Name: 在体内 19女性 MRI对细胞跟踪 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-25T21:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: 了解使用19F MRI进行体内细胞追踪的方法，通过离体标记细胞实现无创成像与定量分析。该技术适用于临床及临床前研究，可直接从图像数据确定细胞数量与定位。

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我们谨向 Nadine Henn 和 Arend Heerschap 表示感谢，感谢他们提供的宝贵帮助。本研究得到了荷兰再生医学研究所（NIRM，FES0908）、欧盟第七框架计划 ENCITE（HEALTH-F5-2008-201842）和 TargetBraIn（HEALTH-F2-2012-279017）、大众基金会资助项目（I/83 443）、荷兰科学研究组织（VENI 700.10.409 和 Vidi 917.76.363）、欧洲研究理事会（高级资助项目 269019）以及奈梅亨拉德堡德大学医学中心（AGIKO-2008-2-4）的支持。

注意：所有涉及动物的实验和操作必须遵循相关伦理准则，并符合标准的动物护理和人道要求。
1. 细胞标记（共孵育标准方案）
<ol>
	<li>将19F标记物8以4 mg/106个细胞（溶于2 ml培养基中）的浓度加入未成熟DC细胞，轻轻混匀。</li>
	<li>在使DC细胞成熟并收获之前，将细胞与标记物共同孵育3天。</li>
	<li>收集DC细胞，用PBS洗涤至少3次以去除过量的标记物，并对细胞进行计数。</li>
	<li>将细胞重悬于少量PBS中，用于注射或进一步检测。</li>
</ol>
注意：本方案适用于这些特定的树突状细胞（DCs）和标记物。该实验流程已在另一篇文献中进行了优化8，此处仅包含成像样本制备的步骤，因为本方案的重点在于成像。因此，特定细胞类型的分离、培养和标记方案需查阅相关文献或由研究人员自行优化。文献中已使用的其他19F标记物的汇总见于其他研究6。
2. 使用19F NMR 测定每个细胞的19F含量
<ol>
	<li>将已知数量的标记细胞（通常多于 0.5 × 106 个，或足以产生足够信号的数量）放入核磁共振管中。</li>
	<li>加入 10 μl 的 5% 三氟乙酸（TFA）。如果 TFA 的共振频率因与标记物重叠而不适用，可使用其他可溶性化合物作为替代，优选具有单一19F 共振峰的化合物。</li>
	<li>将样品放入核磁共振波谱仪中，获取19F 谱图。确保谱宽足以同时覆盖 TFA（参考物）和待测物的信号。</li>
</ol>
注意：TR 应足够长，以确保参考和样品自旋的充分弛豫（约为 5 倍 T1 最长T的弛豫时间1 管中的组分，通常 TR 为 5–8 秒）。某些波谱仪需要 D2O 作为频率锁定信号。一种标准 19F 谱图已足够。若细胞对标记物的摄取效果较差，则需要进行大量平均化处理或使用更多细胞&#160;或当细胞数量较少时，光谱应位于参考峰和相关标记峰之间；除非已进行校正以补偿部分激发。
<ol start="4">
	<li>计算参考物质与样品（或样品主峰）峰下面积的相对值，然后计算样品中每个细胞的平均19F原子数。</li>
</ol>
注意：整个过程必须重复足够多次并进行充分平均，以达到统计学显著性。也可直接在磁共振成像仪上使用光谱法完成该步骤。但需注意，此方法仅能提供大量细胞的平均19F负载量，无法反映细胞间的差异性。若需检测细胞摄取的均一性，则要求19F标记剂含有荧光组分，以便通过显微镜或流式细胞术分析细胞摄取情况。
3. 实验设计的注意事项 - 细胞注射
由于19F MRI在细胞示踪中的灵敏度相对较低，因此需要使用细胞能够大量聚集的动物模型，才能成功实现体内成像。典型的检测灵敏度范围为每体素每小时扫描时间1,000至100,000个细胞6，细胞内氟原子载量通常在1011至1013个之间。
