Name: 抗癌金属配合物的合成与细胞毒性评价MTT法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-10T21:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: 学习合成空气敏感的钛和钒抗癌金属配合物，并使用MTT法评估其对人类癌细胞的细胞毒性活性。该方法可测定IC50值，为开发新型金属药物提供可靠的体外筛选方案。

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资金由欧洲研究理事会根据欧洲共同体第七个框架计划（FP7/2007-2013）/ 欧洲研究理事会资助协议编号&#160;[239603] 提供

<ol>
	<li>五价钒配合物的制备（图2）；18 步骤1.1–1.4需在手套箱中进行；若无手套箱，可跳至替代步骤2（2.1–2.6）。
	<ol>
		<li>将0.42 mmol配体H2L溶于干燥的四氢呋喃（THF）中，并加入至含有等摩尔量VO(OiPr)3的THF搅拌溶液中。</li>
		<li>室温下搅拌反应混合物15分钟，随后在真空下除去挥发性物质。</li>
		<li>加入冷己烷，再在真空下除去。应定量获得深紫色粉末。</li>
		<li>在Eppendorf管中称取8 mg所得化合物。跳至步骤3。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用施兰克线（Schlenk line）制备五价钒配合物。
	<ol>
		<li>在干燥的带隔垫塞的施兰克烧瓶中，将0.42 mmol配体H2L溶于干燥THF，连接至施兰克线，交替施加真空/惰性气体（N2或Ar）环境；建议重复此过程三次，并在每次抽真空阶段保持2–5分钟。</li>
		<li>通过隔垫用注射器加入干燥THF。</li>
		<li>加入等摩尔量的VO(OiPr)3的THF溶液，该溶液需预先在另一干燥施兰克烧瓶中制备：将烧瓶接入施兰克线，建立惰性气氛&#160;，再用注射器将钒溶液转移至配体溶液中。</li>
		<li>室温下搅拌反应混合物15分钟&#160;，随后在真空下除去挥发性物质；若产物不稳定，可在惰性气氛下进行施兰克式蒸馏；使用惰性气体气流连接已预先干燥的玻璃仪器。</li>
		<li>加入冷己烷，再在真空下除去。应定量获得深紫色粉末。</li>
		<li>在Eppendorf管中称取8 mg所得化合物。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>四价钛配合物的制备（图2）；28 步骤3.1–3.3需在手套箱中进行；若无手套箱，可参照使用施兰克线的钒类似物替代步骤（步骤&#160;2）进行调整。
	<ol>
		<li>将0.35 mmol配体H2L溶于干燥THF中，并加入至含有等摩尔量Ti(OiPr)4的THF搅拌溶液中。</li>
		<li>室温下搅拌反应混合物2小时。在真空下除去挥发性物质，得到黄色产物，收率为定量。</li>
		<li>在Eppendorf管中称取8 mg所得化合物。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>HT-29细胞96孔板的制备
	<ol>
		<li>在75 cm2培养瓶中，使用含1%青霉素/链霉素抗生素、1% L-谷氨酰胺和10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培养基，在37 °C、5% CO2条件下培养HT-29细胞。</li>
		<li>当HT-29细胞达到最大汇合度（90–100%，每3–4天未传代）时，弃去培养基。用1 ml胰蛋白酶（0.25%）/EDTA（0.05%）溶液洗涤并弃去。</li>
		<li>加入1 ml胰蛋白酶（0.25%）/EDTA（0.05%）溶液，孵育5分钟。</li>
