Name: 体内通过过表达 Yamanaka 因子将成体细胞重编程为多能性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-17T09:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 12 s
Description: 了解如何通过尾静脉水动力注射Yamanaka因子质粒DNA，在成年小鼠肝脏中将体细胞重编程为多能性细胞。该方法利用实时定量PCR和流式细胞术分析基因与蛋白表达变化，为再生医学研究提供安全高效的新策略。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作部分得到了工程与物理科学研究理事会（EPSRC，斯温顿，英国）以及欧盟第七框架计划NANONEUROHOP（PIEF-GA-2010-276051）和ANTICARB（HEALTH-2008-20157）项目的支持。AY获得了土耳其教育部全日制博士奖学金的支持，IL感谢英国文化协会和凯克萨基金会（西班牙）提供的部分支持。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决定或稿件撰写过程中均未发挥任何作用。

1. 在体 通过HTV给药pDNA实现肝组织重编程
<ol>
	<li>让6周龄的雌性Balb/C小鼠在进行任何操作前，先在动物房适应环境一周。</li>
	<li>用蒸馏水配制0.9%生理盐水，并通过0.22 μm微孔滤膜过滤。</li>
	<li>每只小鼠用1.5 ml 0.9%生理盐水溶解75 μg pCX-OKS-2A和75 μg pCX-cMyc质粒DNA，配制成溶液。注意：注射总体积必须为小鼠总体重的8-10%。 
	注意：注射前，将小鼠置于37 °C加热舱内，直至尾静脉清晰可见并明显扩张。</li>
	<li>在注射前（加热舱内）及注射过程中，使用异氟烷诱导麻醉（通过麻醉面罩）。</li>
	<li>使用27 G注射器经尾静脉高压注射（HTV）方式给予质粒DNA溶液或生理盐水对照。注意：为确保转染成功，总注射体积应在5-7秒内完成。</li>
	<li>监测动物注射后的恢复情况。</li>
</ol>
2. 用于qRT-PCR研究的肝脏灌注与原代肝细胞分离
<ol>
	<li>在HTV注射后的不同时间点（包括2、4、8、12和24天），使用异氟烷诱导深度麻醉。</li>
	<li>用70%乙醇喷洒动物腹部，用手术剪在腹侧中线处切开皮肤，并分离腹肌层以暴露内脏。</li>
	<li>用剪刀剪开膈肌以暴露胸腔，并用止血钳夹闭下腔静脉。</li>
	<li>将内脏向右推移，并移动肝叶，使下腔静脉和门静脉易于操作。</li>
	<li>用22 G导管插管下腔静脉，并剪开门静脉以避免压力过高。</li>
	<li>开始以预热至37 °C的10 ml HBSS缓冲液（无Ca2+和Mg2+，含碳酸氢盐）进行灌注。使用10 ml注射器缓慢灌注缓冲液，直至肝脏变白（约3分钟）。</li>
	<li>继续以预热至37 °C的肝脏消化液进行灌注，流速为0.6 ml/min，持续15分钟，直至肝脏肿胀并变得松软。注意：过度消化和灌注可能损伤肝细胞或重编程细胞。</li>
	<li>将后续实验步骤转移至4 °C环境中进行。</li>
	<li>剪断镰状韧带和冠状韧带后，用镊子取出肝脏，并用肝细胞洗涤液冲洗，同时通过100 μm细胞筛网以获得单细胞悬液。</li>
	<li>将细胞悬液收集至50 ml离心管中，并用肝细胞洗涤液调整体积至15 ml。</li>
	<li>在4 °C条件下，以50 g离心4分钟。弃去上清液（含有库普弗细胞和上皮细胞），将细胞沉淀（含肝细胞）重悬于10 ml肝细胞洗涤液中。注意：重悬细胞沉淀时需格外小心，肝细胞为非常脆弱的细胞。</li>
	<li>重复离心步骤共三次，最终将细胞沉淀重悬于10 ml肝细胞洗涤液中。</li>
	<li>使用光学显微镜和血细胞计数板估算细胞数量。</li>
	<li>将细胞分装为每份2 × 106个细胞，以300 × g离心以回收全部细胞，并弃去上清液。</li>
	<li>此时，细胞沉淀可冷冻保存于-20 °C，待后续处理时使用，或立即用于RNA提取。</li>
</ol>
3. 分离肝细胞中多能性基因上调的基因表达研究
<ol>
	<li>按照试剂盒供应商的说明，使用离心柱试剂盒从 2 × 106 个细胞中提取 RNA。</li>
	<li>取 1 μg 提取的 RNA，按照试剂供应商的说明进行两步法 qRT-PCR。</li>
	<li>以生理盐水注射动物的肝细胞作为对照，校正重编程、多能性及肝细胞标志物的相对基因表达水平。</li>
</ol>
4. 蛋白质水平上增强多能性的流式细胞术分析
<ol>
	<li>注射后第1天和第4天，进行肝脏灌注并按上述方法分离原代肝细胞。</li>
	<li>将细胞密度调整至 1 × 107 个细胞/ml，并准备 100 μl 的分装样品。</li>
	<li>使用 BD Cytofix 固定缓冲液固定细胞，并用 1× BD Perm/Wash 缓冲液进行透化处理。</li>
	<li>将细胞与抗小鼠 OCT4-PerCP-Cy5.5 或抗小鼠 Nanog-PE 抗体在 30 分钟内孵育。</li>
	<li>设置阴性对照和同型对照。</li>
	<li>使用 CyAn ADP 高性能研究型流式细胞仪分析染色后的细胞。</li>
</ol>
5. 多能性标志物的肝组织切片免疫染色
<ol>
	<li>注射后第四天，按照上述方法灌注肝脏，但仅使用HBSS缓冲液，以清除肝组织中的血液。</li>
	<li>切取一块肝组织，浸入预冷于液氮中的2-甲基丁烷中，用于后续冷冻切片。</li>
	<li>冷冻组织可保存于-80 °C，或直接使用冷冻切片机切成14 μm厚的切片。</li>
	<li>将组织切片在室温下空气干燥1小时，然后用预冷至-20 °C的甲醇固定10分钟；再空气干燥15分钟，随后用PBS洗涤两次，每次5分钟。</li>
	<li>将切片在封闭缓冲液（含5%山羊血清和0.1% Triton的PBS，pH 7.3）中室温孵育1小时，随后用洗涤缓冲液（含1% BSA和0.1% Triton的PBS，pH 7.3）洗涤两次。</li>
	<li>将组织切片在4 °C下与抗OCT4、抗SOX2和抗Nanog一抗抗体共同孵育过夜。</li>
	<li>次日，用洗涤缓冲液洗涤切片三次，每次5分钟，然后在室温下与二抗抗体孵育1.5小时。</li>
	<li>用PBS洗涤肝组织切片（三次，每次5分钟），然后用含DAPI和抗荧光淬灭剂的封片液封片。</li>
	<li>在落射荧光显微镜下观察切片。</li>
</ol>
6. 肝组织切片的碱性磷酸酶（ALP）染色
<ol>
	<li>按照之前所述方法获取肝组织切片。</li>
	<li>染色前将组织切片于室温下放置15分钟以复温。</li>
	<li>用4%多聚甲醛固定2分钟。注意：固定时间过长会降低碱性磷酸酶（ALP）活性。</li>
	<li>将切片晾干30分钟，随后在37 °C下用BCIP/NBT液体底物孵育30分钟。</li>
	<li>用蒸馏水洗涤切片，并使用水溶性封片介质封片。</li>
	<li>通过光学显微镜随机采集图像。</li>
</ol>
7. 通过检测血清中白蛋白和肝酶水平评估肝毒性
<ol>
	<li>转染后第4、8、12和120天，直接从心脏心室采集300 μl血液。</li>
	<li>在收集不同样本期间，将血液置于冰上，以防止凝固。</li>
	<li>所有样本收集完毕后，在37 °C孵育30分钟，直至血液凝固。</li>
	<li>以2,000 × g离心5分钟。</li>
	<li>小心吸取上清液中的血清，转移至新的Eppendorf管中，并于-80 °C冷冻保存，直至进行后续处理。</li>
	<li>检测血清中白蛋白、ALT、AST、ALP和GLDH的水平。</li>
</ol>
8. 通过苏木精-伊红（H&amp;#38;E）和过碘酸-雪夫（PAS）染色评估肝组织切片中的肝毒性
<ol>