成像次数和频率必须经过仔细规划，因为这会影响麻醉剂的选择。需要注意的是，异氟烷可能并不适用于 19f MRI 如果 19异氟烷的共振频率与所用标记化合物的频率接近。如果成像时间足够短，不足以引起显著的信号累积，异氟烷仍可适用。文献中已采用多种替代麻醉剂。10,11；成像方案中包含一个示例。不同小鼠品系和疾病模型可能需要优化麻醉方案。
4. 外部19F参考标准的设计
<ol>
	<li>使用含有已知量19F信号的外部参照物进行定量12。选择参照物的信号强度应大致与受试样本预期的信号强度相当。</li>
</ol>
注意：通常情况下，参考化合物与细胞标记物相同最为简便，以便匹配弛豫参数。如果使用波谱序列或无空间定位的序列，则可能需要使用化学位移不同的化合物。
<ol start="2">
	<li>根据感兴趣区域（ROI）的需要，调整参考物的位置、大小和形状。注意：通常使用横截面均匀的管材作为参考物最为方便。</li>
</ol>
5. 成像与小鼠准备
<ol>
	<li>将市售的氯胺酮和赛拉嗪按1:10 v/v的比例用生理盐水稀释，制备成浓度为10 mg/ml的氯胺酮和2 mg/ml的赛拉嗪储备液。</li>
	<li>打开扫描仪的加热系统（通常为热风），以确保在对小鼠成像前扫描孔内已预热。</li>
	<li>腹腔注射 100 mg/kg 氯胺酮和 10 mg/kg 赛拉嗪&#160;以启动麻醉。注意：上述剂量已针对 CD1(ICR) 和 NU-Foxn1 进行过测试nu 8周龄雄性小鼠。其他品系可能需要略微不同的剂量，应通过单独的预实验进行优化。此剂量可使小鼠维持麻醉状态约45分钟。注意：若动物对足部夹捏无反应，通常表明麻醉深度已足够。</li>
	<li>麻醉后，将动物置于动物固定架中并加以固定，以防止磁共振成像过程中动物移动。如有需要，将外部参考物置于动物旁边。参考物和感兴趣区域（预计注射细胞的位置）均应位于线圈中心。动物应连接体温和呼吸监测装置，以便在扫描期间进行生理监测。</li>
	<li>用无菌材料覆盖小鼠的眼睛&#160;使用眼药膏防止干燥&#160;在长时间成像过程中会减弱。</li>
	<li>如果成像时间超过40分钟，需在动物苏醒前准备额外的导管用于追加注射氯胺酮/赛拉嗪。将两个独立的皮下导管分别置于&#160;使用含有氯胺酮和赛拉嗪工作溶液的导管。在首次给药后40分钟，每隔20分钟通过该导管向小鼠追加2.5 mg氯胺酮。如有必要，在初始注射后100分钟时，可通过导管追加注射0.5 mg赛拉嗪以进一步延长麻醉时间。在所有情况下，实验时间不应超过3小时，除非在终末麻醉状态下可酌情延长。</li>
	<li>确保小鼠在第一次注射后立即进行保温，并维持其体温在37 °C。采用本方案， &#60;检测到在吸入空气条件下血氧饱和度为80%。为防止血氧降低引起的副作用，应使用100%氧气（0.3 L/min）。在整个实验过程中以及动物完全恢复之前，均需控制体温和呼吸。需注意，使用氯胺酮/赛拉嗪麻醉时，小鼠自主呼吸频率较高（200–250次/分钟）。呼吸节律的不规则性，而非呼吸频率本身，可能提示需要增加麻醉剂量以维持适当的麻醉状态。小鼠将在20–30分钟内自行苏醒。&#160;麻醉剂最后一次给药后。</li>
</ol>
注意：对于细胞追踪，需要对同一只动物进行多次成像。在此情况下，成像时间点的安排应考虑麻醉剂从动物体内清除所需的时间，并遵守所在机构的动物使用指南。
6. 成像
1H 调整与成像 
<ol>
	<li>使用低分辨率、不同切片方向的解剖扫描（定位像），将动物置于扫描仪内，使目标区域位于等中心位置。</li>
	<li>对1H采用常规匀场协议，例如对线圈内整个体积进行全局匀场。</li>
	<li>利用厂商提供的调整扫描，调节参考脉冲增益（RG），即以分贝（dB）为单位测量的1毫秒Hermite 90°射频脉冲的发射功率。</li>