		<li>使HT-29细胞从培养瓶脱落，加入10 ml培养基以终止胰蛋白酶活性。将5 ml细胞悬液转移至离心管中。</li>
		<li>用移液器吸取少量细胞悬液滴入计数室。计数室包含5 ×&#160;5个方格。</li>
		<li>使用显微镜计数5个代表性方格中的细胞数：四个角的方格和中央的一个方格。</li>
		<li>估算细胞总数。将5个代表性方格中的细胞数相加后除以20。</li>
		<li>用0.6除以步骤4.7的结果。所得数值即为每块板所需的细胞悬液量。该计算对应于每板含0.6 ×&#160;106个细胞（每孔9,000个细胞）的情况。</li>
		<li>用移液器吸取每板所需的细胞悬液量（按步骤4.8计算），并加入13.2 ml培养基（每孔200 μl × 66孔）。</li>
		<li>使用11通道移液器将混合液加入96孔板（每孔200 μl，共6行，总计66孔）。每行应留出一孔作为空白对照。</li>
		<li>将板在37 °C、5% CO2条件下孵育24小时，使细胞贴壁。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>化合物的加入
	<ol>
		<li>向按步骤1.4（或2.6）或3.3称取的每种化合物8 mg中加入200 μl（或根据所需浓度范围调整体积）干燥THF。同样称取8 mg配体H2L。</li>
		<li>将每种化合物溶液进一步稀释：在9个不同的Eppendorf管中各加入60 μl THF。</li>
		<li>用移液器从步骤5.1的母液中吸取60 μl加入第一个Eppendorf管，重悬后转移60 μl至下一管，依此类推，直至获得10个不同浓度（包括步骤5.1中的原始母液）。</li>
		<li>将每种THF稀释液20 μl与180 μl培养基混合。</li>
		<li>制备仅含THF的对照溶液：每次测量中，将20 μl THF与180 μl培养基混合。</li>
		<li>向已含有200 μl上述细胞培养液的每孔中加入10 μl所得溶液（包括THF对照），使化合物终浓度最高达200 mg/L（可根据化合物活性调整浓度范围）。</li>
		<li>根据化合物溶解度，最高浓度下可能出现少量沉淀。</li>
		<li>每种化合物的测量重复3次（同一化合物在板上占3行）；每行包含：10个不同浓度的化合物处理孔、1个仅含溶剂处理细胞的对照孔和1个无细胞的空白对照孔。</li>
		<li>将加样后的板在37 °C、5% CO2气氛下孵育3天。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用MTT法测定细胞毒性
	<ol>
		<li>将1 g MTT粉末加入200 ml不含酚红的RPMI-1640培养基中，配制MTT溶液。储备液可分装至15 ml离心管中，于-20 °C保存。</li>
		<li>使用11通道移液器向每孔加入20 μl MTT溶液（步骤4.10中无细胞的空白对照孔除外），再孵育3小时。</li>
		<li>弃去每孔中的培养基溶液。</li>
		<li>向每孔加入200 μl异丙醇以溶解甲臜。振荡0.5小时，直至溶液均匀。</li>
		<li>使用酶标仪分光光度计测定上述溶液200 μl在550 nm处的吸光度。</li>
		<li>在不同日期重复每项测量（每项包含3次重复，见步骤5.8），共进行3天。</li>
		<li>通过从测定值中减去空白对照吸光度，再除以THF溶剂对照的吸光度，乘以100%，计算细胞存活率百分比。</li>
		<li>使用GraphPad Prism软件（或等效软件）计算IC50值。</li>
		<li>报告的IC50值为至少三个不同实验日所得IC50值的平均值，误差值为标准差。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