	<li>在HTV注射后的不同时间点（包括2、4、8、12、24、50和120天），仅使用HBSS缓冲液按照先前所述方法进行肝脏灌注。</li>
	<li>切取一块肝组织，用4%多聚甲醛固定。</li>
	<li>将肝组织包埋于石蜡块中，切片后采用H&amp;#38;E染色或PAS染色。</li>
	<li>通过光学显微镜随机采集图像。</li>
</ol>

<ol><li>Blelloch, R., Venere, M., Yen, J., Ramalho-Santos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+Of+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+In+The+Absence+Of+Drug+Selection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation Of Induced Pluripotent Stem Cells In The Absence Of Drug Selection.</a> Cell Stem Cell. 1, 245-247 (2007).</li>
<li>Stadtfeld, M., Nagaya, M., Utikal, J., Weir, G., Hochedlinger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Generated+Without+Viral+Integration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced Pluripotent Stem Cells Generated Without Viral Integration.</a> Science. 322, 945-949 (2008).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+Of+Pluripotent+Stem+Cells+From+Adult+Human+Fibroblasts+By+Defined+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction Of Pluripotent Stem Cells From Adult Human Fibroblasts By Defined Factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+Of+Pluripotent+Stem+Cells+From+Mouse+Embryonic+And+Adult+Fibroblast+Cultures+By+Defined+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction Of Pluripotent Stem Cells From Mouse Embryonic And Adult Fibroblast Cultures By Defined Factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+Pluripotent+Stem+Cell+Lines+Derived+From+Human+Somatic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derived From Human Somatic Cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li>
<li>Gonzalez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+Of+Mouse-Induced+Pluripotent+Stem+Cells+By+Transient+Expression+Of+A+Single+Nonviral+Polycistronic+Vector%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Generation Of Mouse-Induced Pluripotent Stem Cells By Transient Expression Of A Single Nonviral Polycistronic Vector.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 8918-8922 (2009).</li>
<li>Okita, K., Nakagawa, M., Hyenjong, H., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+Of+Mouse+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Without+Viral+Vectors.+%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation Of Mouse Induced Pluripotent Stem Cells Without Viral Vectors. </a> Science. 322, 949-953 (2008).</li>
<li>Woltjen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Piggybac+Transposition+Reprograms+Fibroblasts+To+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Piggybac Transposition Reprograms Fibroblasts To Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Nature. 458, 766-770 (2009).</li>
<li>Yusa, K., Rad, R., Takeda, J., Bradley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+Of+Transgene-Free+Induced+Pluripotent+Mouse+Stem+Cells+By+The+Piggybac+Transposon%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">Generation Of Transgene-Free Induced Pluripotent Mouse Stem Cells By The Piggybac Transposon.</a> Nat. Meth. 6, 363-369 (2009).</li>
<li>Warren, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Efficient+Reprogramming+To+Pluripotency+And+Directed+Differentiation+Of+Human+Cells+With+Synthetic+Modified+Mrna%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Highly Efficient Reprogramming To Pluripotency And Directed Differentiation Of Human Cells With Synthetic Modified Mrna.</a> Cell Stem Cell. 7, 618-630 (2010).</li>