</ol>
注意：该调整会因射频线圈类型的不同而有所变化，对于19F MRI而言至关重要，因为19F频率上的信号通常过弱，无法进行直接调整。因此，必须通过1H信号的测量来估算RG值。使用表面线圈进行射频发射时，应将1H RG调整至通过感兴趣区域且与线圈平行的平面；而对于具有均匀B1场分布的体线圈，该调整的具体设置则不那么重要。
<ol start="4">
	<li>以下方案的 19F 参考脉冲增益调节仅在以下两种情况下有效 1H 和 19F射频发射使用相同的（单调谐或双调谐）射频线圈进行。在此类成像设置中，线圈灵敏度分布（B1 透射场）上 1H 应与……成正比 19固定RG条件下F线圈的轮廓 即 B1,1H=C*B1,19F 比例常数 C。
	<ol>
		<li>为确认特定设置下的线圈轮廓呈正比关系，需获取一个 1H 和 a 19F 翻转角图（参见后续关于 B 的章节）1 校正）对一支高浓度的试管 19F, 例如 水与三氟乙酸（1:1 体积比）中，采用相同的视野（FOVs），预先图3).</li>
		<li>使用相同的RG，检查两张图谱是否仅在全局因子C上存在差异，其余部分完全相同。</li>
		<li>一旦 1记录所确定的 H RG 值。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行常规操作 1H MRI 扫描作为解剖学参考的 19F成像。将系统调节至 19细胞标志物的频率并进行分析 19F MR 扫描。理想情况下 19fMRI扫描将具有相同的视野和切片选择作为 1H MRI，尽管通常分辨率较低。&#160;成像完成后可立即复苏动物，随后可离线进行图像处理。&#160;</li>
	<li>确定 19F RG 通过关系 dB19FdB1H-20*log10(C). 估算 19F因子在独立样本中的频率 体外 实验</li>
</ol>
注意：体内实验中，由于不同的匀场条件，实际频率可能在不同实验间略有差异。因此，若条件允许，应通过19F磁共振波谱（MRS）在每次实验中确定精确频率，以避免化学位移伪影。对于极低19F信号的典型扫描，可采用全局（脉冲-采集）波谱法（TR = 200 毫秒，NEX = 3,000，TA = 10 分钟，BW = 50 kHz）。当19F信号较强时，NEX及相应的TA可显著减少。19F造影剂的频率通过傅里叶变换和相位校正后的谱图确定。NEX指激发次数，TA为采集时间，BW为带宽。
注：典型的成像参数9 在11.7T/16 cm专用动物成像仪上的：解剖学 1使用TR/有效回波时间（TE）的涡轮自旋回波（TSE）序列进行氢成像扫描效率) = 2,200 毫秒/42.8 毫秒，每次激发采集 8 个回波，NEX = 2，连续采集 10 层，层厚 1 毫米，FOV = 1.92 × 1.92 厘米2，128 × 128 矩阵， 即 150 × 150 × 1,000 μm 的分辨率3，TA = 1 分钟，BW = 50 kHz，采用线性相位编码方案。 19F图像采用相同的序列和匹配的几何参数获取，但平面内分辨率较低且带宽较低（NEX = 256，48 × 48矩阵， 即 400 × 400 × 1,000 μm 的分辨率3，TA = 57 分钟，BW = 10 kHz。
<ol start="7">
	<li>B1 校正 
	使用具有非均匀B的射频线圈1 轮廓， 例如 表面线圈可能会妨碍定量分析 19F 数据，因为该信号不仅取决于 19F 浓度以及与线圈的距离。获取一个 B1 地图上的 1H 通道以进行回顾性校正 19F 数据。这要求 1H 和 19F线圈的轮廓完全相同，仅比例因子C不同，且该条件已足够 1H背景信号出现在某些区域 19F. 一种用于校正的示例实验方案 19F自旋回波序列，采用可调谐至双频的单通道发射/接收表面线圈 1H 和 19F 和成比例的 B1 谱型13.
