Name: 芯片上的压力诱导抗生素易感性测试 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 41 s
Description: 了解微流控芯片技术用于快速检测细菌抗生素敏感性。该方法通过高流速施加压力应激，结合荧光成像实时监测细菌存活率，无需等待细菌分裂即可完成药敏表型判定。

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我们感谢弗劳恩霍夫制造创新中心的工程师和学生们。感谢安德烈亚斯·普林岑、霍尔格·维尔茨、道格·福斯、大卫·查金以及舒苏东博士在实验系统的设计、加工和自动化方面提供的帮助。感谢朱莉娅·库查茨、梅兰妮·齐默尔曼、尼科·克雷茨马尔、蒂姆·甘贝尔、乔希·维拉纽瓦、岛津美诺里以及卡塔日娜·库里加在实验方案测试和数据收集方面提供的协助。我们感谢哈佛大学和麻省理工学院布罗德研究所影像平台的安妮·E·卡彭特博士和马克-安东尼·布雷博士，他们在使用CellProfiler开发图像分析流程方面提供了帮助。本项目部分得到了美国国家过敏与传染病研究所资助项目R21AI079474和1R01AI101446的支持。本内容仅由作者负责，不一定代表美国国家过敏与传染病研究所或美国国立卫生研究院的官方观点。该项目还得到了美国弗劳恩霍夫协会的支持。

