抗癌金属配合物：合成及通过 MTT 法评估细胞毒性

本实验的总体目标是制备抗肿瘤金属药物，并通过 MTT 法评估其细胞毒性。首先合成基于金属的抗肿瘤化合物，第二步是制备含癌细胞的 96 孔板。

接下来，将金属基抗肿瘤化合物导入癌细胞。最后一步是通过MTT法检测细胞活力，通过测定线粒体和胞质酶对MTT的还原生成甲臜的量，最终确定化合物的抗肿瘤活性及其半数最大抑制浓度（IC50值）。

初学者通常可能难以掌握该方法，因为这是一个多步骤的实验流程，需要实验人员全程专注，并且必须严格遵循时间安排。该方法的可视化演示至关重要，因为细胞板的制备过程并不简单，操作活细胞时必须遵守特定的操作规范。在手套箱中操作，通过将 0.42 毫摩尔的配体前体溶解于干燥的四氢呋喃（THF）中来制备五价钒配合物。

然后将其加入到含有等摩尔量的三异丙氧基钒的四氢呋喃（THF）搅拌溶液中。室温下搅拌反应混合物15分钟，随后在减压下除去挥发性物质。接着加入冷的正己烷，并在减压下除去。

应以定量产率获得深紫色粉末。在离心管或样品瓶中称取8毫克所得化合物。制备四价钛配合物时，将0.35毫摩尔配体前体溶解于干燥的四氢呋喃中，并将其加入到等摩尔量的四异丙氧基钛的四氢呋喃搅拌溶液中。

在室温下搅拌反应混合物两小时。然后在减压下除去挥发性物质，得到黄色产物，产率定量。取8毫克所得化合物置于小瓶中，用于首先培养96孔板中的HT 29细胞。

按照文本方案所述，在75平方厘米的培养瓶中培养细胞，当HT 29细胞达到最大融合度时，移除培养基。用一毫升胰蛋白酶EDTA溶液洗涤细胞后，加入一毫升相同溶液，孵育五分钟。使HT 29细胞从培养瓶中脱落，然后加入10毫升培养基以终止胰蛋白酶活性。

将5毫升细胞混合液转移至离心管中。用移液器吸取数滴细胞混合液加入计数室。计数室包含两个5×5方格区域。

使用显微镜计数每个部分五个代表性方格中的细胞，包括四个角上的方格和一个中央方格。计算细胞的大致数量。

对每部分的五个代表性方格中的细胞进行计数并求和。计算两部分总和的平均值，再除以20。接着，用0.6除以该商值。

收到的数值是每块板所需的细胞混合物体积。该计算基于每孔含有 9,000 个细胞的板。使用移液器，将每板所需的细胞混合物体积与 13.2 毫升培养基混合。

将混合物加入96孔板中。使用11通道移液器，每孔200 µL，覆盖共66个孔的六行。每行应留出一个孔作为空白对照。

将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育24小时，以使细胞贴壁。在加入化合物前，先向8毫克的称量化合物中加入200微升无水四氢呋喃。随后通过向九个不同的eppendorf管中各加入60微升四氢呋喃，进一步稀释化合物溶液。对于每种溶液，使用移液器将60微升化合物溶液转移至第一个eppendorf管中。

然后取60微升重悬液转移至下一个试管，依次操作直至获得10个不同浓度。随后，将每种浓度的20微升用四氢呋喃（THF）与180微升培养基稀释。同时，通过将20微升四氢呋喃（THF）加入180微升培养基中，制备仅含溶剂的对照溶液。

接下来，将每种所得溶液各取 10 微升加入到每个孔中。每个孔中已含有 200 微升前述的细胞培养基溶液，以使化合物的终浓度达到最高 200 毫克/升。每行包含经化合物处理的细胞，共 10 种不同浓度。

一个对照孔，仅加入溶剂处理细胞，另设一个无细胞的空白对照孔。对于空白对照，设置每种化合物的测量重复三次。将加样后的培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳气氛中孵育三天。按照文本方案中的描述，使用11通道移液器配制MTT溶液。

除空白对照孔外，向每个孔中加入 20 微升 MTT 溶液。在孵育后，将培养板再孵育额外 3 小时。移除每个孔中的培养基溶液，并向每个孔中加入 200 微升异丙醇。

将培养板搅拌30分钟，直至甲酰苯溶解均匀。使用酶标仪或分光光度计，在550纳米波长下测定200微升均匀溶液的吸光度，每项测量需在三天内重复进行三次。随后，从测得的吸光度值中减去空白对照的吸光度值，将所得结果除以四氢呋喃溶剂对照的吸光度值，再乘以100%，计算细胞存活率。使用作图软件计算半最大抑制浓度（IC50）值。

报道的IC50值是在至少三个不同日期收集的所有IC50值的平均值，误差值为标准偏差。通过分析MTT实验获得的数据，评估该化合物的细胞毒性。测量应在一个浓度范围内进行，以生成一条曲线图，该图在每个平台区至少包含三个数据点，并有三个数据点用于确定斜率。

在高浓度或低浓度下测量数据不足，将影响用于确定 IC50 值的曲线非线性回归拟合，从而降低其准确性。通过非线性回归拟合确定的相对 IC50 值，对应于受试化合物所能达到的最大细胞生长抑制效果的 50% 时的浓度。该值计算为所测得的最大和最小细胞活力之间的中点，而这两个值不一定分别为 100% 和 0%。

在检查本实验方案中所述实验结果时，可以明显看出顺铂以及钛和钒配合物均具有很高的活性。此外还可以注意到，在比较不同化合物的 IC50 值时，某一化合物的最大抑制率越接近 100%，其相对 IC50 值就越接近绝对值。

钛四配合物的细胞毒性最高，其IC50值低于顺铂和钒五配合物。然而，游离配体的活性显著降低，因为在加入不同浓度的配体后，细胞活力的下降程度远不如其配合物明显。

这确保了配合物的高抗癌活性依赖于金属中心。在进行该实验操作时，必须始终保持无菌条件。观看本视频后，您应能够很好地掌握如何利用MTT法评估抗癌化合物的细胞毒性。