本文所述方法结合了化学合成与生物细胞活力检测。在涉及活细胞的生物学实验中，必须在层流罩内操作并保持无菌条件，包括使用无菌有机溶剂。此外，对于水解不稳定的金属基药物，其制备与储存应在惰性气氛下进行，可采用手套箱或施兰克线（Schlenk line）技术。
在惰性气氛下进行实验时，技术方法的选择主要取决于是否具备手套箱。如果具备手套箱，则所有在室温条件下进行的合成反应均可非常方便地在其中完成。需要加热的合成反应通常在手套箱外进行，将反应体系转移至舒伦克瓶（Schlenk flask）中，并连接至舒伦克线（Schlenk line）。若无手套箱，所有操作也可通过精心选择的玻璃仪器在舒伦克线上完成，同时利用真空/惰性气体（N2 或 Ar）操作来维持干燥的气氛环境。
在细胞毒性评估过程中，需要在整个实验期间观察细胞的形态。实验开始前，健康贴壁细胞的培养基应保持澄清，污染的培养物会呈现浑浊状态。此外，在细胞与胰蛋白酶-EDTA孵育后，细胞应从培养瓶上脱落并悬浮于培养基中。如果大部分细胞仍贴附在培养瓶上，则应将培养瓶再...

化疗目前仍是临床上治疗多种癌症疾病的主要手段之一，因此全球开展了大量研究，旨在开发新型且更有效的抗癌药物。此类研究大多始于化学层面，即化合物的设计与合成，随后对其进行细胞毒性的生物学评价 体外细胞活力可通过多种检测方法进行评估，这些方法可提供有关细胞活性的信息1-2.
顺铂是一种铂类配合物，被广泛用作化疗药物，主要用于治疗睾丸癌和卵巢癌，被认为是一种高效的治疗手段3-4。然而，由于其作用范围较窄且具有严重的副作用，促使研究人员开展对其他高效过渡金属配合物的研究5-8。其中，钛(IV)和钒(V)配合物表现出较高的活性和较低的毒性，结果令人期待9-16。由于这些特性，钛(IV)配合物成为继顺铂之后首个进入临床试验的金属配合物；然而，由于制剂困难和水解不稳定性，其临床试验未能成功。因此，目前亟需开发出具有高抗癌活性且耐水性良好的新型金属配合物衍生物15,17-21。
制备 Ti(IV) 和 V(V) 配合物的一个难点在于前体试剂的水解不稳定性；因此，必须维持惰性气氛。Ti(IV) 和 V(V) 化合物的制备需在手套箱中或通过施伦克线技术，在 N2 或 Ar 气氛条件下进行。
评估抗癌活性的常用方法之一是基于MTT（3-(4,5-二甲基噻唑基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐）法。该方法是一种比色法细胞活力检测，由Mosmann于1983年首次提出22。该方法已被广泛研究和表征，在评估新型细胞毒性化合物的有效性时被认为具有高度效率，因其具备精确性高、操作快速以及适用于多种细胞系的优点。该细胞活力检测的原理是MTT分子在接触活细胞时发生颜色变化。通过测定吸光度（其值与活细胞数量成正比），并与未经处理的对照组进行比较，可评估待测化合物对细胞增殖的抑制能力。
MTT比色法以96孔板形式进行23。&#160;在加入待测药物前，细胞可能需要在孔板中预先孵育。预孵育时间根据细胞系特性可从0至24小时不等。通常根据药物活性，细胞暴露于药物的时间为24至96小时。随后将MTT溶液加入处理后的细胞中，在活细胞内多种线粒体和胞质酶的作用下，黄色的MTT被还原为紫色的甲臜（图1）24。死亡细胞或红细胞（代谢失活细胞）、脾细胞（静息细胞）以及刀豆蛋白A刺激的淋巴细胞（活化细胞）均不能还原MTT分子22。与MTT共同孵育3至4小时后，甲臜形成沉淀。甲臜的生成在孵育0.5小时后即开始，但为获得最佳结果，建议细胞与MTT孵育至少3小时22。随后移除培养基，并用有机溶剂溶解甲臜，首选异丙醇25，尽管也可使用DMSO26。彻底去除培养基对获得准确结果至关重要，因为培养基中广泛存在的酚红以及沉淀的蛋白质可能干扰吸光度测定25。当甲臜溶液达到均匀状态后，使用酶标仪分光光度计测定其吸光度。在每孔200至50,000个细胞范围内，550 nm处的吸光度与细胞数量成正比，因此可检测极少量的细胞22。该吸光度值反映药物处理后存活细胞的数量，并与未接受药物处理的对照组细胞吸光度进行比较。通过适当的软件分析结果，可获得IC50（抑制浓度；50%）值及其基于多次重复测量的统计误差。
MTT 法因其准确性和相对简便性，被广泛用于细胞毒性研究中筛选新的抗癌化合物。然而，在使用依赖于酶促反应的 MTT 法时，必须考虑到各种酶抑制剂可能影响 MTT 的还原过程，从而导致假阳性或假阴性结果27。此外，MTT 法无法提供有关药物细胞毒性作用分子机制的任何信息2。