × g 离心 5 分钟，弃上清，用 200 μl 冷 PBS 重悬沉淀。</li>
	<li>在 4 °C 下以 400 × g 离心 5 分钟，弃上清，用 150 μl 冰冷的 80% 丙酮重悬沉淀。</li>
	<li>室温下固定细胞 15 分钟。</li>
	<li>在 4 °C 下以 400 × g 离心 5 分钟，弃上清，用 200 μl 冷 PBS + 0.1% BSA 重悬沉淀。</li>
	<li>在 4 °C 下以 400 × g 离心 5 分钟，弃上清，用 50 μl 抗-NP-RSV-FITC（以 PBS + 1% BSA 稀释至 1:50）或 50 μl IgG2 同型对照抗体-小鼠-FITC（同型对照，使用相同抗体浓度）重悬沉淀。</li>
	<li>从本步骤起，将样品管避光保存。在 4 °C 下孵育至少 1 小时，也可延长至过夜。</li>
	<li>加入 150 μl 冷 PBS + 0.1% BSA。</li>
	<li>在 4 °C 下以 400 × g 离心 5 分钟，弃上清，用 200 μl 冷 PBS + 0.1% BSA 重悬沉淀。</li>
	<li>在 4 °C 下以 400 × g 离心 5 分钟，弃上清，用 200 μl 冷 PBS + 0.1% BSA 重悬沉淀。将板置于冰上并避光，直至进行流式细胞术检测。</li>
	<li>使用流式细胞仪检测感染细胞。</li>
</ol>
3.3. FITC-50 计算
<ol>
	<li>使用流式细胞术分析软件，根据阴性对照（同型对照）设定阈值。选择伪彩色（Pseudocolor）图类型。绘制象限门，使阳性细胞位于Q3象限。两个同型对照中的假阳性率均应低于0.2%。</li>
	<li>将数据导出至电子表格软件，并为每个稀释度的FITC+细胞百分比建立数据表。对每个实验的每个数值，减去由同型对照测定的平均假阳性值。</li>
	<li>在统计分析软件中新建一个文件（XY散点图，单个X列和多个Y列）。将数据复制到该软件中：X = 稀释度，Y = 感染细胞百分比，n = 3，每个稀释度取两次测量的平均值。进行非线性回归分析，选择单相指数衰减统计模型。检查曲线是否良好拟合数据点，若不符合，则选择其他统计分析方法。</li>
	<li>将拟合曲线方程及参数值复制到电子表格软件中。计算Y = 50%时对应的X值。根据以下公式，通过计算在50%感染率稀释度下的FITC检测到的感染性颗粒数/毫升（FIP/ml），确定FITC-50值： 
	<img alt="FITC50计算公式；荧光强度测量方程示意图。" fo:src="/files/ftp_upload/50766/50766eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50766/50766eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="公式1"> 
	A = 每孔A549细胞的平均数量 
	B = 每孔用于感染的病毒体积（μl） 
	C = 达到50%感染率时的稀释度</li>
</ol>
4. 从健康志愿者血液中分离外周血单个核细胞（PBMC）
<ol>
	<li>在获得知情同意后，使用10 ml含EDTA的试管从健康志愿者体内抽取静脉血。10 ml血液可获得约107个外周血单个核细胞（PBMCs）。</li>
	<li>此后所有操作均须在生物安全柜中无菌进行。</li>
	<li>在50 ml离心管中，用室温磷酸盐缓冲液（PBS）将血液稀释至2倍体积。每支50 ml离心管中稀释后血液的最大总体积为35 ml。</li>
	<li>取一支50 ml无菌注射器，安装无菌鲁尔锁针头。吸取密度梯度介质至注射器中。将针头插入含稀释血液的离心管底部，缓慢将15 ml密度梯度介质注入稀释血液下方。确保密度梯度介质与血液之间有清晰的分界。</li>
	<li>在室温下以800 × g离心20分钟，加速度设为9（最大值），关闭刹车。离心结束后将离心机温度设置为4 °C。</li>
	<li>密度梯度离心后将形成多个层次：底部为红细胞沉淀，其上方有一层银白色层，含有中性粒细胞；沉淀上方的透明层为密度梯度介质；在密度梯度介质层与顶部血浆层之间有一薄层，含有PBMCs。</li>
	<li>用巴斯德吸管小心收集PBMC层，并将细胞转移至新的50 ml离心管中。此后所有PBMC操作均需置于冰上，并使用预冷的PBS。加入预冷PBS至50 ml体积，于4 °C以400 × g离心10分钟（刹车设为9）。</li>
	<li>吸弃上清液，将沉淀用50 ml预冷PBS重悬，于4 °C以400 × g离心10分钟，重复洗涤两次。</li>
	<li>最后一次弃去上清液后，加入1 ml预冷培养基（RPMI + 1% P/S），使用细胞计数板进行细胞计数。</li>
	<li>将细胞浓度调整至5 × 106 PBMCs/ml。</li>
</ol>
5. 使用活体人呼吸道合胞病毒刺激外周血单个核细胞
<ol>
	<li>准备实验装置；每种条件均需设置实验重复样本。</li>
	<li>将所有必要的刺激物用培养基（RPMI + 1% P/S）稀释。注意每孔最终体积为 200 μl，将加入 50 μl 刺激物，因此需配制 4 倍浓度的刺激原液。</li>
	<li>向圆底 96 孔板的每孔中加入 100 μl 上述细胞悬液（每孔含 5 × 105 PBMC）。</li>
	<li>向每孔加入 50 μl 稀释后的刺激物。可同时加入两种不同的刺激物，总体积为 200 μl；若仅需一种刺激物，则用培养基补足体积至 200 μl。</li>
	<li>将 96 孔板置于 37 °C、5% CO2 培养箱中孵育所需时间。对于大多数细胞因子，孵育 24 小时已足够。</li>
</ol>
6. 刺激信号的读取
<ol>
	<li>孵育结束后，在室温下以 450 × g 离心 96 孔板 5 分钟，使细胞沉降至孔底。</li>
	<li>收集上清液（最大体积为 180 μl），用于后续细胞因子分析（-20 °C 保存）或病毒生产（-80 °C 保存）。</li>
	<li>沉淀中存在的刺激后 PBMC 可通过加入裂解缓冲液进行 qPCR 或 Western blot 分析，也可选择对 PBMC 进行染色以用于流式细胞术分析。</li>
</ol>