	<ol>
		<li>获取一个 1使用双翻转角法的H翻转角图 14. 采用非常长的TR获取梯度回波扫描&#62;3次 1H T1）并采用略低于90°的估计翻转角。靠近线圈处，以RG=dB采集第二组梯度回波扫描1H-6, 即 第一次扫描翻转角的两倍。</li>
		<li>计算 1H 翻转角 α 在体素 (x,y,z) 处通过第一次和第二次梯度回波扫描的信号强度（SI）计算：α(x,y,z) = arccos(SI通用电气，1(x,y,z)/2SI通用电气，2(x,y,z)14。该 19F 翻转角相同（仅差一个因子 1/C），因为 B 成正比1 根据法拉第互易原理15，衰减的 19自旋回波序列（激发翻转角 α，重聚翻转角 2α）在信号接收期间的 F 信号强度受到衰减Rx(x,y,z)~α(x,y,z)。由于激发不完全导致的衰减为 attTx(x,y,z)~sin3(α(x,y,z))16总衰减表示为 att = attRx × attTx = α × sin3(α)/90°。注意，当激发/重聚焦翻转角为理想的90°/180°时，该值被归一化为1。B1 校正的 19F图像信号强度SI19F,corr 通过 SI 计算19F,corr(x, y, z) = SI19F(x,y,z)/att(x,y,z)</li>
		<li>为了比较不同实验的信号强度，需放置一支含有已定义参数的参照管 19视野中的 F 浓度，并对 SI 进行归一化19F,corr 与参考中的平均信号相比。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
注意：可使用其他1H B1/翻转角映射方法，不同的19F脉冲序列需要对attTx,19F进行相应调整。任何类型的B1校正方案都会在细胞定量过程中引入额外误差。如果精确的细胞定量是主要前提，可使用具有均匀B1场分布的射频线圈，以规避本步骤的实验流程。
7. 图像处理
<ol>
	<li>生成 1H 和 19F 叠加图像
	<ol>
		<li>从扫描仪导出最终的 1H 和 19F 幅值图像的图像数据。</li>
		<li>在图像处理程序（如 ImageJ，NIH 免费软件）中打开这些文件。</li>
		<li>根据需要进行图像调整（裁剪、亮度、对比度），并对所有图像保持相同的调整参数。19F 图像通常需要提高分辨率以匹配相应的 1H 图像。</li>
		<li>将 19F 图像以伪彩色渲染（在 ImageJ 的 &#34;图像&#34; 菜单下选择不同的查找表），然后叠加到相应的 1H 图像上，以实现信号定位。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>19F 定量分析
	<ol>
		<li>选择一张包含目标细胞和参考物质的 19F 图像（幅值图像）。</li>
		<li>在 ImageJ 等程序中，分别在目标细胞区域、参考物质区域以及样本外部区域（噪声）绘制感兴趣区域（ROI）。</li>
		<li>使用“分析”菜单中的“测量”命令（或直接按 Ctrl+M），计算这些区域内像素的平均强度及其面积。令 S(细胞) 表示细胞 ROI 内的平均像素强度，将其乘以体积（= 面积 × 层厚）以计算总信号。</li>
		<li>计算信噪比（SNR），例如使用公式 SNR = 0.65 × S(细胞) / σ，其中 σ 是样本外部无化学位移伪影区域（通常为空气背景）ROI 内像素强度的标准差17。若 SNR 低于 5，可能需要对噪声引起的信号进行校正，具体方法可参考其他文献1110。</li>
		<li>否则，通过将参考物质在切片中的面积乘以层厚（得到体积），再乘以参考物质中已知且假设均匀分布的 19F 浓度，计算出参考物质 ROI 中产生信号的总 19F 量。</li>
		<li>将上述数值乘以细胞 ROI 的总信号，再除以参考物质 ROI 的总信号，从而计算出细胞中 19F 的总量。</li>
		<li>将该数值除以第 2 节中计算得到的每细胞 19F 含量，即可得出细胞数量。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Srinivas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+cellular+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Imaging of cellular therapies.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 62, 1080-1093 (2010).</li>