<li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+Of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+By+Direct+Delivery+Of+Reprogramming+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation Of Human Induced Pluripotent Stem Cells By Direct Delivery Of Reprogramming Proteins.</a> Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).</li>
<li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+Of+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Using+Recombinant+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation Of Induced Pluripotent Stem Cells Using Recombinant Proteins.</a> Cell Stem Cell. 4, 381-384 (2009).</li>
<li>Anokye-Danso, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Efficient+Mirna-Mediated+Reprogramming+Of+Mouse+And+Human+Somatic+Cells+To+Pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Highly Efficient Mirna-Mediated Reprogramming Of Mouse And Human Somatic Cells To Pluripotency.</a> Cell Stem Cell. 8, 376-388 (2011).</li>
<li>Lin, S. -L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+Of+Somatic+Cell+Reprogramming+Through+Inducible+Mir-302+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation Of Somatic Cell Reprogramming Through Inducible Mir-302 Expression.</a> Nucleic Acids Res. , (2011).</li>
<li>Miyoshi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+Of+Mouse+And+Human+Cells+To+Pluripotency+Using+Mature+Micrornas%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming Of Mouse And Human Cells To Pluripotency Using Mature Micrornas.</a> Cell Stem Cell. 8, 633-638 (2011).</li>
<li>Subramanyam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+Targets+Of+Mir-302+And+Mir-372+Promote+Reprogramming+Of+Human+Fibroblasts+To+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Multiple Targets Of Mir-302 And Mir-372 Promote Reprogramming Of Human Fibroblasts To Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Nat. Biotechnol. 29, 443-448 (2011).</li>
<li>Dolgin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flaw+In+Induced-Stem-Cell+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Flaw In Induced-Stem-Cell Model.</a> Nature. 470, 13 (2011).</li>
<li>Miura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+In+The+Safety+Of+Induced+Pluripotent+Stem+Cell+Lines%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotech%22%5BJournal%5D)">Variation In The Safety Of Induced Pluripotent Stem Cell Lines.</a> Nat. Biotech. 27, 743-745 (2009).</li>
<li>Pera, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Dark+Side+Of+Pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The Dark Side Of Pluripotency.</a> Nature. 471, 46-47 (2011).</li>
<li>Saha, K., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+Challenges+In+Using+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+To+Model+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Technical Challenges In Using Human Induced Pluripotent Stem Cells To Model Disease.</a> Cell Stem Cell. 5, 584-595 (2009).</li>
<li>Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+Of+Germline-Competent+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation Of Germline-Competent Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Nature. 448, 313-317 (2007).</li>
<li>Varas, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast-Derived+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Show+No+Common+Retroviral+Vector+Insertions%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Fibroblast-Derived Induced Pluripotent Stem Cells Show No Common Retroviral Vector Insertions.</a> Stem Cells. 27, 300-306 (2009).</li>