1. 制备PDMS层（图1）
<ol>
	<li>按10:1的比例充分混合PDMS和固化剂。为去除气泡，将粘稠的混合物在室温下置于真空箱中脱气1小时。</li>
	<li>在天平上，将PDMS缓慢倒入铝制模具中。从中心开始倾倒，并保持模具水平。确保销钉部分不被覆盖。达到目标重量后即停止倾倒。 
	我们的模具需要4 g PDMS和0.4 g固化剂。</li>
	<li>将模具放入烘箱中调平，于37 °C下过夜固化。 
	也可选择在60 °C下固化2小时，或在90 °C下固化1小时。</li>
	<li>沿模具边缘切开固化的PDMS层，并用镊子小心地从模具表面剥离。用70%乙醇和棉签清洁模具表面。</li>
</ol>
2. 根据图2组装流路池
PDMS与载玻片的标准组装通常通过氧气等离子体处理两个表面来实现，以确保PDMS与显微镜载玻片之间无泄漏的键合。在本方案中，等离子体处理会破坏载玻片上的化学涂层。因此，载玻片采用压力密封而非等离子体处理。
<ol>
	<li>将玻璃窗放入流动池的插槽中。</li>
	<li>将涂覆过的载玻片活性面向上置于流动池插槽内的玻璃窗上，再将带有微通道的PDMS层通道面向下放置于其上。放置PDMS片时，应使通道入口与金属板上的通孔对齐。轻轻挤压以排出各层之间的空气。</li>
	<li>翻转PDMS/载玻片组件，使PDMS面朝向玻璃窗，并将PDMS通道入口与金属板上的通孔对齐。</li>
	<li>将压力板置于顶部并拧紧螺丝。</li>
	<li>将组装好的流动池置于显微镜下，将显微镜放大倍数设为60倍，并预先对准通道位置。</li>
</ol>
3. 准备对数生长期细菌
<ol>
	<li>实验前一天：取一细菌菌落接种于50 ml含2% NaCl的Mueller Hinton肉汤（MH2）中，于37 °C、250 rpm条件下振荡培养过夜。 
	在本实验设置中，一次实验可同时研究一种或两种细菌菌株。</li>
	<li>实验前：将50 µl过夜培养的细菌菌液加入50 ml MH2培养基中，于37 °C、250 rpm条件下振荡培养3小时，以确保细菌处于对数生长期。</li>
</ol>
4. 实验溶液组分使用前至少预热10分钟
<ol>
	<li>在室温下解冻荧光染料（5 mM 储液）和溶葡球菌酶（10 µg/ml 储液）。</li>
	<li>将苯唑西林粉末 warming 至室温。</li>
</ol>
5. 准备并加载细菌悬液
<ol>
	<li>3小时亚培养结束后：取10 ml细菌培养液，于1,650 x g离心2分钟。</li>
	<li>移除上清液，并将细菌重悬于 1 ml 新鲜 MH2 培养基中。</li>
	<li>将一段短管连接到1 ml鲁尔锁式注射器上。用1 ml培养基冲洗注射器和管路。在管路中保留少量培养基，以避免吸取细菌悬液时产生气泡。</li>
	<li>将0.7 ml细菌类型1加入注射器中。用细菌类型1填充流式细胞仪的两个通道。观察液体是否出现在通道另一侧 ca. 150 µl. 
	随着细菌填充通道，其透明度发生变化。</li>
	<li>若同时实验多种细菌，将细菌类型2的加样步骤重复用于流式细胞仪中剩余的两个通道。</li>
	<li>将流动池放入孵育箱内 37 °C 孵育45分钟，以使细菌沉降并附着于载玻片表面。</li>
</ol>
6. 准备并加载实验溶液
<ol>
	<li>通过将14 µl荧光染料原液（5 mM）与126 µl MH2培养基混合，配制140 µl的0.5 mM荧光染料溶液。</li>
	<li>将10 mg苯唑西林溶于40 ml MH2培养基中，得到终浓度为250 µg/ml的苯唑西林溶液。</li>
	<li>配制130 ml对照溶液，终浓度为0.25 µM荧光染料和0.7 ng/ml溶葡萄球菌素。具体操作为：将65 µl荧光染料溶液（0.5 mM）、9.12 µl溶葡萄球菌素原液（10 µg/ml）与130 ml MH2培养基混合。</li>
	<li>配制130 ml抗生素溶液，终浓度为0.25 µM荧光染料、0.7 ng/ml溶葡萄球菌素和50 µg/ml苯唑西林。具体操作为：将65 µl荧光染料溶液（0.5 mM）、9.12 µl溶葡萄球菌素原液（10 µg/ml）、26 ml苯唑西林溶液（250 µg/ml）与104 ml MH2培养基混合。</li>
	<li>用对照溶液填充两个60 ml注射器，另用抗生素溶液填充两个60 ml注射器。将溶液用铝箔包裹，避免光照导致试剂降解。 
	注射器应过量填充，以补偿管道冲洗过程中的液体损耗。</li>
	<li>轻弹注射器以去除气泡。将进样管连接至注射器出口，并用实验溶液充满管道。</li>
	<li>将注射器安装至泵上。先安装体积最小的注射器，并固定其推杆位置。再依次安装其余注射器，必要时挤压推杆以确保密合。</li>
	<li>将泵的流速设为1 ml/min，泵送体积设为60 ml。启动泵进行冲洗，直至所有注射器均流出稳定的液流。</li>
</ol>
7. 在显微镜下设置流动池
<ol>
	<li>从离心机中取出流动池，并将其安装到显微镜载物台上（图3）。</li>
	<li>将输入/输出管路连接到每个流动池通道（每个通道各有一个输入和一个输出）。 
	将输出液分别收集到四个不同的容器中，以便测量各个通道的输出体积。</li>
</ol>
8. 运行60分钟实验
<ol>
	<li>检查步骤 2.5 中的预对准位置。如果显微镜视野未居中于通道和/或处于失焦状态，请调整设置并保存新的位置。 
	由于加载的细菌密度较高，可能在流动开始前无法实现精确对焦。</li>
	<li>将相差图像的采集时间设置为 10 msec，荧光图像的采集时间设置为 1,600 msec。</li>
	<li>在启动流动之前，获取每个位置的相差和荧光图像。 
	这可对加载的细菌密度进行定性评估。</li>
	<li>启动液体流动，并立即检查显微镜是否聚焦在通道底部。</li>
	<li>在流动开始后的第一分钟内，获取目标区域的相差和荧光图像。</li>
	<li>在获取第一组图像后，每隔 2 分钟采集一次图像，直至流动持续 60 分钟。根据需要重新对焦。</li>
</ol>
9. 对流动池进行消毒
<ol>
	<li>在烧杯中配制10%的漂白剂溶液（100 ml）。用该混合液填充4个20 ml注射器，每个注射器装入10 ml。去除注射器中的气泡，并将其连接至流动池。 
	通道内的细菌将在约1–2分钟内被清除。</li>
	<li>将泵的流速设为1 ml/min，泵体积设为3 ml。运行3分钟。</li>
	<li>用去离子水填充4个60 ml注射器，每个注射器装入60 ml。去除注射器中的气泡，并将其连接至流动池。</li>
	<li>将泵的流速设为1 ml/min，泵体积设为30 ml。运行30分钟。</li>
	<li>在显微镜下监测通道的清洗情况。</li>
	<li>拆卸流动池。丢弃已使用的环氧树脂载玻片。将流动池组件浸泡在去离子水中20分钟，然后自然晾干。</li>
</ol>
10. 分析图像并生成数据
<ol>
	<li>统计每张图像中的细菌数量。 
	使用开源软件 CellProfiler 进行批量图像处理16。CellProfiler 操作流程的高级概述见表1。相位对比图像中检测到的细菌数量（Np）代表总细菌数。荧光图像中可见的细菌数量（Nf）代表死亡细菌数。</li>
	<li>计算随时间变化的归一化细菌细胞死亡百分比。
	<ol>
		<li>将单个图像的 Nf 和 Np 导入数据分析软件。</li>
		<li>计算在特定时间点（t = T）每个通道中死亡细菌所占比例，即 (Nf / Np) 的比值。</li>
		<li>从实验组和对照组各时间点的数据中减去实验开始时（t = 1 min）已存在的死亡细菌比例。</li>
		<li>在每个时间点，使用以下公式从实验通道的死亡细菌比例中减去对照通道的死亡细菌比例： 
		 