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<li>Scheffler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pictorial+description+of+steady-states+in+rapid+magnetic+resonance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Concepts+Magn.+Res%22%5BJournal%5D)">A pictorial description of steady-states in rapid magnetic resonance imaging.</a> Concepts Magn. Res. 11, 291-304 (1999).</li>
<li>Firbank, M. J., Coulthard, A., Harrison, R. M., Williams, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+two+methods+for+measuring+the+signal+to+noise+ratio+on+MR+images%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">A comparison of two methods for measuring the signal to noise ratio on MR images.</a> Phys. Med. Biol. 44, 261-264 (1999).</li>
<li>de Chickera, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labelling+dendritic+cells+with+SPIO+has+implications+for+their+subsequent+in+vivo+migration+as+assessed+with+cellular+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22Contrast+Media+Mol.+Imaging%22%5BJournal%5D)">Labelling dendritic cells with SPIO has implications for their subsequent in vivo migration as assessed with cellular MRI.</a> Contrast Media Mol. Imaging. 6, 314-327 (2011).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案概述了以下通用操作流程 体内 19f MRI 细胞追踪。尽管已描述了共孵育方法，但仍存在多种不同的细胞标记方案 19F 试剂。然而，共孵育是最常用的方法，且可进一步优化 例如 通过添加转染试剂6具体的细胞标记方案取决于细胞类型。此处仅描述标记过程中的关键步骤。通常，将制备好的标记物加入细胞中，孵育一定时间，时间范围从数小时至数天不等。最后，必须仔细洗涤细胞，以去除未结合的过量标记物，特别是在需要对图像数据进行定量分析时。3。如果 19F试剂包含荧光标记时，可利用显微镜检测细胞外（或未结合于细胞）的标记物存在情况。标记后，需针对未标记细胞评估细胞的活力与功能。例如 通过台盼蓝排斥法检测）。还必须进行细胞特异性功能测试，例如树突状细胞（DCs）激活T细胞的能力。最后，由于某些非-19fMRI 标记对细胞迁移具有影响18此类检测也应被纳入 19F标记，尤其是在高细胞载量的情况下。
<p class="j...

体内细胞示踪对于细胞治疗药物的优化与监测至关重要1。由于成像技术具有非侵入性，因此为体内细胞监测提供了极佳的机会。磁共振成像（MRI）不依赖电离辐射，能够实现更高的成像分辨率和固有的软组织对比度。基于MRI的细胞示踪已应用于临床，用于追踪黑色素瘤患者中的树突状细胞2。常规临床MRI基于组织中移动水分子内的1H原子核进行。此外，也可对其他具有磁活性的原子核（如13C、19F和23Na）进行MRI成像。然而，只有19F MRI已成功应用于体内细胞示踪，因其在1H之后具有最高的灵敏度。组织中不存在可被MRI检测到的内源性19F，这使得外源性19F对比剂的信号具有高度选择性，并允许直接从图像数据中定量氟浓度。关于19F MRI的详细讨论，参见文献3-5。19F MRI的一个关键问题在于需要开发和优化合适的19F细胞标记物，尽管目前已开发出多种标记物，且呈现向多模态探针发展的趋势6。