<li>Jia, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Nonviral+Minicircle+Vector+For+Deriving+Human+Ips+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">A Nonviral Minicircle Vector For Deriving Human Ips Cells.</a> Nat. Meth. 7, 197-199 (2010).</li>
<li>Gonzalez, F., Boue, S., Belmonte, J. C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+For+Making+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%3A+Reprogramming+A+La%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Methods For Making Induced Pluripotent Stem Cells: Reprogramming A La.</a> Nat. Rev. Genet. 12, 231-242 (2011).</li>
<li>Stadtfeld, M., Hochedlinger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+Pluripotency%3A+History%2C+Mechanisms%2C+And+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Induced Pluripotency: History, Mechanisms, And Applications.</a> Genes Dev. 24, 2239-2263 (2011).</li>
<li>Gore, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+Coding+Mutations+In+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Somatic Coding Mutations In Human Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Nature. 471, 63-67 (2011).</li>
<li>Hussein, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copy+Number+Variation+And+Selection+During+Reprogramming+To+Pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Copy Number Variation And Selection During Reprogramming To Pluripotency.</a> Nature. 471, 58-62 (2011).</li>
<li>Lister, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hotspots+Of+Aberrant+Epigenomic+Reprogramming+In+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hotspots Of Aberrant Epigenomic Reprogramming In Human Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Nature. 471, 68-73 (2011).</li>
<li>Yilmazer, A., De Lázaro, I., Bussy, C., Kostarelos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Cell+Reprogramming+Towards+Pluripotency+By+Virus-Free+Overexpression+Of+Defined+Factors.+%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">In Vivo Cell Reprogramming Towards Pluripotency By Virus-Free Overexpression Of Defined Factors. </a> Plos One. 8, (2013).</li>
<li>Liu, F., Song, Y. K., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamics-Based+Transfection+In+Animals+By+Systemic+Administration+Of+Plasmid+Dna%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamics-Based Transfection In Animals By Systemic Administration Of Plasmid Dna.</a> Gene Ther. 6, 1258-1266 (1999).</li>
<li>Zhang, G., Budker, V., Wolff, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Levels+Of+Foreign+Gene+Expression+In+Hepatocytes+After+Tail+Vein+Injections+Of+Naked+Plasmid+Dna%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene.+Ther%22%5BJournal%5D)">High Levels Of Foreign Gene Expression In Hepatocytes After Tail Vein Injections Of Naked Plasmid Dna.</a> Hum. Gene. Ther. 10, 1735-1737 (1999).</li>
<li>Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+Pluripotent+Stem+Cells%3A+Past%2C+Present%2C+And+Future%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Induced Pluripotent Stem Cells: Past, Present, And Future.</a> Cell Stem Cell. 10, 678-684 (2012).</li>
<li>Therapy Giacca, M. G. ene , Springer. (2010).</li>
<li>Colella, P., Auricchio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aav-Mediated+Gene+Supply+For+Treatment+Of+Degenerative+And+Neovascular+Retinal+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Aav-Mediated Gene Supply For Treatment Of Degenerative And Neovascular Retinal Diseases.</a> Curr. Gene Ther. 10, 371-380 (2010).</li>