		<img alt="细菌细胞死亡分析示意图；抗生素存在与缺失；荧光计数。" fo:content-width="6in" height="217" src="/files/ftp_upload/50828/Data_analysis_equation.png" width="620" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="数据分析方程"></li>
		 
		<li>绘制整个实验过程中 DPnorm 随时间 t 的变化曲线。 
		注意：若样品的细胞死亡率大于1%，则判定为敏感；若死亡率小于0.5%，则提示具有耐药性。介于这两个阈值之间的结果视为不确定，需重新检测该样品。</li>
		<li>使用电子表格汇总并分析不同实验的结果。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

微流控方法正在申请专利：&#160;Sauer-Budge A, Sharon A, Kalashnikov M, Wirz H, 发明人；细菌抗生素耐药性/敏感性的快速检测方法及装置，专利号 PCT/US10/33523。

所展示的方案已在一系列实验中进行了验证和优化，实验涉及甲氧西林敏感和甲氧西林耐药 Staphylococcus aureus 菌株10. 因此，本方案在未经修改的情况下应可直接适用于其他菌株 S. aureus 以及其他作用机制为影响细菌细胞壁生物合成的抗生素。除以下细菌类型外 S. aureus&#160;可能需要调整应力参数：可溶性（酶解性）应力和机械应力。如果希望在测试除……以外的细菌种类时使用可溶性应激因子 金黄色葡萄球菌， 需要另一种应激试剂，因为溶葡球菌酶是一种葡萄球菌来源的-特异性酶。
剪切应力的大小与液体的流速成正比，与通道尺寸成反比，因此原则上可在较大范围内调节。实际达到的应力值受到以下实验因素的限制：固定化基底在较高流速下固定细菌的能力、微流控装置在高压下不发生泄漏的耐受性、系统内部的液体流动阻力，后者可能导致流速不稳定，甚至在较低流速时完全阻断流动。当前的结合强度足以满足金黄色葡萄球菌（S. aureus）的实验需求，但若提高流速或...