本文所述方案基于我们研究团队先前的研究工作7-9，其中包括最早描述基于体内定量19F MRI细胞示踪的文献10,11。使用19F MRI进行细胞示踪的一般流程如图1所示。我们介绍了一种利用自制全氟碳对比剂标记并成像树突状细胞（DCs）的通用方案8。该成像方案可广泛适用于不同类型的细胞、标记物及动物模型。此处所述的细胞类型和动物模型仅作为示例，因此我们不提供细胞分离与标记的详细步骤，而将重点放在成像方案上。针对不同的标记物、细胞类型、动物模型及成像系统，均需进行相应的调整，相关优化方法可在文献中查找或由研究人员自行确定。一些常见的调整方法已在讨论部分中列出。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MFCD00131855</td><td></td></tr><tr><td>TFA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>76-05-1</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine (Ketavet)</td><td>Pfizer</td><td>778-551</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine (Rompun)</td><td>Bayer</td><td>QN05 cm92</td><td></td></tr><tr><td>Ophtosan </td><td>Produlab Pharma</td><td>2702</td><td>眼膏</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;材料名称&lt;/strong&gt; </td></tr><tr><td>MRI scanner</td><td>Bruker Biospec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NMR spectrometer</td><td>Bruker Biospec</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo 19f mri 细胞示踪

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

体内 19F MRI 可实现无需电离辐射的细胞定量示踪，是一种可应用于人类的非侵入性技术。本文介绍了一种通用的细胞标记、成像及图像处理方案。该技术适用于多种细胞类型和动物模型，但本文以小鼠模型追踪小鼠免疫细胞为例进行说明。文中阐述了细胞标记过程中最关键的问题，因为这些要点适用于所有模型。同样，本文列出了关键的成像参数，尽管具体数值会因 MRI 系统和具体实验设置的不同而有所差异。最后，我们提供了一套用于定量分析的图像处理流程。对于本方案及其他部分的可能变异，将在讨论部分进行评估。根据本文所述的详细步骤，使用者需针对每一种特定的细胞类型、细胞标记物、动物模型和成像系统对方案进行相应调整。请注意，只要符合临床使用限制，该方案也可适用于人类研究。

在此，我们展示了涉及转移的实验方案的典型结果 19F标记细胞归巢至引流淋巴结。 图2 显示一个 19F NMR 谱图（10）6 使用TFA参考标记细胞。成像设置按照本方案中所述进行（图3）。对于 体内 成像时，我们使用了一个密封的圆柱体作为参考，该圆柱体与用于细胞的标记物相同，并置于小鼠足部之间。图中显示了一幅具有代表性的处理后图像。 图4. 通过应用第7.2节中所述方案，我们计算得到细胞数量约为1.2 × 106 根据原始数据 19F 幅值图像。
<img alt="Label synthesis, cell labeling strategies, imaging, data processing, ex vivo analyses diagram." fo:content-w...

我们描述了一种在小鼠模型中使用MRI进行体内细胞示踪的通用方案，其中细胞经过体外标记。本文包括典型的细胞标记、图像采集、处理与定量分析流程。

in vivo 19F MRI 细胞示踪

活体19F MRI可在无需电离辐射的情况下实现细胞的定量示踪，是一种可应用于人类的非侵入性技术。