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;试剂/材料&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Biological Industries</td><td>04-007-1A</td><td></td></tr><tr><td>分析纯正己烷</td><td>Gadot</td><td>830122313</td><td>使用溶剂干燥系统干燥</td></tr><tr><td>HT-29 细胞系</td><td>ATCC</td><td>HTB-38</td><td></td></tr><tr><td>分析纯异丙醇</td><td>Gadot</td><td>830111370</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Biological Industries</td><td>03-020-1B</td><td></td></tr><tr><td>MTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5655-1G</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素抗生素</td><td>Biological Industries</td><td>03-031-1B</td><td></td></tr><tr><td>含酚红和L-谷氨酰胺的RPMI-1640培养基</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>不含酚红的RPMI培养基</td><td>Biological Industries</td><td>01-103-1A</td><td></td></tr><tr><td>分析纯四氢呋喃（THF）</td><td>Gadot</td><td>830156391</td><td>使用溶剂干燥系统干燥</td></tr><tr><td>Ti(O&lt;em&gt;i&lt;/em&gt;Pr)&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>205273-500ML</td><td>对湿气敏感</td></tr><tr><td>胰蛋白酶/EDTA</td><td>Biological Industries</td><td>03-052-1B</td><td></td></tr><tr><td>VO(O&lt;em&gt;i&lt;/em&gt;Pr)&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>404926-10G</td><td>对湿气敏感</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;仪器设备&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>12通道移液器 30–300 &amp;mu;l</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>12通道移液器 5–50 &amp;mu;l</td><td>Finnpipette</td><td></td><td></td></tr><tr><td>75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; 培养瓶</td><td>NUNC</td><td>156472</td><td></td></tr><tr><td>96孔板（平底，带盖）</td><td>NUNC</td><td>167008</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>Binder</td><td>APT.line C150</td><td></td></tr><tr><td>计数室</td><td>Marienfeld-Superior</td><td>650030</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 管</td><td>KARTELL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>手套箱</td><td>M. Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>超净工作台</td><td>ADS LAMINAIRE</td><td>OPTIMALE 12</td><td></td></tr><tr><td>酶标仪分光光度计</td><td>Bio-Tek</td><td>El-800</td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TS100</td><td></td></tr><tr><td>移液器 20–200 &amp;mu;l</td><td>Finnpipette</td><td></td><td></td></tr><tr><td>移液器 5–50 &amp;mu;l</td><td>Finnpipette</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