细菌耐药性的上升加剧了对快速基于表型的抗生素敏感性检测的需求，以保护我们的最后一道防线药物。标准的敏感性检测依赖于在抗生素存在下细菌生长抑制的情况，通常需要多个（8-24）小时才能完成。我们开发了一种基于微流控平台的新型抗生素敏感性检测方法，该方法利用生物合成途径的应激激活来加速抗生素的作用。
微流控尺度的抗生素敏感性测试具有高效利用样本的优势，因其仅需少量细菌。此外，微流控装置可实现多重化，以便在多种条件下同时检测多个样本1,2最近，已有多种用于抗生素药敏试验的微流控方法被报道3-9在这些方法中，细菌在纳升和皮升级别的液滴内生长3,7微流控通道的整个体积中4-6,8，或作为单个细菌在电学上定位于通道底部表面9尽管这些检测在微流控通道中进行，但它们均通过监测微生物在有无抗生素条件下的生长情况来评估，与传统方法类似。生长情况的测量通过以下方式获取 通过 光密度、pH敏感性染料，或明场/相差或荧光图像。尽管其中一些检测方法比传统方法更快，但它们均属于被动检测抗生素耐药性。换句话说，这些方法仍需要用户等待细菌生长作为最终的读数结果。
相比之下，我们开发了一种方法，利用剪切力与酶解应激的组合来激活对抗生素敏感的生化通路10。通过抗生素对处于应激状态的细菌进行挑战，可实现更快速的敏感性检测。对抗生素耐药的细菌能够耐受这些应激条件，而敏感细菌则会因复合应激而迅速死亡。通过显微镜结合荧光死细胞染料，在一小时后测定的细菌死亡百分比，可确定其表型（耐药性与敏感性）。
要成功实施本方法，必须将细菌固定在微流控通道的底面。通过这种方式，可对细菌施加多种应力，并在同一平面上通过显微镜同时进行成像观察。细菌固定采用经过涂层处理的显微镜玻片。该玻片由制造商预先包被了环氧基团，用于非特异性蛋白结合。这些环氧基团与细菌表面蛋白发生非特异性结合，从而通过共价作用将细菌固定在玻片表面。
在无抗生素（对照）和有抗生素（实验）的条件下，对菌株进行相同的测试环境（剪切力+酶解压力）处理。每两分钟自动拍摄一次每个通道的相差显微镜和荧光显微镜图像，持续一小时。通过比较实验通道与对照通道中死亡细菌的百分比，确定耐药性判定结果。一小时后，若样本的细胞死亡率大于1%，则判定为敏感；若死亡率小于0.5%，则提示具有耐药性。介于这两个阈值之间的百分比结果视为不确定，需重新检测该样本。
微流控通道由聚二甲基硅氧烷（PDMS）定义，PDMS 是微流控装置的首选材料11。PDMS 在较宽的波长范围内具有光学透明性，且具备生物相容性、化学惰性、气体可渗透性以及对液体的低渗透性；因此非常适合用于这些实验。
通过室温培养基在固定化的细菌表面流动产生机械/剪切应力。（注意：将培养基预热至 37 °C 对检测结果无显著影响。）自动注射泵将培养基（含死细胞染料 +/- 抗生素，以及可选的酶促应激剂）以 1 ml/min 的流速泵入微流控通道（200 µm x 400 µm），从而产生 6.25 kPa 的剪切力或 6,000 sec-1 的剪切速率。该速率等于或超过先前对Staphylococci研究中所施加的剪切应力。
选择溶葡球菌酶（lysostaphin）进行初步实验，是因为该酶可直接破坏Staphylococcus的细胞壁。溶葡球菌酶的浓度（0.7 ng/ml）足以引起细菌细胞壁损伤，但在实验时间范围内，若无抗生素存在，则不足以导致细菌细胞死亡。溶葡球菌酶对于正确判定细菌敏感性并非必需，但可增强实验结果，导致敏感菌株的细胞死亡增加。相比之下，剪切应力对检测功能至关重要。当甲氧西林敏感的Staphylococcus aureus菌株在无流动条件下用溶葡球菌酶和苯唑西林处理时，在整个实验过程中未记录到细胞死亡现象。
细胞活力通过荧光死细胞染料进行监测12。染料的选择基于其仅能特异性染色受损细胞、对活细胞无毒性以及背景荧光低等特性，因此可直接加入细胞培养基中，无需额外步骤。选择0.25 µM的荧光染料浓度，是为了在1.6秒的荧光激发光照射时间内获得可接受的信号水平。
在我们的初步研究中使用了β-内酰胺类抗生素苯唑西林。S. aureus（耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，MRSA）对苯唑西林具有耐药性，在实验时间范围内不会表现出明显的细胞死亡。50 µg/ml 的浓度是在初步研究中确定的。较低的抗生素浓度导致耐药株与敏感株之间的区分度降低，而较高的浓度则不会对实验结果产生明显差异。
我们此前已报道了一种成功开发的检测方法，该方法结合了直接影响细菌细胞壁的机械和酶解压力13 ，以及一种抑制细胞壁生物合成的抗生素14,15。这些原理验证实验是在一系列耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和甲氧西林敏感型金黄色葡萄球菌（S. aureus，MSSA）菌株上进行的。然而，通过选择合适的实验参数，该方法应可适用于多种细菌物种及多种类型的抗生素。

