一个 体外 研究人外周血单个核细胞对人呼吸道合胞病毒感染免疫应答的模型

本实验的总体目标是研究人类免疫细胞对呼吸道合胞病毒（RSV）感染的反应。首先在helo细胞上培养具有感染性的RSV病毒株，以制备病毒原液；第二步，通过超速离心法纯化培养所得的RSV病毒原液。

接下来，通过密度梯度离心法分离原代人外周血免疫细胞。最后一步中，将分离得到的免疫细胞用病毒进行刺激。最终，可通过ELISA、qPCR或流式细胞术评估细胞对呼吸道合胞病毒（RSV）感染的免疫应答。

该技术为研究呼吸道原位病毒感染提供了有价值的补充。呼吸道合胞病毒（RSV）对人类具有高度适应性，因此，在研究该病毒致病机制所涉及的炎症通路时，使用人类免疫细胞至关重要。

尽管本视频中使用的病毒是呼吸道合胞病毒（RSV），但该方法也可轻松适用于研究其他病毒，例如流感病毒或鼻病毒。首先将一管人呼吸道合胞病毒（RSV）冻存液置于37摄氏度水浴中解冻。待病毒完全融化后，将原液用感染培养基按每瓶四毫升的体积分装稀释。

保持感染复数（MOI）在0.1或更低水平，将病毒加入heli细胞中，并使用尽可能小的总体积，避免细胞干燥。随后在37°C和5% CO2条件下孵育培养物2至4小时，每15分钟轻轻摇动培养瓶以重新分布培养基。接着，移除接种液，并用PBS洗涤细胞一次。

然后向培养瓶中加入 15 毫升培养基，在相同的培养条件下孵育三至五天。每天在普通明场显微镜下观察细胞，检查病毒引起的细胞病理学变化。当观察到这些变化时，刮取细胞以收获呼吸道合胞病毒（RSV），将悬液收集至无菌的 50 毫升离心管中，离心细胞，随后在室温下以 1800 ×g 离心 10 分钟，使细胞碎片沉淀。

RSV 在此转速下不会形成沉淀，因此上清液可作为接种原液在 -80 摄氏度下以 1 毫升分装保存。为防止感染性病毒颗粒丢失，未来使用的分装样品务必使用液氮速冻 RSV。为纯化 RSV，首先在超速离心机的每个吊桶中放置一个无菌离心管。

然后，向每支试管底部加入 5 毫升 freshly prepared（新鲜配制）的滤膜除菌蔗糖溶液。接着，非常缓慢地将 30 毫升 RSV 溶液加在蔗糖溶液上方，注意不要扰动蔗糖溶液，以保持两层液体界限清晰。随后，在生物安全柜中为保持无菌状态，使用无菌 PBS 小心平衡六支超速离心管，使其（包括管帽）之间的重量差异不超过 0.1 克。在 20,000 RCF 和 4°C 条件下离心 1.5 小时，以沉淀病毒。

离心完成后，使用无菌镊子小心地将离心管从转头中取出。病毒颗粒已穿过蔗糖层并形成沉淀。将离心管口朝下放入病毒废弃物瓶中，并使其在无菌表面上倒置沥干。

切勿让沉淀完全干燥。接下来，小心地让一毫升 HPSS 流过沉淀，轻轻倾斜离心管以排尽 HPSS。然后再次将离心管倒置，注意防止沉淀干燥。

现在用另一毫升HBSS重悬沉淀，吹打40次，注意避免产生气泡，因为气泡可能破坏病毒。随后将病毒分装，于液氮中速冻。将病毒于-80°C保存，直至进行定量和进一步使用。从健康志愿者采集血液后，将血液置于10毫升EDTA管中，用室温PBS将血液稀释至最多2倍，最终在50毫升离心管中得到最大体积为35毫升的稀释血液。

接下来，将一支无菌的锁针头连接到一支无菌的50毫升注射器上，然后吸取密度梯度介质至注射器中。将针头置于稀释血液试管的底部，小心地将15毫升密度梯度介质注入血液下方，保持密度梯度介质与血液之间有清晰的分界。现在，在室温下以最大加速度且关闭刹车的条件下，以800 ×g离心20分钟进行细胞分离。分离后，红细胞位于试管底部的沉淀中，其上方有一层银白色的中性粒细胞。

沉淀物上方的透明层含有密度梯度介质，而密度梯度介质与顶部血浆层之间的薄层中含有PBMC。使用移液器小心收集PBMC，然后将细胞转移至预冷的50毫升离心管中。加入预冷的PBS至50毫升体积，完成离心后收集细胞沉淀。

吸去上清液，用50毫升冰浴PBS洗涤沉淀两次。第二次洗涤后，向沉淀中加入1毫升冰浴培养基，计数细胞并将细胞浓度调整至每毫升5 × 10⁶个PBMC。为用活RSV刺激PBMC，首先将100微升PBMC加入96孔圆底板的每孔中，然后向每孔加入50微升两种新鲜稀释的刺激物。

将培养板在37摄氏度、5% CO2条件下孵育24小时，随后离心培养板，收集上清液用于后续ELISA分析。沉淀中的刺激后PBMC可通过QPCR分析，或进行染色后用于流式细胞术检测。在进行A-P-B-M-C刺激实验时，建议结合本方法采用刺激物分步添加法。

实验条件分为标准刺激条件（如RPMI或人呼吸道合胞病毒RSV）和测试组分条件（如mial、二肽或LPS）。重要的是，每次实验均需设置阴性对照（如单独使用RPMI）和阳性对照（如LPS）。在用RSV刺激24小时后，不同的外周血单个核细胞（PBMC）群体表现出剂量依赖性的感染率，以及RSV感染效率的差异。在用病毒刺激24小时后，对PBMC进行qPCR分析以检测TNF-α或干扰素-γ的表达，结果表明RSV可显著上调这两种炎症细胞因子的转录水平。相反，使用miam、二肽或LPS刺激仅引起微弱的mRNA表达。

当P BMCs同时受到RSV和MIAL二肽刺激时，可观察到强烈的协同上调作用。通过ELISA检测刺激后的pbmc分泌TNF Alpha或干扰素γ的情况。与转录水平的观察结果相反，RSV对TNF alpha和干扰素γ蛋白分泌的诱导能力较弱；而通过miam二肽刺激p BMCs仅导致少量TNF alpha的产生，且不产生干扰素γ。

与转录分析类似，当用呼吸道合胞病毒（RSV）和MIAM二肽共同刺激时，TNF-α和干扰素-γ均表现出协同性上调；使用MIAM二肽作为对照，以检测细胞因子的诱导是否依赖于RSV的复制。外周血单个核细胞（P BMCs）经活病毒或β-丙内酯灭活的RSV刺激，如图中所示，无论是活病毒还是灭活的RSV均能诱导促炎性细胞因子的产生。请注意，涉及RSV的实验必须在生物安全二级实验室的生物安全柜中进行。

此外，在尝试本方法时，必须牢记在整个实验过程中均需使用无内毒素的试剂和材料。观看本视频后，您应能充分理解如何用呼吸道合胞病毒（RSV）刺激人外周血单个核细胞（PBMC），以及可用于分析免疫应答的多种检测方法。