本实验的总体目标是利用19F MRI在体内成像并定量19F标记的细胞数量。该方法可在临床或临床前环境中实施。首先使用合适的19F标记试剂对细胞进行标记，以实现这一目标。这一步骤最常在离体条件下进行。第二步是量化每个细胞中的19F含量，可通过使用已知参考物质的19F磁共振（MR）来实现。通常假设每个细胞中的19F含量在实验过程中保持恒定，否则需计算校正因子。接下来，使用¹H和¹⁹F MRI对受试者进行活体成像，以定位转移的标记细胞。已知的参考物和适当的成像参数对于从图像数据中进行定量分析至关重要。最后一步是处理图像数据，以计算细胞数量。在可能的情况下，可使用离体组织学或其他技术来验证数据。最终，活体细胞示踪的 19 FMRI 可用于在相关时间段内研究移植细胞的定位和数量，前提是满足文中所述的某些假设条件。与现有的超顺磁性细胞标记 HMRI 等方法相比，该技术的主要优势在于不存在干扰性的背景信号，并且可以直接从图像数据中确定细胞数量。该方法有助于回答细胞治疗领域中的关键问题，例如在不同时间点细胞位于何处以及其数量有多少。开始本方案时，首先在2毫升培养基中，以每100万细胞4毫克的浓度将19F标记物加入未成熟树突状细胞中。然后轻轻涡旋混匀。接下来，将树突状细胞与标记物共同孵育三天，然后进行成熟和收获。随后收集细胞，并通过至少三次洗涤去除多余的标记物。在 PBS 中计数，将所得细胞重悬于少量 PBS 中，用于注射或进一步检测。请注意，此处所述的实验方案仅适用于这些特定的树突状细胞和标记物。因此，针对其他细胞类型的实验方案需在文献中查找，或由研究人员进行优化。将已知数量的标记细胞放入核磁共振管中。然后加入 10 µL 的 5% 三氟乙酸（TFA）。如果由于与标记物信号重叠导致 TFA 的共振频率不适用，请使用其他可溶性化合物作为替代。将样品放入核磁共振波谱仪中，获取氟-19 谱图。然后计算参考物质与样品或样品主峰的峰下相对面积，进而计算样品中每个细胞的平均氟原子数。请注意，整个过程应重复进行多次以达到统计学显著性。此步骤也可直接在磁共振成像仪上通过光谱学方法完成。还需注意，该方法仅能揭示大量细胞的平均氟-19负载量，而无法反映细胞间的异质性。要检测细胞摄取的均匀性，需在氟-19试剂中加入荧光组分。此处仅第三种情况显示细胞标记均匀，尽管在计算中通常默认标记均匀，但可通过互补技术（如成像显微镜）进行验证，方法是将完全麻醉的小鼠置于固定托架中并加以固定，以防止扫描过程中发生移动。同时，连接温度和呼吸控制装置，以在扫描期间进行生理监测。如有需要，将外部参考物放置在动物旁边，参考物和感兴趣区域均应位于线圈的中心。首先进行常规质子 MRI 扫描，作为 19F 成像的解剖学参考。然后将系统调谐至细胞标记物的19F频率，并进行19F MRI扫描。理想情况下，19F MRI扫描应与常规MRI具有相同的视野和层面选择，尽管分辨率可能较低。接着，使用此处所示公式确定19F参考脉冲增益，并采集19F NMR谱以确定19F频率。在单独的体外实验中估算射频线圈相关的因子 C。使用具有非均匀 B1 轮廓的射频线圈（例如表面线圈）可能会影响 19F 数据的定量，因为信号不仅取决于 19F 浓度，还取决于与线圈的距离。因此，需在¹H通道上采集一幅B₁图，以对¹⁹F数据进行回顾性校正。这要求¹H与¹⁹F线圈的剖面分布完全相同，仅允许存在一个比例因子C，且在¹⁹F信号区域中需具备足够的¹H背景信号。此处显示的是水中含三氟乙酸（TFA）的试管在¹H和¹⁹F通道下采集的翻转角图。为校正¹⁹F数据，首先需采用双翻转角方法在¹H通道采集一幅翻转角图。使用梯度回波扫描，其 TR 时间非常长，超过三个 HT，翻转角估计值略低于 90 度，靠近线圈处。然后进行第二次梯度回波扫描，其翻转角为第一次扫描的两倍。通过第一次和第二次梯度回波扫描的信号与灵敏度，计算在 vle X, Y, Z 处的¹H 翻转角 α。19F翻转角将完全相同，仅因B1剖面成比例而存在因子C的差异。在屏幕上显示的是：自旋回波序列中，激发翻转角为α、重聚焦翻转角为2α、信号接收期间的19F信号强度衰减情况。此处显示的是由于激发不理想所导致的衰减。随后可计算总体衰减。请注意，在激发和重聚焦翻转角分别为完美的90度和180度时，归一化值为1，经B1校正后的19F图像信号强度SI19F校正可通过该公式计算，以生成1H与19F的叠加图像。导出图像数据，并在图像处理软件（如ImageJ）中打开文件，根据需要进行图像调整，确保所有图像的调整参数保持一致。随后将19F图像以伪彩渲染，并叠加至相应的1H图像上。为定位信号，选择含有相关细胞的19F幅值图像，并在相关细胞、参考区域以及受试体外的背景噪声区域绘制感兴趣区域（ROI），如示例所示。注意，此处显示的1H解剖图像仅为清晰示意。随后可利用简单的比例关系及每个细胞的19F信号值，估算ROI内的细胞数量。这些图像是涉及19F标记细胞归巢至引流淋巴结的实验方案的典型结果。此处显示的是使用ATFA作为参考物时，100万标记细胞的19F核磁共振（NMR）谱图；此处显示的是体内成像的代表性处理后图像。作为参考的密封容器内含有与细胞标记相同的标记物，置于小鼠两足之间。通过应用所述方案，我们基于原始的19F磁共振信号强度图像计算出细胞数量约为120万。19F图像以伪彩色叠加于灰度解剖质子图像之上。在建立新实验时，验证氟信号至关重要。将 MRI 结果与组织学、光学成像或其他方法进行对比。例如，需要注意的是，当细胞死亡后，氟标记物可能仍残留在组织中，从而导致假阳性信号。

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