<ol><li>Nair, H., Nokes, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+burden+of+acute+lower+respiratory+infections+due+to+respiratory+syncytial+virus+in+young+children%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Global burden of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children: a systematic review and meta-analysis.</a> Lancet. 375, 1545-1555 (2010).</li>
<li>Falsey, A. R., Hennessey, P. A., Formica, M. A., Cox, C., Walsh, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+syncytial+virus+infection+in+elderly+and+high-risk+adults%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Eng.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Respiratory syncytial virus infection in elderly and high-risk adults.</a> N. Eng. J. Med. , 352-1749 (2005).</li>
<li>Openshaw, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiviral+Immune+Responses+and+Lung+Inflammation+after+Respiratory+Syncytial+Virus+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Am.+Thorac.+Soc%22%5BJournal%5D)">Antiviral Immune Responses and Lung Inflammation after Respiratory Syncytial Virus Infection.</a> Proc. Am. Thorac. Soc. 2 (2), 121-125 (2005).</li>
<li>Openshaw, P. J., Tregoning, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+responses+and+disease+enhancement+during+respiratory+syncytial+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbio.+Rev%22%5BJournal%5D)">Immune responses and disease enhancement during respiratory syncytial virus infection.</a> Clin. Microbio. Rev. 18 (3), 541-555 (2005).</li>
<li>Villenave, R., Thavagnanam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+modeling+of+respiratory+syncytial+virus+infection+of+pediatric+bronchial+epithelium%2C+the+primary+target+of+infection+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">In vitro modeling of respiratory syncytial virus infection of pediatric bronchial epithelium, the primary target of infection in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (13), 5040-5045 (2012).</li>
<li>Tulic, M. K., Hurrelbrink, R. J., Prêle, C. M., Laing, I. A., Upham, J. W., Le Souef, P., Sly, P. D., Holt, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR4+polymorphisms+mediate+impaired+responses+to+respiratory+syncytial+virus+and+lipopolysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">TLR4 polymorphisms mediate impaired responses to respiratory syncytial virus and lipopolysaccharide.</a> J. Immunol. 179 (1), 132-140 (2007).</li>
<li>Vissers, M., Remijn, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+syncytial+virus+infection+augments+NOD2+signaling+in+an+IFN-%CE%B2-dependent+manner+in+human+primary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Respiratory syncytial virus infection augments NOD2 signaling in an IFN-β-dependent manner in human primary cells.</a> Eur. J. Immunol. 42 (10), 2727-2735 (2012).</li>