<table><tbody><tr><td>SYTOX Green</td><td>Invitrogen Corporation</td><td>S7020</td><td>死细胞荧光染料</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma Aldrich, Inc</td><td>A9418-5G</td><td>用于溶葡萄球菌酶的储存</td></tr><tr><td>乙酸钠</td><td>Sigma Aldrich, Inc</td><td>S8750-500G</td><td>用于溶葡萄球菌酶的储存</td></tr><tr><td>溶葡萄球菌酶&amp;nbsp;</td><td>Cell Sciences</td><td>CRL309A</td><td>以1 mg固体形式送达。储存方法：溶于20 mM乙酸钠溶液中，再与BSA溶液混合，最终浓度为1% BSA和100 &amp;micro;g/ml &amp;nbsp;溶葡萄球菌酶&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>氯唑西林钠盐</td><td>Sigma Aldrich, Inc</td><td>28221-1G</td><td>抗生素</td></tr><tr><td>穆勒-欣顿肉汤（Mueller Hinton Broth）</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0757-17-6</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma Aldrixh</td><td>S3014-500G</td><td>在高压灭菌前加入至穆勒-欣顿肉汤中，终浓度为2%</td></tr><tr><td>1 ml，鲁尔锁扣注射器&amp;nbsp;</td><td>BD (Beckton, Dickinson and Comp.)</td><td>14-823-2F</td><td></td></tr><tr><td>2 oz，鲁尔锁扣注射器</td><td>BD (Beckton, Dickinson and Comp.)</td><td>309653 - 60 mL</td><td>过量填充至约65 ml</td></tr><tr><td>显微镜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>倒置荧光显微镜 Olympus IX-70</td><td>Cambridge Scientific</td><td>9349</td><td></td></tr><tr><td>60倍，荧光/相差物镜</td><td>Olympus Corp.</td><td>LCPlan F1 60x/0.70 Ph2</td><td></td></tr><tr><td>Retiga 12位单色CCD相机</td><td>QImaging</td><td>RET-4000R-F-M-12-C</td><td></td></tr><tr><td>显微镜自动化系统</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>相差/荧光快门控制器</td><td>PRIOR Scientific</td><td>H204/H202</td><td></td></tr><tr><td>X/Y 载物台&amp;nbsp;</td><td>PRIOR Scientific</td><td>H107AENN</td><td></td></tr><tr><td>聚焦电机</td><td>PRIOR Scientific</td><td>H122</td><td></td></tr><tr><td>用于XYZ控制的操纵杆</td><td>PRIOR Scientific</td><td>CS152EF</td><td></td></tr><tr><td>Proscan 控制器</td><td>PRIOR Scientific</td><td>H3-XY2</td><td></td></tr><tr><td>图像采集软件</td><td>Fraunhofer CMI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>流动池组件与PDMS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>流动池</td><td>BU Scientific Instruments Facility/Fraunhofer CMI</td><td>3333-1044</td><td>工程图纸由Fraunhofer CMI设计</td></tr><tr><td>玻璃窗口</td><td>Fraunhofer CMI</td><td>3333-1054</td><td>玻璃窗口由Fraunhofer CMI按适当尺寸切割</td></tr><tr><td>BOROFLOAT 窗口 50 mm x 50 mm</td><td>Edmund Optics Inc.</td><td>NT48-543</td><td></td></tr><tr><td>密封板</td><td>BU Scientific Instruments Facility</td><td>3333-1045</td><td></td></tr><tr><td>环氧涂层载玻片</td><td>Arrayit Corporation</td><td>SuperEpoxy 2</td><td></td></tr><tr><td>PDMS模具</td><td>Fraunhofer CMI</td><td>3333-1053</td><td>使用UPM-0005（超精密飞刀切削机）在铝或黄铜上加工而成</td></tr><tr><td>PDMS载片设计</td><td>Fraunhofer CMI</td><td>3333-1053</td><td></td></tr><tr><td>管路</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>螺母，超无法兰Tinytight，无头，1/16英寸，PEEK材质，绿色&amp;nbsp;</td><td>IDEX Health Science</td><td>M-644-03</td><td>流动池的输入/输出端口为此卡套设计攻丝</td></tr><tr><td>卡套，Tinytight，1/16英寸，6-40，.030英寸管厚，PEEK材质带不锈钢锁环，黑色</td><td>IDEX Health Science</td><td>M-657</td><td></td></tr><tr><td>螺母，超无法兰Tinytight，无头，1/16-1/32英寸，1/4-28，PEEK材质，本色</td><td>IDEX Health Science</td><td>P-255</td><td></td></tr><tr><td>卡套，超无法兰，1/16英寸，Tefzel (ETFE)材质，黄色</td><td>IDEX Health Science</td><td>P-259</td><td>适配鲁尔锁扣接头</td></tr><tr><td>管路，Teflon FEP材质，.030英寸 x 1/16英寸 x 20英尺，绿色&amp;nbsp;</td><td>IDEX Health Science</td><td>1520G</td><td></td></tr><tr><td>接头，快接式母鲁尔接母1/4-28，PEEK材质，红色&amp;nbsp;</td><td>IDEX Health Science</td><td>P-658</td><td></td></tr></tbody></table>