<li>Dayton, R. D., Wang, D. B., Klein, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Advent+Of+Aav9+Expands+Applications+For+Brain+And+Spinal+Cord+Gene+Delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.+Biol.+Ther%22%5BJournal%5D)">The Advent Of Aav9 Expands Applications For Brain And Spinal Cord Gene Delivery.</a> Expert Opin. Biol. Ther. 12, 757-766 (2012).</li>
<li>Mccown, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-Associated+Virus+%28Aav%29+Vectors+In+The+Cns%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Adeno-Associated Virus (Aav) Vectors In The Cns.</a> Curr. Gene Ther. 11, 181-188 (2011).</li>
<li>Vandenberghe, L. H., Auricchio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Adeno-Associated+Viral+Vectors+For+Retinal+Gene+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Novel Adeno-Associated Viral Vectors For Retinal Gene Therapy.</a> Gene Ther. 19, 162-168 (2012).</li>
<li>Herweijer, H., Wolff, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+And+Prospects%3A+Naked+Dna+Gene+Transfer+And+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Progress And Prospects: Naked Dna Gene Transfer And Therapy.</a> Gene Ther. 10, 453-458 (2003).</li>
<li>Wolff, J. A., Budker, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mechanism+Of+Naked+Dna+Uptake+And+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Genet%22%5BJournal%5D)">The Mechanism Of Naked Dna Uptake And Expression.</a> Adv. Genet. 54, 3-20 (2005).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

本研究提供了原理性证据，表明通过高效递送并过表达 OKSM 因子，可实现成年小鼠肝脏中体细胞向多能性的 体内 重编程。借助 qRT-PCR、流式细胞术、免疫组化（IHC）或血清分析等多种技术，对靶组织进行了检测以观察 体内 细胞重编程过程。在组织中诱导 OKSM 因子过表达后极短时间内（48 小时内），多能性标志物在 mRNA 和蛋白质水平均出现上调。在整个实验过程中，从组织中提取的细胞中有 5–15% 表达 Nanog 和 Oct3/4。此外，在长达 120 天的观察期内，肝脏未出现任何结构或功能异常。已有文献报道，通过 HTV 注射质粒 DNA 可在肝外组织（如肺、脾、肾和心脏）中实现外源基因表达，但其表达水平至少比肝细胞低三个数量级30。本研究的数据表明，体内 将体细胞重编程为多能状态具有安全性高、速度快和效率高的特点。鉴于目前大多数 体外 细胞重编程方法通常需要约 3 周时间，且效率低于 1%32，体内 向多能性重编程可能提供极具吸引力的替代途径。我们推测，体内 向多能性重编程的概念可被应用于多种类型的体细胞，并实现较高效率（取决于所用载体），但 体内 重编程细胞所达到的功能性多能性水平仍有待进一步确定。此外，随着更优方案和技术的发展，体内 重编程细胞有望被分离并用于再生医学目的。
为了重编程成年体细胞，需遵循一些关键步骤 体内 高效地实现靶组织中高水平的基因表达是先决条件。本研究通过采用水动力尾静脉注射法（HTV注射）将质粒DNA高效转染并表达于肝细胞，对此进行了验证。HTV注射最关键的两个因素是注射体积和注射速度：注射体积应为动物总体重的8%-10%，注射时间必须控制在5-7秒内完成。不应使用小于6周龄的小鼠，因为HTV注射可能在幼龄小鼠肝脏中引起更严重的组织损伤，从而影响细胞重编程效率。动物的遗传背景对转染效率无显著影响。 体内 重编程，正如我们先前报道的那样，在Balb/C和TNG-A小鼠中均观察到相似水平的重编程效率，后者是一种携带转基因的品系 eGFP 报告基因插入在 Nanog 基因座，且在Sv129背景品系中培育29.
我们推测，体内细胞重编程至多能状态（该状态尚需确定）可应用于其他组织类型，前提是能够将OKSM因子有效递送至靶细胞，从而实现高水平的基因表达。多种非病毒和病毒基因递送载体已在临床前和临床试验中被研究，以靶向不同的细胞和组织类型33。例如，在神经或眼部组织中，腺相关病毒是实现高效体内基因转移的首选载体34–37，而在肌肉组织中，裸质粒DNA注射已被证明可实现相对较高的基因表达水平38,39。因此，为实现高效且快速的体内细胞重编程至多能状态，应根据组织类型谨慎选择基因转移载体方法。

关于胚胎干细胞使用的伦理问题一直是干细胞研究发展中的限制因素之一。然而，山中伸弥及其同事发现，强制表达四种转录因子（即：Oct3/4、Klf4、Sox2、c-Myc（OKSM））可导致 体外 体细胞重编程为多能细胞，即诱导性多能干细胞（iPS细胞），已开辟了新的研究机遇。病毒1-5 和非病毒性6-10 基因转移，蛋白质胞质转位11,12，以及miRNA13-16 转染是目前用于生成诱导多能干细胞（iPS细胞）的多种方法之一。然而，此类重编程技术存在若干问题，限制了其向临床应用的转化，包括：a）细胞重编程效率严重受限；b）主要依赖病毒载体；c）培养条件所需的操作流程冗长且步骤繁多；d）移植后存在致瘤风险 体外 诱导多能干细胞17-20.
通过逆转录病毒介导的特定转录因子基因转移3-5是重编程体细胞最常用的方法。然而，该方法存在插入突变、稳定转导以及原癌基因长期表达等风险21,22。非病毒基因转移载体，如质粒DNA6,7,23或RNA10，可通过脂质体转染或电穿孔方式进行递送，也已被探索应用。尽管相较于病毒载体更安全，但这些载体的转导效率和重编程效率显著受限24,25。
这一新兴领域的核心教条之一是 体内 iPS细胞的植入将导致其不受控制地分化，并形成由三个不同胚层组织构成的类肿瘤样肿块（畸胎瘤）。因此，重编程至多能性的概念主要集中在 体外 对原代提取的体细胞（最常见为成纤维细胞）进行操作。然而，如上所述，该方法存在培养周期长、细胞培养流程复杂等问题，需经历多轮处理（基因转导、生长因子、抗生素、抗氧化剂），而这些处理本身可能增加细胞移植后畸胎瘤形成或其他类型肿瘤发生的风险24-28.