<li>Cherukuri, A., Patton, K., Gasser, R. A. Jr, Zuo, F., Woo, J., Esser, M. T., Tang, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adults+65+years+old+and+older+have+reduced+number+of+functional+memory+T+cells+to+respiratory+syncytial+virus+fusion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Vacc.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Adults 65 years old and older have reduced number of functional memory T cells to respiratory syncytial virus fusion protein.</a> Clin. Vacc. Immunol. 20 (2), 239-247 (2013).</li>
<li>Shafique, M., Wilschut, J., de Haan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+mucosal+and+systemic+immunity+against+respiratory+syncytial+virus+by+inactivated+virus+supplemented+with+TLR9+and+NOD2+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Induction of mucosal and systemic immunity against respiratory syncytial virus by inactivated virus supplemented with TLR9 and NOD2 ligands.</a> Vaccine. 30, 597-606 (2012).</li>
<li>Kwilas, S., Liesman, R. M., Zhang, L., Walsh, E., Pickles, R. J., Peeples, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+syncytial+virus+grown+in+Vero+cells+contains+a+truncated+attachment+protein+that+alters+its+infectivity+and+dependence+on+glycosaminoglycans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Respiratory syncytial virus grown in Vero cells contains a truncated attachment protein that alters its infectivity and dependence on glycosaminoglycans.</a> J. Virol. 83 (20), 10710-10718 (2009).</li>
<li>Treuhaft, M. W., Beem, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+interfering+particles+of+respiratory+syncytial+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Defective interfering particles of respiratory syncytial virus.</a> Infect. Immun. 37 (2), 439-444 (1982).</li>
<li>Korns Johnson, D., Homann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+and+improved+quantification+of+lymphocytic+choriomeningitis+virus+%28LCMV%29+titers+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Accelerated and improved quantification of lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) titers by flow cytometry.</a> PLoS One. 7 (5), e37337(2012).</li>
<li>Wurfel, M. M., Park, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+high+and+low+responders+to+lipopolysaccharide+in+normal+subjects%3A+an+unbiased+approach+to+identify+modulators+of+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Identification of high and low responders to lipopolysaccharide in normal subjects: an unbiased approach to identify modulators of innate immunity.</a> J. Immunol. 175 (4), 2570-2578 (2005).</li>
<li>Kimpen, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+syncytial+virus+and+asthma.+The+role+of+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Respiratory syncytial virus and asthma. The role of monocytes.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 163, 7-9 (2001).</li>