芯片上应激诱导的抗生素敏感性测试

Stress-induced Antibiotic Susceptibility Testing on a Chip

我们开发了一种在应激环境下用于抗生素敏感性检测的快速微流控方法。液体以高速流过固定在微流控通道底部的细菌。在应激和抗生素同时存在的情况下，敏感菌株会迅速死亡，而耐药菌株则能在这些应激条件下存活。该方法背后的假设是全新的：抗生素作用靶点相关的生化通路在应激激活后，可加速抗生素敏感性检测过程。与传统的抗生素敏感性检测方法相比，该方法在抗生素作用期间省略了限速步骤——&#160;细菌生长——&#160;。该方法的技术实现结合了标准技术与创新手段。标准部分包括细菌培养方案、在聚二甲基硅氧烷&#160;(PDMS)中构建微流控通道、利用荧光监测细胞活力，以及通过批量图像处理进行细菌计数。创新部分则包括利用培养基流动施加机械应激、使用酶类对细菌造成损伤但不致其死亡，以及采用微阵列基底实现细菌附着。所开发的平台可用于抗生素及非抗生素类药物的研发与测试。与传统的细菌悬浮实验相比，该方法可在精确控制的时间段内反复开启和关闭药物作用，从而在同一个实验过程中对同一细菌群体进行重复观察。

所呈现的数据 图4 显示易感性的反应 金黄色葡萄球菌 aureus 在含抗生素的微流控通道中随时间推移的菌株变化。显示了实验开始1分钟及1小时实验结束时采集的相差图像 图4A 和 B分析的1小时数据如图所示 图 4C 细菌以红色突出显示（共5,828个）。相应的荧光图像如下所示 图4D 和 E1小时的分析数据如图所示 图4F 红色突出显示发出荧光的细菌（174个已死亡）。
这组图像说明了几个要点。最重要的是，实验结束时观察到发出荧光的细菌数量显著增加（比较图4D和E中1分钟和60分钟时明亮荧光点的数量），表明微通道内发生了细胞死亡。这些结果提示该菌株为敏感菌株。
另一个需要注意的重要问题是上...

我们开发了一种用于快速抗生素药敏试验的微流控平台。液体以高速流过固定在微流控通道底部的细菌。在压力和抗生素存在的情况下，敏感菌株的细菌会迅速死亡。然而，耐药细菌则能够在这些应激条件下存活。