我们提出，对成年体细胞进行重编程 体内 通过瞬时过表达OKSM转录因子不会导致畸胎瘤的后续形成29实现这一目标的方法将取决于以尽可能安全的方式在目标组织内实现高水平的转录因子表达。在本研究中，我们选择了一种已建立的无病毒基因转导技术，该技术已被证明可高效靶向肝脏，以实现细胞重编程为多能性状态 体内该技术涉及通过大容量、快速水动力尾静脉（HTV）注射质粒DNA30,31转染基因在成年肝细胞中可通过该非病毒基因转移方法实现高水平表达。此外，该技术可最大限度降低使用病毒载体所带来的潜在风险。例如 永久基因组插入，插入突变

<table><tbody><tr><td>pCX-OKS-2A pDNA</td><td>Addgene</td><td>19771</td><td>从 Addgene 获取菌种划线，质粒生产在德国质粒工厂完成</td></tr><tr><td>pCX-cMyc</td><td>Addgene</td><td>19772</td><td>从 Addgene 获取菌种划线，质粒生产在德国质粒工厂完成</td></tr><tr><td>0.22 &amp;mu;m 滤膜</td><td>Milliopore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Abbott</td><td>B505</td><td></td></tr><tr><td>HBSS 缓冲液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6648</td><td>无 Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 和 Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;，含碳酸氢盐</td></tr><tr><td>肝脏消化培养基</td><td>Gibco</td><td>17703-034</td><td></td></tr><tr><td>肝细胞洗涤培养基</td><td>Gibco</td><td>17704-024</td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;mu;m 细胞筛</td><td>BD Biosciences</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Nucleospin RNA II 试剂盒</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740955.25</td><td>用于从细胞和组织中分离 RNA 的试剂盒</td></tr><tr><td>iScript cDNA 合成试剂盒</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8890</td><td></td></tr><tr><td>iO SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8880</td><td></td></tr><tr><td>Oct3/4 正向引物</td><td>Sigma</td><td>序列见注释</td><td>TGAGAACCTTCAGGAGATATGCAA</td></tr><tr><td>Oct3/4 反向引物</td><td>Sigma</td><td>序列见注释</td><td>CTCAATGCTAGTTCGCTTTCTCTTC</td></tr><tr><td>Sox2 正向引物</td><td>Sigma</td><td>序列见注释</td><td>GGTTACCTCTTCCTCCCACTCCAG</td></tr><tr><td>Sox2 反向引物</td><td>Sigma</td><td>序列见注释</td><td>TCACATGTGCGACAGGGGCAG</td></tr><tr><td>C-myc 正向引物</td><td>Sigma</td><td>序列见注释</td><td>CAGAGGAGGAACGAGCTGAAGCGC</td></tr><tr><td>C-myc 反向引物</td><td>Sigma</td><td>序列见注释</td><td>TTATGCACCAGAGTTTCGAAGCTGTTCG</td></tr><tr><td>Nanog 正向引物</td><td>Sigma</td><td>序列见注释</td><td>CAGAAAAACCAGTGGTTGAAGACTAG</td></tr><tr><td>Nanog 反向引物</td><td>Sigma</td><td>序列见注释</td><td>GCAATGGATGCTGGGATACTC</td></tr><tr><td>Ecat1 正向引物</td><td>Sigma</td><td>序列见注释</td><td>TGTGGGGCCCTGAAAGGCGAGCTGAGAT</td></tr><tr><td>Ecat1 反向引物</td><td>Sigma</td><td>序列见注释</td><td>ATGGGCCGCCATACGACGACGCTCAACT</td></tr><tr><td>Rex1 正向引物</td><td>Sigma</td><td>序列见注释</td><td>ACGAGTGGCAGTTTCTTCTTGGGA</td></tr><tr><td>Rex1 反向引物</td><td>Sigma</td><td>序列见注释</td><td>TATGACTCACTTCCAGGGGGCACT</td></tr><tr><td>Alb 正向引物</td><td>Sigma</td><td>序列见注释</td><td>GTTCGCTACACCCAGAAAGC</td></tr><tr><td>Alb 反向引物</td><td>Sigma</td><td>序列见注释</td><td>CCACACAAGGCAGTCTCTGA</td></tr><tr><td>Aat 正向引物</td><td>Sigma</td><td>序列见注释</td><td>CAGAGGAGGCCAAGAAAGTG</td></tr><tr><td>Aat 反向引物</td><td>Sigma</td><td>序列见注释</td><td>ATGGACAGTCTGGGGAAGTG</td></tr><tr><td>Trf 正向引物</td><td>Sigma</td><td>序列见注释</td><td>ACCATGTTGTGGTCTCACGA</td></tr><tr><td>Trf 反向引物</td><td>Sigma</td><td>序列见注释</td><td>ACAGAAGGTCCTTGGTGGTG</td></tr><tr><td>B