<li>Wang, S. Z., Forsyth, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interaction+of+neutrophils+with+respiratory+epithelial+cells+in+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Respirology%22%5BJournal%5D)">The interaction of neutrophils with respiratory epithelial cells in viral infection.</a> Respirology. 5 (1), 1-10 (2000).</li>
<li>San-Juan-Vergara, H., Sampayo-Escobar, V., Reyes, N., Cha, B., Pacheco-Lugo, L., Wong, T., Peeples, M. E., Collins, P. L., Castano, M. E., Mohapatra, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol-rich+microdomains+as+docking+platforms+for+respiratory+syncytial+virus+in+normal+human+bronchial+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Cholesterol-rich microdomains as docking platforms for respiratory syncytial virus in normal human bronchial epithelial cells.</a> J. Virol. 86 (3), 1832-1843 (2012).</li>
<li>Davidson, D., Zaytseva, A., Miskolci, V., Castro-Alcaraz, S., Vancurova, I., Patel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profile+of+endotoxin-stimulated+leukocytes+of+term+new+born%3A+control+of+cytokine+gene+expression+by+interleukin-10%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Gene expression profile of endotoxin-stimulated leukocytes of term new born: control of cytokine gene expression by interleukin-10.</a> Plos One. 8 (1), e53641(2013).</li>
</ol>

我们没有需要披露的内容。

本研究中，我们证明了用HRSV感染PBMC是一种快速且可靠的模型系统，可用于研究炎症通路。为了刺激PBMC，需要制备并定量HRSV病毒原液。
多种细胞系均易受人呼吸道合胞病毒（HRSV）感染。用于培养HRSV最常用的细胞系包括HEp-2、HeLa&#160;和Vero细胞。然而，我们不推荐使用Vero细胞培养HRSV，因为已有研究表明，在Vero细胞中培养HRSV会导致HRSV的G蛋白发生截短10。此外，由于存在产生缺陷型干扰颗粒（defective interfering particles, DIPs）的风险，进行病毒培养时应始终使用较低的病毒感染量11。缺陷型干扰颗粒是指缺失部分或全部基因组的病毒颗粒，因此无法独立引发感染，必须依赖完整的感染性病毒才能复制。由于其基因组较小，DIPs的复制效率高于完整病毒，可能导致大量非感染性颗粒的产生。这些DIPs无法通过依赖病毒复制的定量技术检测出来，但在免疫细胞刺激实验中可能被识别。因此，必须尽可能将DIPs的水平控制在最低。Treuhaft 等的研究表明，当使用0.1的感染...

人呼吸道合胞病毒（HRSV）是儿童下呼吸道感染最常见的病因。每年，有超过3300万名五岁以下儿童感染HRSV，导致超过300万例住院病例和近20万例死亡1。越来越多的证据表明，HRSV对老年人以及患有基础慢性疾病的成人也构成重大威胁2。
大多数婴幼儿感染HRSV后表现为轻微症状，类似于普通感冒，无需临床干预。然而，少数患者因重症毛细支气管炎需要住院治疗和机械通气。
HRSV 疾病发病机制的一部分是宿主对感染产生过度且不充分的免疫反应3,4。这一点可通过多项观察得到说明。病情最严重的时期通常出现在病毒感染达到高峰之后，更密切地与感染组织中的细胞浸润以及炎性细胞因子的释放相一致3。另一条证据来自20世纪60年代的甲醛灭活HRSV（FI-RSV）疫苗试验。该疫苗非但未能在婴幼儿中诱导保护作用，反而引发了过度的免疫反应，导致呼吸道疾病加重以及更高的发病率和死亡率。
为了研究人呼吸道合胞病毒（HRSV）感染的发病机制，已开发出多种模型。连续传代细胞系（如 HEp-2 和 A549）已被广泛用于体外研究 HRSV 感染。in vitro。上皮细胞是 HRSV 感染的主要靶细胞5，因此大量研究集中于这些细胞类型。然而，in vivo 的情况更为复杂，并不限于单一细胞类型。为了探究这些复杂的相互作用，已开发出多种动物感染模型用于研究 HRSV 的发病机制。迄今为止，已采用两种不同的策略，分别聚焦于异源（非人类）模型以及同源宿主-肺病毒模型。HRSV 的异源模型包括黑猩猩、绵羊、棉鼠和小鼠。在自然宿主中研究 RSV 感染时，分别使用牛 RSV 和肺病毒在牛和小鼠中进行研究。
尽管这些模型各自为疾病发病机制的研究提供了重要见解，但人呼吸道合胞病毒（HRSV）高度适应于人类宿主。因此，除了目前常用的细胞系和动物模型外，我们建议采用人原代外周血单个核细胞（PBMCs）作为HRSV刺激的模型。人PBMCs可来源于不同个体，有助于针对特定的研究问题开展研究，包括婴幼儿群体。6免疫功能低下者以及健康成人7 或老年个体8外周血单个核细胞（PBMCs）可用于研究感染的固有免疫特征以及针对病毒的适应性免疫应答。与人呼吸道合胞病毒（HRSV）疾病发病机制相关的重要炎症通路可在mRNA和蛋白质水平进行研究。此外，可通过流式细胞术检测病毒对（特定亚群）免疫细胞的感染情况。我们此前已利用该模型鉴定了HRSV感染与细菌配体胞壁酰二肽（MDP）协同作用在诱导促炎性细胞因子中的效应。7我们建议采用人原代PBMCs的HRSV刺激作为一种可靠、简便且快速的方法 体外 用于研究HRSV疾病发病机制中炎症通路的模型。