我们开发了一种基于应激环境的快速微流控抗生素敏感性检测方法。在该方法中，液体以高速流过……

以下实验的总体目标是快速测定细菌对目标抗生素的敏感性。该目标通过以下步骤实现：首先将处于对数生长期的细菌固定在微流控通道底部；第二步，以高流速将含有抗生素及活/死荧光染料的培养基注入通道，使细菌受到胁迫，并激活其针对抗生素的生化代谢通路。接下来，每两分钟自动采集一次相差和荧光图像，持续一小时，以监测细菌活力；根据实验每个时间点获取的图像计算归一化的细菌死亡百分比。最终，通过归一化细胞死亡百分比随时间的增加来确定细菌的抗生素敏感表型。该技术相较于现有的表型敏感性检测方法（如肉汤稀释法、稀释法或微培养法）的主要优势在于，我们的方法无需监测细菌分裂过程。相反，我们可以直接从现有的少量样本中获取其敏感性谱型。该技术对于耐药性细菌感染的诊断具有重要意义，因为该方法快速、易于实现多重检测，并可自动化。要制备PDMS层，首先将新配制的黏稠PDMS混合物在室温下置于真空箱中脱气；一小时后，使用天平将预定质量的DGA-PDMS混合物倒入铝制模具中。将PDMS缓慢倾倒至模具中心，注意保持模具水平，并确保针脚不被覆盖。将PDMS在37摄氏度的烘箱中过夜固化。次日早晨，松开顶部模具板，小心地将固化的PDMS从模具上取下，以组装流动池。首先，将玻璃窗口放入流动池的凹槽中。然后将镀膜玻片有活性的一面朝上，放置在流动池口袋内玻璃窗口的上方。将新制备的PDMS层通道面朝下置于其上，使通道入口与金属板上的通孔对齐。轻轻挤出各层之间的空气，然后翻转PDMS-玻片组装体，使PDMS面朝向玻璃窗口。将PDMS通道的入口与金属板上的通孔对齐，然后将压力板放在上方并拧紧螺丝。现在将组装好的流动池置于显微镜下，将显微镜放大倍数设置为60倍，并预先对准通道位置，以准备将对数生长期的细菌加载到流动池中。取50微升过夜培养的目标细菌菌落，混入50毫升新鲜MH二号肉汤中。在37摄氏度、250 RPM振荡条件下培养3小时。继代培养后，在室温下以1,650 × g离心10毫升菌液2分钟。然后去除上清液，并将沉淀重悬于1毫升新鲜的MH二号培养基中。接着，将一段短管连接到1毫升注射器上，并用1毫升培养基冲洗管路，管路中保留少量培养基，以避免在吸入细菌悬液时产生气泡。随后，将0.7毫升细菌悬液装入注射器中，并用该细菌培养物填充流式细胞仪的两个通道。随着细菌进入通道，通道的透明度会发生变化。随后将流动池在37摄氏度下孵育45分钟，以使细菌附着到载玻片表面。为实验准备所需溶液。首先，用新配制的对照溶液填充两支60毫升注射器，再用新配制的抗生素溶液填充另外两支60毫升注射器。轻弹注射器以去除所有气泡，然后连接进液管路，将相应溶液推注通过管路末端。将溶液用铝箔包裹，避免光照导致试剂降解。现在将装有实验溶液的注射器逐个安装到泵上。必要时挤压其推杆以将其安装到泵上。使用注射器固定横杆将注射器锁定到位。将泵速设置为每分钟1毫升，泵体积设置为60毫升，并冲洗泵，直到从所有注射器中观察到稳定的液体流动。现在，通过将流动池从培养箱中取出并安装到预先未对准的显微镜载物台上，开始实验。接下来，将一根来自注射器的进样管和一根通向废液瓶的出样管分别连接到每个流动池通道。此时，实验已完全准备就绪，可以开始。将相差成像的采集时间设置为 10 毫秒，荧光成像的采集时间设置为 1600 毫秒，然后在启动流体之前，对每个位置获取相差图像和荧光图像。请注意，在开始流体成像前，由于通道内加载的细菌密度过高，可能无法聚焦到通道底部。现在开始液体流动。立即检查显微镜是否聚焦在通道底部。然后在开始流动后的第一分钟内，对目标区域进行相差和荧光成像。每获取一次初始图像后，每隔两分钟采集一次图像，直至灌流持续60分钟。根据需要重新对焦，以确保实验正常进行，并可检查已获取的相差图像和荧光数据。在此数据样本中，敏感菌株被加载至通道一和通道二，而耐药菌株则被加载至通道三和通道四。实验结束时，依次使用次氯酸钠溶液和水运行清洗程序。取四个 20 毫升注射器，各装入 10 毫升 10% 次氯酸钠溶液，另取四个 60 毫升注射器，装入去离子水。去气泡后，将装有次氯酸钠的注射器连接至流路池，设置泵速为 1 毫升/分钟，泵送体积为 3 毫升。启动泵运行三分钟，并在屏幕上监测通道的清洗情况。三分钟后，将次氯酸钠注射器更换为水注射器，并以每分钟1毫升的速度继续运行30分钟。最后，使用图像处理软件统计每张图像中细菌的数量。使用以下公式计算归一化的细菌细胞死亡率随时间的变化，其中 NF 表示在荧光图像计数中观察到的死亡细菌数量，NP 表示根据相差图像确定的细菌总数。此处显示的图像说明了在微流控流动池中，敏感性金黄色葡萄球菌菌株对苯唑西林随时间变化的响应情况。这些象限显示了实验开始后一分钟和一小时拍摄的相差图像，以及对应的荧光图像。实验结束时，可观察到荧光细菌数量显著增加，表明通道内细胞发生死亡，且该菌株对抗生素具有敏感性，这种现象可能与单个环氧树脂包被载玻片的随机非均匀性有关。在整个实验过程中，持续的剪切应力可能导致细菌细胞丢失，从而造成上述差异；因此，每个死细胞群体的荧光图像均通过同时采集的相差图像进行归一化处理，以获得同一时间点前后一秒内的总细胞群体数量。这些放大图像表明，与高密度的相差图像相比，计数算法在荧光图像中对单个细菌的准确计数更为成功。死细胞染色使单个死细菌呈现出高荧光对比度。由于荧光细菌的数量很少超过总数的5%，每个细菌与背景相比都显得非常明亮。因此，荧光细菌可被准确计数，具有较高的精确度。例如，在本实验检测到的共计 5,828 个细菌中，以红色高亮显示的 174 个被确定为死菌。三种不同实验的标准化 MSSA 和 Mr.RSA 数据显示，对于耐药菌株，标准化细胞死亡率较低，幅度小于 0.5%，且在整个实验过程中无明显变化。然而，敏感菌株在整个实验过程中表现出持续增加的细胞死亡率，到实验结束时其数值高于1%。敏感菌株的细胞死亡启动时间在不同实验之间略有差异，但通常发生在10至30分钟之间。请注意，操作耐药性病原体可能具有极高危险性，因此在进行该操作时，必须采取无菌技术等预防措施。该技术将为研究人员探索细菌对压力的响应机制铺平道路，并将影响新型快速诊断方法的开发以及新药的发现。