actin 正向引物</td><td>Sigma</td><td>序列见注释</td><td>GACCTCTATGCCAACACAGT</td></tr><tr><td>B actin 反向引物</td><td>Sigma</td><td>序列见注释</td><td>AGTACTTGCGCTCAGGAGGA</td></tr><tr><td>BD Cytofix 固定缓冲液</td><td>BD Biosciences</td><td>560585</td><td></td></tr><tr><td>1x BD Perm/Wash 缓冲液</td><td>BD Biosciences</td><td>560585</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 OCT4-PerCP-Cy5.5</td><td>BD Biosciences</td><td>560585</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 Nanog-PE</td><td>BD Biosciences</td><td>560585</td><td></td></tr><tr><td>2-甲基丁烷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M32631</td><td></td></tr><tr><td>X100-吐温</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>山羊血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>兔多克隆抗体抗-OCT4</td><td>Abcam</td><td>ab19857</td><td>使用浓度为 3 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>兔多克隆抗体抗-SOX2</td><td>Abcam</td><td>ab97959</td><td>使用浓度为 1 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>兔多克隆抗体抗-Nanog</td><td>Abcam</td><td>ab80892</td><td>使用浓度为 1 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>小鼠单克隆抗体抗-SSEA1</td><td>Abcam</td><td>ab16285</td><td>使用浓度为 20 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>Cy3 标记的山羊抗兔 IgG 多克隆抗体</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.</td><td>111-165-003-JIR</td><td>使用稀释度为 1/250</td></tr><tr><td>Cy3 标记的山羊抗小鼠 IgG 多克隆抗体</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.</td><td>115-165-003-JIR</td><td>使用稀释度为 1/250</td></tr><tr><td>含 DAPI 的 VECTASHIELD 封片剂</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>BCIP/NBT 液体底物系统</td><td>Sigma</td><td>B1911</td><td></td></tr><tr><td>水性封片剂</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>16% 多聚甲醛</td><td>Fisher</td><td>AA433689M</td><td>储存液为 16%，使用时稀释至 4%</td></tr><tr><td>苏木精和伊红</td><td>Sigma</td><td>GH53/HT110216</td><td></td></tr><tr><td>PAS 染色</td><td>Sigma</td><td>395B</td><td></td></tr></tbody></table>

体内 通过过表达山中因子将成体体细胞重编程为多能性

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

通过强制表达特定因子将体细胞重编程为多能状态而获得的诱导性多能干细胞（iPS细胞）为再生医学提供了新的机遇。然而，iPS细胞的临床应用迄今仍受到限制，主要原因是现有重编程方法的效率较低，以及移植后生成的iPS细胞具有形成肿瘤的风险。
我们假设，体细胞向多能性的重编程可以实现 体内 通过重编程因子的基因转移。为了高效地重编程细胞 体内，需要在靶组织中表达高水平的山中（OKSM）转录因子。根据靶组织的不同，可通过使用不同的病毒或非病毒基因载体来实现这一目标。在本项研究中，采用经尾静脉水动力注射质粒DNA的方法将OKSM因子递送至小鼠肝细胞。该方法提供了概念验证证据 体内 成体体细胞向多能状态的重编程具有高效率和快速动力学特征，且未观察到肿瘤或畸胎瘤的形成 原位
可以得出结论，重编程体细胞 体内 与现有方法相比，可能提供一种快速、高效且安全地诱导增强型多能性的潜在途径 体外 执行的实验方案，未来可应用于不同类型的组织。

图1 展示了将编码 OKSM 的质粒进行小鼠肝脏基因转移的操作流程概览，以及用于观察的多种实验技术 在体 细胞重编程。在注射质粒后，转染的重编程因子（Oct3/4、Sox2、Klf4 和 cMyc）在mRNA水平上的基因表达于第2天显著升高。如图所示，这些因子的表达在注射后随时间推移逐渐下降。 图2a关于内源性多能性标志物（Nanog、Ecat1 和 Rex1）的表达，在注射后第2天和第4天，其水平相较于生理盐水注射组动物的肝细胞显著上调，并从第8天起恢复至基线水平 （图2b）同时，通过肝细胞特异性基因（Alb、Aat 和 Trf）的下调证实了肝细胞群体的去分化，该下调在第4天具有统计学显著性，并从第8天起降至基线水平 （图2d）.
通过流式细胞术检测了Oct3/4和Nanog在蛋白水平的表达。如图2c所示，HTV注射后第1天仅有Oct3/4表达，而内源性多能性标志物Nanog的表达则需等到第4天才能检测到。
发生 在体 通过使用抗OCT4、抗SOX2和抗Nanog抗体对肝组织进行免疫组织化学分析，并结合ALP活性的特异性染色，进一步证实了细胞重编程。在注射OKSM的动物肝组织中可重复检测到所有标记物阳性和ALP酶活性阳性细胞，而在注射生理盐水的对照组中则未检测到 （图3）.