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Lonza</td><td>BE17-516F</td><td>不含 Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;、Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 和酚红的 PBS</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14025-100</td><td>含钙、镁，不含酚红的 HBSS</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>31966-047</td><td>高糖 DMEM，含 GlutaMAX 和丙酮酸钠</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Invitrogen</td><td>72400054</td><td>RPMI 1640 培养基，含 GlutaMAX 和 HEPES</td></tr><tr><td>低血清培养基（Opti-MEM）</td><td>Invitrogen</td><td>51985-026</td><td>Opti-MEM I 低血清培养基，含 GlutaMAX</td></tr><tr><td>FCS</td><td>Greiner Bio-one</td><td></td><td>胎牛血清（FBS）</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7030</td><td>牛血清白蛋白</td></tr><tr><td>P/S</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>青霉素-链霉素溶液（液体）</td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Invitrogen</td><td>25300-054</td><td>0.05% 胰蛋白酶-EDTA（1×），含酚红</td></tr><tr><td>HeLa 细胞</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>A549 细胞</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7903</td><td>生物级蔗糖（BioXtra），&amp;ge;99.5%</td></tr><tr><td>IgG2 抗小鼠-FITC</td><td>BD Pharmingen</td><td>555057</td><td>小鼠 IgG2b κ FITC 同型对照</td></tr><tr><td>抗 RSV-NP-FITC</td><td>Abcam</td><td>ab25849</td><td>抗呼吸道合胞病毒抗体 [671]（FITC 标记）</td></tr><tr><td>密度梯度介质（Lymphoprep）</td><td>Axis-Shield</td><td>1114545</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 抗凝管</td><td>BD Biosciences</td><td>367525</td><td></td></tr><tr><td>丙酮</td><td>Merck Millipore</td><td>1000141000</td><td>分析纯丙酮</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;材料&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>离心管</td><td>Beckman Coulter</td><td>326823</td><td>薄壁聚丙烯离心管，38.5 ml，25 mm × 89 mm</td></tr><tr><td>SureSpin 630 转子（带 36 ml 吊篮）</td><td>Sorvall</td><td>79368</td><td>摆动式钛合金转子</td></tr><tr><td>Sorvall WX80 超速离心机</td><td>Sorvall</td><td>46900</td><td></td></tr><tr><td>CB 150l CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>Binder</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

一个 体外 研究人外周血单个核细胞对人呼吸道合胞病毒感染免疫应答的模型

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

人类呼吸道合胞病毒（HRSV）感染的疾病严重程度表现多样，从轻度感染到危及生命的细支气管炎不等。严重疾病发病机制的重要组成部分是增强的免疫反应，导致免疫病理损伤。	在此，我们描述了一种用于研究人类免疫细胞对HRSV感染免疫应答的实验方案。首先，我们介绍了HRSV的培养、纯化及定量方法。随后，我们描述了一种人类 体外 外周血单个核细胞（PBMC）经活体人呼吸道合胞病毒（HRSV）刺激的模型可用于研究多种可能影响疾病严重程度的参数，包括先天性和适应性免疫应答。这些应答可在转录和翻译水平进行检测。此外，可通过流式细胞术便捷地检测细胞的病毒感染情况。综上所述，利用活体HRSV刺激PBMC提供了一种快速且可重复的模型系统，用于探究HRSV诱导疾病的潜在机制。

本文所述的HRSV A2培养与纯化方法可获得每毫升2 × 107至2 × 108个经FITC-50定量的感染性病毒颗粒。显微镜分析结果（计数FITC染色的感染细胞，结果未显示）与FACS定量结果进行了比较（图1）。两种方法所得滴度相似，但FACS方法在不同实验间的标准偏差显著更低，且操作更为简便。
进行PBMC刺激实验时，我们推荐使用刺激物-组分法。该方法将实验条件分为刺激物条件和组分条件（图2）。刺激物条件为标准条件（例如 RPMI和HRSV），组分条件为测试条件（例如 RPMI、MDP和LPS）。每次实验均应包含阴性对照和阳性对照。本实验中，LPS为阳性对照，RPMI为阴性对照。当检测如TNFα和IL-1β等促炎性细胞因子时，LPS通常可用作阳性对照。刺激物-组分法可避免遗漏重要的对照条件。
刺激24小时后，外周血单个核细胞（PBMC）中不同细胞类型的感染率呈现剂量依赖性（<s...