stress-induced-antibiotic-susceptibility-testing-on-a-chip

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

芯片上的压力诱导抗生素易感性测试

设计一种简便的单日工作流程方案用于细菌病原体诊断，可实现对血流感染的快速识别。该方案包含八种临床相关细菌靶标及其抗生素耐药谱，可使临床医生在同一天内获得初步诊断信息，从而有助于制定更为恰当的治疗方案。...

从血培养中检测细菌病原体及进行抗菌药物耐药性测试的一日工作流程方案

来源：Liu, P. C., et al. 一种低成本、自动化莫比恒化器的设计与使用：用于抗生素药物筛选条件下细菌的适应性进化。 J. Vis. Exp. (2016)本视频展示了如何使用微流控芯片在甲氧苄啶抗生素胁迫条件下，对野生型和耐甲氧苄啶的大肠杆菌（E.

在微流控芯片上培养细菌以研究抗生素耐药性

来源：Zhang, M. 等，通过受激拉曼散射成像检测单个细菌中氘掺入实现快速抗菌药物敏感性测试。J. Vis. Exp.

使用受激拉曼散射显微镜检测细菌对抗生素的敏感性

本视频展示了一种阻抗生物传感器检测方法，用于研究抗体与固定在换能器芯片上的靶抗原之间的相互作用。该生物传感器经工程化设计，含有一种双功能嵌合蛋白——即一个具有功能性催化位点的β-内酰胺酶，与一个可结合固定化靶抗原的纳米抗体相融合。当发生结合后，β-内酰胺酶对抗生素底物的催化水解反应产生电信号，从而确认抗原-抗体的相互作用。...

基于β-内酰胺酶的电导率生物传感器检测蛋白质-蛋白质相互作用

获得性抗生素耐药性是公共卫生领域的一个重大问题，目前已被世界卫生组织（WHO）列为对人类生命最大的威胁之一。本文介绍了利用悬臂梁技术定量检测抗菌耐药性的方法，这对于发现针对多重耐药细菌的新型高效抗菌药物至关重要。...

药物靶点相互作用的纳米力学与抗菌耐药性检测

我们描述了一种低成本、可配置的病态恒定器，该装置通过动态调节药物浓度，实现对抗生素耐药性的表征。该设备可与多重微流控平台集成，该方法可扩展用于实验室中的抗生素耐药性研究。...

设计和使用低成本自动化病态恒定器在抗生素药物选择压力下进行细菌的适应性进化

抗菌药物协同作用测试用于评估两种或多种抗生素联合使用的效果，通常采用以下两种方法之一进行：棋盘格稀释法或时间-杀菌试验。本文介绍了一种基于自动喷墨打印机辅助的棋盘格稀释法协同作用技术，以及一种经典的时间-杀菌协同作用研究方法。...

通过喷墨打印机辅助的自动化棋盘阵列法与手工时间-杀菌法进行抗菌协同作用测试

本方案通过单细胞刺激拉曼散射成像检测D2O代谢，可在2.5小时内完成快速抗菌药物敏感性试验（AST）。该方法适用于尿液或全血环境中的细菌，对临床快速单细胞表型抗菌药物敏感性试验具有变革意义。...

基于单个细菌中氘掺入的受激拉曼散射成像的快速抗菌药物敏感性测试

本文介绍了智能高通量抗菌药物敏感性检测/噬菌体筛选系统的原理、结构及操作方法。以中国山东地区家禽分离的沙门氏菌（Salmonella）为例，说明该系统的应用。计算了Lar指数，并全面讨论了其在评估抗菌药物耐药性中的意义。...

智能高通量抗菌药物敏感性检测/噬菌体筛选系统的应用及抗菌耐药性幼虫指数

展示了一种无透镜片上荧光显微成像平台，可利用基于压缩采样的解码算法，对例如&gt;0.6–8...

芯片上的无透镜荧光显微镜技术

了解微流控芯片技术用于快速检测细菌抗生素敏感性。该方法通过高流速施加压力应激，结合荧光成像实时监测细菌存活率，无需等待细菌分裂即可完成药敏表型判定。

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