芯片上应激诱导的抗生素敏感性测试

以下实验的总体目标是快速测定细菌对目标抗生素的敏感性。该目标通过以下步骤实现：首先将处于对数生长期的细菌固定在微流控通道底部；第二步，以高流速将含有抗生素及活/死荧光染料的培养基注入通道，使细菌受到胁迫，并激活其针对抗生素的生化代谢通路。

接下来，每两分钟自动采集一次相差和荧光图像，持续一小时，以监测细菌活力；根据实验每个时间点获取的图像计算归一化的细菌死亡百分比。最终，通过归一化细胞死亡百分比随时间的增加来确定细菌的抗生素敏感表型。该技术相较于现有的表型敏感性检测方法（如肉汤稀释法、稀释法或微培养法）的主要优势在于，我们的方法无需监测细菌分裂过程。

相反，我们可以直接从现有的少量样本中获取其敏感性谱型。该技术对于耐药性细菌感染的诊断具有重要意义，因为该方法快速、易于实现多重检测，并可自动化。要制备PDMS层，首先将新配制的黏稠PDMS混合物在室温下置于真空箱中脱气；一小时后，使用天平将预定质量的DGA-PDMS混合物倒入铝制模具中。将PDMS缓慢倾倒至模具中心，注意保持模具水平，并确保针脚不被覆盖。

将PDMS在37摄氏度的烘箱中过夜固化。次日早晨，松开顶部模具板，小心地将固化的PDMS从模具上取下，以组装流动池。首先，将玻璃窗口放入流动池的凹槽中。

然后将镀膜玻片有活性的一面朝上，放置在流动池口袋内玻璃窗口的上方。将新制备的PDMS层通道面朝下置于其上，使通道入口与金属板上的通孔对齐。轻轻挤出各层之间的空气，然后翻转PDMS-玻片组装体，使PDMS面朝向玻璃窗口。

将PDMS通道的入口与金属板上的通孔对齐，然后将压力板放在上方并拧紧螺丝。现在将组装好的流动池置于显微镜下，将显微镜放大倍数设置为60倍，并预先对准通道位置，以准备将对数生长期的细菌加载到流动池中。取50微升过夜培养的目标细菌菌落，混入50毫升新鲜MH二号肉汤中。在37摄氏度、250 RPM振荡条件下培养3小时。继代培养后，在室温下以1,650 × g离心10毫升菌液2分钟。

然后去除上清液，并将沉淀重悬于1毫升新鲜的MH二号培养基中。接着，将一段短管连接到1毫升注射器上，并用1毫升培养基冲洗管路，管路中保留少量培养基，以避免在吸入细菌悬液时产生气泡。随后，将0.7毫升细菌悬液装入注射器中，并用该细菌培养物填充流式细胞仪的两个通道。

随着细菌进入通道，通道的透明度会发生变化。随后将流动池在37摄氏度下孵育45分钟，以使细菌附着到载玻片表面。为实验准备所需溶液。

首先，用新配制的对照溶液填充两支60毫升注射器，再用新配制的抗生素溶液填充另外两支60毫升注射器。轻弹注射器以去除所有气泡，然后连接进液管路，将相应溶液推注通过管路末端。将溶液用铝箔包裹，避免光照导致试剂降解。

现在将装有实验溶液的注射器逐个安装到泵上。必要时挤压其推杆以将其安装到泵上。使用注射器固定横杆将注射器锁定到位。

将泵速设置为每分钟1毫升，泵体积设置为60毫升，并冲洗泵，直到从所有注射器中观察到稳定的液体流动。现在，通过将流动池从培养箱中取出并安装到预先未对准的显微镜载物台上，开始实验。接下来，将一根来自注射器的进样管和一根通向废液瓶的出样管分别连接到每个流动池通道。

此时，实验已完全准备就绪，可以开始。将相差成像的采集时间设置为 10 毫秒，荧光成像的采集时间设置为 1600 毫秒，然后在启动流体之前，对每个位置获取相差图像和荧光图像。请注意，在开始流体成像前，由于通道内加载的细菌密度过高，可能无法聚焦到通道底部。

现在开始液体流动。立即检查显微镜是否聚焦在通道底部。然后在开始流动后的第一分钟内，对目标区域进行相差和荧光成像。

每获取一次初始图像后，每隔两分钟采集一次图像，直至灌流持续60分钟。根据需要重新对焦，以确保实验正常进行，并可检查已获取的相差图像和荧光数据。在此数据样本中，敏感菌株被加载至通道一和通道二，而耐药菌株则被加载至通道三和通道四。

实验结束时，依次使用次氯酸钠溶液和水运行清洗程序。取四个 20 毫升注射器，各装入 10 毫升 10% 次氯酸钠溶液，另取四个 60 毫升注射器，装入去离子水。去气泡后，将装有次氯酸钠的注射器连接至流路池，设置泵速为 1 毫升/分钟，泵送体积为 3 毫升。

启动泵运行三分钟，并在屏幕上监测通道的清洗情况。三分钟后，将次氯酸钠注射器更换为水注射器，并以每分钟1毫升的速度继续运行30分钟。最后，使用图像处理软件统计每张图像中细菌的数量。

使用以下公式计算归一化的细菌细胞死亡率随时间的变化，其中 NF 表示在荧光图像计数中观察到的死亡细菌数量，NP 表示根据相差图像确定的细菌总数。此处显示的图像说明了在微流控流动池中，敏感性金黄色葡萄球菌菌株对苯唑西林随时间变化的响应情况。

这些象限显示了实验开始后一分钟和一小时拍摄的相差图像，以及对应的荧光图像。实验结束时，可观察到荧光细菌数量显著增加，表明通道内细胞发生死亡，且该菌株对抗生素具有敏感性，这种现象可能与单个环氧树脂包被载玻片的随机非均匀性有关。在整个实验过程中，持续的剪切应力可能导致细菌细胞丢失，从而造成上述差异；因此，每个死细胞群体的荧光图像均通过同时采集的相差图像进行归一化处理，以获得同一时间点前后一秒内的总细胞群体数量。

这些放大图像表明，与高密度的相差图像相比，计数算法在荧光图像中对单个细菌的准确计数更为成功。死细胞染色使单个死细菌呈现出高荧光对比度。由于荧光细菌的数量很少超过总数的5%，每个细菌与背景相比都显得非常明亮。

因此，荧光细菌可被准确计数，具有较高的精确度。例如，在本实验检测到的共计 5,828 个细菌中，以红色高亮显示的 174 个被确定为死菌。三种不同实验的标准化 MSSA 和 Mr.RSA 数据显示，对于耐药菌株，标准化细胞死亡率较低，幅度小于 0.5%，且在整个实验过程中无明显变化。

然而，敏感菌株在整个实验过程中表现出持续增加的细胞死亡率，到实验结束时其数值高于1%。敏感菌株的细胞死亡启动时间在不同实验之间略有差异，但通常发生在10至30分钟之间。请注意，操作耐药性病原体可能具有极高危险性，因此在进行该操作时，必须采取无菌技术等预防措施。

该技术将为研究人员探索细菌对压力的响应机制铺平道路，并将影响新型快速诊断方法的开发以及新药的发现。