人呼吸道合胞病毒（HRSV）可导致婴幼儿严重的细支气管炎。严重HRSV疾病发病机制的一部分由宿主免疫反应引起。利用HRSV刺激原代人免疫细胞，可提供一种快速且可重复的模型系统，用于研究炎症通路的活化及感染过程。

人类呼吸道合胞病毒（HRSV）感染的疾病严重程度呈现广泛谱系，从轻度感染到危及生命的重症不等……

本实验的总体目标是研究人类免疫细胞对呼吸道合胞病毒（RSV）感染的反应。首先在helo细胞上培养具有感染性的RSV病毒株，以制备病毒原液；第二步，通过超速离心法纯化培养所得的RSV病毒原液。接下来，通过密度梯度离心法分离原代人外周血免疫细胞。最后一步中，将分离得到的免疫细胞用病毒进行刺激。最终，可通过ELISA、qPCR或流式细胞术评估细胞对呼吸道合胞病毒（RSV）感染的免疫应答。该技术为研究呼吸道原位病毒感染提供了有价值的补充。呼吸道合胞病毒（RSV）对人类具有高度适应性，因此，在研究该病毒致病机制所涉及的炎症通路时，使用人类免疫细胞至关重要。尽管本视频中使用的病毒是呼吸道合胞病毒（RSV），但该方法也可轻松适用于研究其他病毒，例如流感病毒或鼻病毒。首先将一管人呼吸道合胞病毒（RSV）冻存液置于37摄氏度水浴中解冻。待病毒完全融化后，将原液用感染培养基按每瓶四毫升的体积分装稀释。保持感染复数（MOI）在0.1或更低水平，将病毒加入heli细胞中，并使用尽可能小的总体积，避免细胞干燥。随后在37°C和5% CO2条件下孵育培养物2至4小时，每15分钟轻轻摇动培养瓶以重新分布培养基。接着，移除接种液，并用PBS洗涤细胞一次。然后向培养瓶中加入 15 毫升培养基，在相同的培养条件下孵育三至五天。每天在普通明场显微镜下观察细胞，检查病毒引起的细胞病理学变化。当观察到这些变化时，刮取细胞以收获呼吸道合胞病毒（RSV），将悬液收集至无菌的 50 毫升离心管中，离心细胞，随后在室温下以 1800 ×g 离心 10 分钟，使细胞碎片沉淀。RSV 在此转速下不会形成沉淀，因此上清液可作为接种原液在 -80 摄氏度下以 1 毫升分装保存。为防止感染性病毒颗粒丢失，未来使用的分装样品务必使用液氮速冻 RSV。为纯化 RSV，首先在超速离心机的每个吊桶中放置一个无菌离心管。然后，向每支试管底部加入 5 毫升 freshly prepared（新鲜配制）的滤膜除菌蔗糖溶液。接着，非常缓慢地将 30 毫升 RSV 溶液加在蔗糖溶液上方，注意不要扰动蔗糖溶液，以保持两层液体界限清晰。随后，在生物安全柜中为保持无菌状态，使用无菌 PBS 小心平衡六支超速离心管，使其（包括管帽）之间的重量差异不超过 0.1 克。在 20,000 RCF 和 4°C 条件下离心 1.5 小时，以沉淀病毒。离心完成后，使用无菌镊子小心地将离心管从转头中取出。病毒颗粒已穿过蔗糖层并形成沉淀。将离心管口朝下放入病毒废弃物瓶中，并使其在无菌表面上倒置沥干。切勿让沉淀完全干燥。接下来，小心地让一毫升 HPSS 流过沉淀，轻轻倾斜离心管以排尽 HPSS。然后再次将离心管倒置，注意防止沉淀干燥。现在用另一毫升HBSS重悬沉淀，吹打40次，注意避免产生气泡，因为气泡可能破坏病毒。随后将病毒分装，于液氮中速冻。将病毒于-80°C保存，直至进行定量和进一步使用。