芯片上的压力诱导抗生素易感性测试

以下实验的总体目标是快速确定细菌对目标抗生素的敏感性。这是通过首先将对数期细菌固定到微流体通道的底部来实现的。在第二步中，然后以高流速将含有抗生素和活死荧光染料的培养基推入通道，对细菌施加压力并激活其抗生素靶向生化途径。

每两分钟自动收集一次下一阶段对比和荧光图像，持续一小时以监测细菌活力，在实验的每个时间点从采集的图像计算归一化细菌死亡百分比。最终，细菌的抗生素敏感性表型是由正常化细胞死亡百分比随时间增加来确定的。与现有的表型药敏试验方法（如肉汤、稀释或微培养）相比，该技术的主要优点是我们的方法不需要监测细菌分裂。

相反，我们可以直接从现有的小种群中获取它们的易感性概况。该技术对耐药细菌感染诊断的意义在于该方法快速、易于多路复用和自动化 要创建 PDMS 层，首先在真空室中对新鲜制备的 PDMS 粘性混合物进行脱气，一小时后，使用秤用预定质量的 DGAs PDMS 混合物填充铝模具。将 PDMS 缓慢倒在模具中心，注意保持模具水平且销钉未覆盖。

在 37 摄氏度的烤箱中固化 PDMS 过夜。第二天早上，松开顶模板，小心地从模具中取出固化的 PDMS 以组装流通池。首先，将玻璃窗放入流通池袋中。

然后将涂层载玻片放在流通池袋内的玻璃窗上，活性面朝上。新创建的 PDMS 层，通道朝下位于其顶部，以便通道输入与金属板上的通孔对齐。轻轻地将空气从各层之间推出，然后翻转 PDMS 载玻片组件，使 PDMS 面向玻璃窗。

PDMS 通道输入与金属板上的通孔重叠，然后将压板放在顶部并拧紧螺丝。现在将组装好的流通池放在显微镜下，将显微镜放大倍率设置为 60 倍并预先对齐通道位置，以制备对数期细菌以加载到流通池中，将 50 微升感兴趣的过夜培养细菌菌落混合到 50 毫升新鲜 MH 两种肉汤中。传代培养后，以 250 RPM 和 37 摄氏度振荡孵育 3 小时，将 10 毫升培养物在 1， 650 倍 G 和室温下离心 2 分钟。

然后去除上清液，将沉淀重悬于一毫升新鲜的 MH 两种培养基中。接下来，将一小段管路连接到 1 毫升注射器上，并用 1 毫升培养基冲洗管路，在管路中留下少量介质，以避免吸入细菌悬浮液时出现气泡。然后将 0.7 毫升细菌装入注射器中，并将细菌细胞培养物填充流通池的两个通道。

通道的透明度会随着细菌的填充而发生变化。然后将流通池在 37 摄氏度下孵育 45 分钟，让细菌附着在玻片表面。为实验准备解决方案。

首先，在两个 60 毫升注射器中加入新鲜制备的对照溶液，在两个 60 毫升注射器中加入新鲜制备的抗生素溶液。轻弹注射器以去除任何气泡，然后连接输入管，将相应的溶液推入管子的末端。将溶液包裹在铝箔中，以避免光诱导试剂降解。

现在将装有实验溶液的注射器安装到泵上，一次一个。根据需要挤压其柱塞，使其安装到泵上。用注射器固定横杆将注射器锁定到位。

将泵速设置为每分钟 1 毫升，将泵体积设置为 60 毫升，然后冲洗泵，直到看到所有注射器的液体流出稳定。现在，从培养箱中取出流通池并将其安装到预错位的显微镜载物台上，开始实验。接下来，将一根来自注射器的输入管和一根来自废液瓶的输出管连接到每个流通池通道。

此时，实验已完全设置完毕，可以开始了。将相差采集时间设置为 10 毫秒，将荧光采集时间设置为 1600 毫秒，然后在开始流之前获得每个位置的相差和荧光图像。请注意，在流动图像开始之前，由于通道内负载细菌的密度很高，因此可能无法聚焦在通道底部。

现在开始液体流动。立即检查显微镜是否聚焦在通道底部。然后在流速的第一分钟内拍摄目标区域的相差和荧光图像。

第一组图像之后每 2 分钟采集一次图像，直到流速达到 60 分钟。必要时重新聚焦以确保实验正常进行，可以检查获得的相差和荧光数据。在这个数据样本中，敏感应变被加载到通道 1 和 2 中，而电阻应变被加载到通道 3 和 4 中。

在实验结束时，运行一个清洁周期，依次使用漂白剂和水。用 10 毫升 10% 漂白剂溶液填充四个 20 毫升注射器，用去离子水填充四个 60 毫升注射器。去泡后，将装满漂白剂的注射器连接到流通池，并将泵速设置为每分钟 1 毫升，泵体积设置为 3 毫升。

运行泵 3 分钟，在屏幕上监测通道的清洁情况。3 分钟后，用水注射器更换漂白剂注射器，并以每分钟 1 毫升的浓度运行 30 分钟。最后，使用图像处理软件计算每张图像中的细菌数量。

使用此公式计算标准化细菌细胞死亡百分比作为时间的函数，其中 NF 等于荧光图像计数中计数的死亡细菌数。NP 等于从相差图像确定的细菌总数。此处显示的图像说明了易感葡萄球菌菌株在微流体流通池内对苯唑西林的时间依赖性响应。

这些象限显示了在实验开始后 1 分钟和 1 小时时采集的相差图像，此处显示了相应的荧光图像。在实验结束时观察到荧光细菌数量的显着增加，表明通道内的细胞死亡以及由于单个环氧树脂涂层载玻片的随机不均匀性而导致的菌株对抗生素的敏感性。在整个实验过程中，在持续的纯粹压力下可能会有细菌细胞丢失，以解决这种变化，死细胞群的每个荧光图像都用共同获得的相差图像进行归一化，从而将总细胞群恢复到同一时间点的一秒内。

这些放大表明，计数算法在准确计数荧光图像中的单个细菌方面比在密集的相差图像中更成功。死细胞染色剂为单个死细菌提供了高荧光对比度。由于荧光细菌的数量很少超过总数的 5%，因此与背景相比，每种细菌都非常明亮。

因此，可以很容易地以高度的准确性对荧光细菌进行计数。例如，在这个实验中，总共检测到 5 个 828 个细菌，以红色突出显示，其中 174 个被确定为死亡。如预期的那样，对于抗性菌株，三个不同实验的归一化 MSSA 和 Mr.RSA 数据进行了说明，归一化细胞死亡的幅度低于 0.5%，并且在实验过程中没有变化。

然而，易感菌株显示细胞死亡稳步增加，并且在实验结束时大于 1% 的更高值。易感菌株的细胞死亡开始时间在实验之间略有不同，但通常发生在 10 到 30 分钟之间。不要忘记，与抗生素耐药病原体一起工作可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如化粪池技术。

这项技术将为研究人员探索细菌如何应对压力铺平道路，并将影响新型快速诊断的开发和新药的发现。