抗癌金属配合物：合成及通过 mtt 法评估细胞毒性

Anticancer Metal Complexes: Synthesis and Cytotoxicity Evaluation by the MTT Assay

钛(IV)和钒(V)配合物是高效的抗癌药物。这类配合物的合成面临的一个挑战是其易发生水解而不稳定，因此其制备必须在惰性气氛下进行。可通过MTT法评估这些配合物的抗癌活性。
MTT 检测是一种比色法活力检测，其原理是当 MTT 分子接触活细胞时，经酶促反应被还原为甲臜。该还原反应导致 MTT 分子发生颜色变化。通过测定相对于对照组的吸光度，可确定用不同浓度待测化合物处理后残留的活癌细胞百分比，从而反映该化合物的抗癌活性及其 IC50 值。由于具有准确性高、操作快速且相对简便的优点，MTT 检测在细胞毒性研究中被广泛应用。
本文介绍了一种详细的方案，用于合成对空气敏感的金属基药物并进行细胞活力检测，包括细胞培养板的制备、化合物与细胞的孵育、采用MTT法检测细胞活力，以及IC50值的确定。

复合物的制备基于已建立的方法18,28，其纯度可通过核磁共振（NMR）和元素分析进行评估。
通过MTT实验获得的数据用于评估化合物的细胞毒性18,21。首先，从所有其他数值中减去空白对照组的吸光度值。其次，将四氢呋喃（THF）溶剂对照组的细胞活力设为100%，因为该组未添加任何抑制细胞生长的化合物。其余各组数值均根据对照组换算为相对细胞活力百分比。然后将所用浓度及计算得到的相对细胞活力百分比输入GraphPad Prism软件（或同等软件），采用非线性回归的可变斜率（四参数）模型拟合曲线，以确定IC50值（图4，表1）29。
应在一系列浓度范围内进行测量，以获得具有均匀数据点分布的曲线图：每个平台区至少三个数据点，以及至少三个数据点用于定义斜率（图3，图A）。在高浓度或低浓度下测量点不足（图3，图B）将影响...

本文描述了一种合成对空气敏感的钛和钒类抗癌药物的方法，并通过MTT法评估了这些药物对人癌细胞系的细胞毒性活性。

抗癌金属配合物：合成及通过 MTT 法评估细胞毒性

钛(IV)和钒(V)配合物是高效的抗癌试剂。其合成中的一个挑战在于它们的水解不稳定性；...