从健康志愿者采集血液后，将血液置于10毫升EDTA管中，用室温PBS将血液稀释至最多2倍，最终在50毫升离心管中得到最大体积为35毫升的稀释血液。接下来，将一支无菌的锁针头连接到一支无菌的50毫升注射器上，然后吸取密度梯度介质至注射器中。将针头置于稀释血液试管的底部，小心地将15毫升密度梯度介质注入血液下方，保持密度梯度介质与血液之间有清晰的分界。现在，在室温下以最大加速度且关闭刹车的条件下，以800 ×g离心20分钟进行细胞分离。分离后，红细胞位于试管底部的沉淀中，其上方有一层银白色的中性粒细胞。沉淀物上方的透明层含有密度梯度介质，而密度梯度介质与顶部血浆层之间的薄层中含有PBMC。使用移液器小心收集PBMC，然后将细胞转移至预冷的50毫升离心管中。加入预冷的PBS至50毫升体积，完成离心后收集细胞沉淀。吸去上清液，用50毫升冰浴PBS洗涤沉淀两次。第二次洗涤后，向沉淀中加入1毫升冰浴培养基，计数细胞并将细胞浓度调整至每毫升5 × 10⁶个PBMC。为用活RSV刺激PBMC，首先将100微升PBMC加入96孔圆底板的每孔中，然后向每孔加入50微升两种新鲜稀释的刺激物。将培养板在37摄氏度、5% CO2条件下孵育24小时，随后离心培养板，收集上清液用于后续ELISA分析。沉淀中的刺激后PBMC可通过QPCR分析，或进行染色后用于流式细胞术检测。在进行A-P-B-M-C刺激实验时，建议结合本方法采用刺激物分步添加法。实验条件分为标准刺激条件（如RPMI或人呼吸道合胞病毒RSV）和测试组分条件（如mial、二肽或LPS）。重要的是，每次实验均需设置阴性对照（如单独使用RPMI）和阳性对照（如LPS）。在用RSV刺激24小时后，不同的外周血单个核细胞（PBMC）群体表现出剂量依赖性的感染率，以及RSV感染效率的差异。在用病毒刺激24小时后，对PBMC进行qPCR分析以检测TNF-α或干扰素-γ的表达，结果表明RSV可显著上调这两种炎症细胞因子的转录水平。相反，使用miam、二肽或LPS刺激仅引起微弱的mRNA表达。当P BMCs同时受到RSV和MIAL二肽刺激时，可观察到强烈的协同上调作用。通过ELISA检测刺激后的pbmc分泌TNF Alpha或干扰素γ的情况。与转录水平的观察结果相反，RSV对TNF alpha和干扰素γ蛋白分泌的诱导能力较弱；而通过miam二肽刺激p BMCs仅导致少量TNF alpha的产生，且不产生干扰素γ。与转录分析类似，当用呼吸道合胞病毒（RSV）和MIAM二肽共同刺激时，TNF-α和干扰素-γ均表现出协同性上调；使用MIAM二肽作为对照，以检测细胞因子的诱导是否依赖于RSV的复制。外周血单个核细胞（P BMCs）经活病毒或β-丙内酯灭活的RSV刺激，如图中所示，无论是活病毒还是灭活的RSV均能诱导促炎性细胞因子的产生。请注意，涉及RSV的实验必须在生物安全二级实验室的生物安全柜中进行。此外，在尝试本方法时，必须牢记在整个实验过程中均需使用无内毒素的试剂和材料。观看本视频后，您应能充分理解如何用呼吸道合胞病毒（RSV）刺激人外周血单个核细胞（PBMC），以及可用于分析免疫应答的多种检测方法。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

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