本实验的总体目标是制备抗癌金属药物，并通过 MTT 法评估其细胞毒性。首先合成基于金属的抗癌化合物，第二步是制备含有癌细胞的 96 孔板。接下来，将金属基抗肿瘤化合物导入癌细胞。最后一步是通过MTT法测定细胞活力，该方法通过检测线粒体和胞质酶对MTT的还原反应生成甲臜，最终评估化合物的抗肿瘤活性及其半数最大抑制浓度（IC50值）。初学者通常可能难以掌握该方法，因为这是一个多步骤的实验流程，需要实验人员全程集中注意力，并且必须严格遵循时间安排。该方法的可视化演示至关重要，因为细胞板的制备过程并不简单，操作活细胞时必须遵循特定的操作规范。在手套箱中操作，通过将 0.42 毫摩尔的配体前体溶解于干燥的四氢呋喃（THF）中，制备五价钒配合物。然后将其加入到含有等摩尔量的三异丙氧基钒（vanadium tris isopropoxide）的THF搅拌溶液中。室温下搅拌反应混合物15分钟，随后在减压条件下除去挥发性物质。接着，加入冷的正己烷，并在减压下除去。应得到深紫色粉末，产率为定量。称取8毫克所得化合物置于epi或ph小瓶中。为制备四价钛配合物，将0.35毫摩尔配体前体溶解于干燥的四氢呋喃（THF）中，然后加入到等摩尔量的四异丙氧基钛的THF搅拌溶液中。在室温下搅拌反应混合物两小时。然后在减压下去除挥发性物质，得到黄色产物，产率为定量。取八毫克所得化合物置于小瓶中，用于首先在96孔板中培养HT 29细胞。按照文本方案中所述，在75平方厘米的培养瓶中培养细胞，当HT 29细胞达到最大融合度时，移除培养基。用一毫升胰蛋白酶EDTA溶液洗涤细胞后，加入一毫升相同的溶液，孵育五分钟。使HT 29细胞从培养瓶中脱落，然后加入10毫升培养基以终止胰蛋白酶活性。将5 mL细胞混合液转移至离心管中。用移液器吸取数滴细胞混合液至计数室。计数室包含两个5×5方格区域。使用显微镜计数每个部分五个代表性方格中的细胞，包括四个角上的方格和中央的一个方格。计算细胞的大致数量。对每个部分的五个代表性方格中的细胞进行计数并求和。计算两部分总和的平均值，然后除以20。接着，用0.6除以该商。所获得的数值为每块板所需的细胞混合物体积。该计算基于每孔含有 9,000 个细胞的板。使用移液器，将每块板所需的细胞混合物体积与 13.2 毫升培养基混合。将混合物加入96孔板中。使用11通道移液器，每孔200微升，共加入六行，总计66个孔。每行应留出一孔作为空白对照孔。将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育24小时，使细胞贴壁。在加入化合物前，先向8毫克的称量化合物中加入200微升无水THF。随后通过向9个不同的eppendorf管中各加入60微升THF，进一步稀释化合物溶液。对于每种溶液，使用移液器将60微升化合物溶液转移至第一个eppendorf管中。然后重悬并转移60微升至下一个离心管，依此类推，直至获得10种不同浓度。取每种浓度的20微升，加入180微升培养基中的四氢呋喃（THF）中进行稀释。同时，通过将20微升四氢呋喃（THF）加入180微升培养基中，制备仅含溶剂的对照溶液。接下来，将每种所得溶液各取 10 µL 加入每个孔中，该孔中已含有 200 µL 上述含细胞的培养基溶液，使化合物的终浓度达到最高 200 mg/L。每行孔中的细胞均用化合物处理，浓度共 10 个不同梯度。一个对照孔，仅含溶剂处理的细胞，以及一个无细胞的孔。对于空白对照，设置每种化合物的测量重复三次。将加样后的培养板在37摄氏度、5%二氧化碳气氛中孵育三天。按照文本方案中的描述，使用11通道移液器配制MTT溶液。除空白对照孔外，向每个孔中加入 20 微升 MTT 溶液。在孵育后，将培养板再孵育额外 3 小时。移除每个孔中的培养基溶液，并向每个孔中加入 200 微升异丙醇。将平板搅拌30分钟，直至甲酰溶液完全溶解并形成均一溶液。使用酶标仪或分光光度计，在550纳米波长下测定200微升均一溶液的吸光度值，并在连续三个不同的实验日重复测量。随后，从测得的吸光度值中减去空白对照组的吸光度值，将所得结果除以四氢呋喃（THF）溶剂对照组的吸光度值，再乘以100%，计算细胞存活率百分比。使用绘图软件计算半最大抑制浓度（IC50）值。报道的IC50值为在至少三个不同日期收集的所有IC50值的平均值，误差值为标准偏差。通过分析MTT实验获得的数据，评估该化合物的细胞毒性。测量应在一个浓度范围内进行，以生成一条曲线图，该图在每个平台区至少包含三个数据点，且在斜率部分至少包含三个数据点，从而实现均匀的数据点分布。在高浓度或低浓度下测量数据不足，将影响用于确定 IC50 值的曲线非线性回归拟合，从而降低其准确性。通过非线性回归拟合确定的相对 IC50 值，对应于受试化合物引起细胞生长抑制达到 50% 时的浓度。该值计算为所测得的最大和最小细胞存活率之间的中点，而这两个值不一定分别为 100% 和 0%。在检查本方案所述实验结果时，可以明显看出顺铂以及钛和钒配合物均具有很高的活性。此外，还可以注意到，当比较不同化合物的 IC50 值时，某一特定化合物的最大抑制率越接近 100%，其相对 IC50 值就越接近绝对 IC50 值。钛四配合物的细胞毒性最高，其IC50值低于顺铂和钒五配合物。然而，游离配体的活性显著降低，因为在不同浓度下加入配体后，细胞活力的下降程度远不如其配合物明显。这确保了配合物的高抗癌活性依赖于金属中心。在进行此操作时，必须始终保持无菌条件。观看本视频后，您应能充分掌握如何通过M-T-T-S-A法评估抗肿瘤化合物的细胞毒性。

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抗癌金属配合物的合成与细胞毒性评价MTT法

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MCF-7细胞系中纳米基因药物的细胞毒性：MTT法检测

本视频介绍了通过比色法——甲基噻唑四氮唑（MTT）法——检测药物诱导的癌细胞毒性并测定其代谢活性的实验方法。该方法基于四氮唑盐在细胞线粒体活性作用下转化为有色产物的代谢反应。...

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此处，结合实时监测肿瘤细胞代谢， 体内 用于评估新型抗癌靶点或药物能否增强肿瘤细胞对DNA损伤类化疗药物敏感性的转移模型，包括鸡胚尿囊绒毛膜（CAM）模型。...

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