通过检测血清中肝酶水平以及在120天内对肝组织切片进行H&amp;E染色和PAS染色，研究了经HTV注射pDNA进行体内细胞重编程可能引起的毒性副作用及畸胎瘤形成情况。直到第2天观察到短暂且不严重的组织损伤迹象，但未持续更长时间。在研究期间内，未观察到畸胎瘤形成或任何发育异常或形态学改变的迹象（图4）。所有动物在整个研究过程中均未出现肝脏结构或功能异常，白蛋白和肝酶水平以及组织切片的糖原染色结果均证实了这一点（图4b和c）。
<img alt="In vivo reprogramming factors injection, mouse diagram, plasmid, tissue analysis, PCR, cytometry." fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50837/50837fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50837/50837fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
图1. 示意图概述 体内 重编程过程及其分析 该方案包含两个主要阶段： (i) 重编程因子的递送 体内 和 （ii） 组织提取与样品分析 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50837/50837fig1large.jpg" target="_blank"> 单击此处查看大图</a>.
<img alt="基因表达分析；显示不同天数相对表达数据的柱状图；图 a-d；科学结果。" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50837/50837fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50837/50837fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 成年小鼠肝脏中 Yamanaka 转录因子的 体内 过表达。 Balb/C 小鼠通过水动力尾静脉（HTV）注射仅含 0.9% 生理盐水、或含 75 μg pCX-OKS-2A 与 75 μg pCX-cMyc 溶于 0.9% 生理盐水的混合物，分别在注射后第 2、4、8、12、24 天进行肝细胞的 RT-qPCR 分析，以测定以下基因的相对表达水平：(a) 转染的转录因子（OKSM）和 (b) 内源性多能性标志物；(c) OCT3/4 阳性与 Nanog 阳性细胞的流式细胞术分析；(d) 通过 RT-qPCR 测定的肝细胞标志物的相对基因表达水平。所有基因表达水平均以生理盐水 HTV 注射组为参照进行标准化。（* p&lt;0.05 表示与生理盐水 HTV 注射组相比具有统计学显著差异，经方差分析及 Tukey 成对比较检验得出）。该图改编自 Yilmazer 等29。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50837/50837fig2large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看高清大图</a>。
<img alt="盐水处理组与OKSM处理组细胞中OCT4、SOX2、NANOG的免疫荧光显微镜比较。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50837/50837fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50837/50837fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. 通过免疫组织化学法检测成年小鼠肝脏组织中的体内细胞重编程。 将Balb/C小鼠通过HTV注射仅含0.9%盐水，或含75 μg pCX-OKS-2A和75 μg pCX-cMyc的0.9%盐水。第4天收集肝脏，制备冷冻组织切片，并使用抗OCT4、抗SOX2或抗Nanog抗体染色以评估免疫反应性，或使用BCIP/NBT检测组织中的碱性磷酸酶（ALP）活性（40X）。比例尺为100 μm。本图改编自Yilmazer et al.29 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50837/50837fig3large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看高清大图</a>。
<img alt="Liver histology, enzyme levels, and albumin in saline vs. OKSM treatment, experiment results." fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50837/50837fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50837/50837fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4"> 
图4. 的影响 在体 细胞重编程对肝脏功能及组织病理学的影响 Balb/C小鼠经HTV注射 75 μg pCX-OKS-2A 和 75 μg pCX-cMyc 溶于0.9%生理盐水或仅0.9%生理盐水。于第2、4、8、12、50和120天分离肝脏组织和血清，并进行如下处理： (a) H&amp;E染色； (b) 肝酶水平； (c) 白蛋白水平； （d） PAS 染色。采用光学显微镜（10倍）拍摄代表性图像。比例尺表示 100 μm图改编自 Yilmazer 等29 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50837/50837fig4large.jpg" target="_blank">单击此处以查看大图</a>.

本研究展示了体细胞向多能性的重编程 体内 不会形成畸胎瘤。我们采用水动力尾静脉注射编码山中因子的质粒DNA来诱导 体内 成年肝细胞重编程为多能性增强的细胞

诱导性多能干细胞（iPS细胞）是通过强制表达特定因子，将体细胞重编程为多能状态而获得的……

以下实验的总体目标是在体内微环境中诱导并评估体细胞向多能性的重编程。该目标通过以下步骤实现：首先将编码山中因子（Yamanaka factors）的质粒DNA装入注射器，随后通过水动力法将其注射至BC小鼠的尾静脉。接着从肝脏组织中分离原代肝细胞，并通过实时定量逆转录聚合酶链式反应（real-time Q-R-T-P-C-R）和流式细胞术检测相关基因和蛋白质的表达水平。随后，对完整的肝脏组织进行切片，并采用不同技术进行染色，以确认组织的重编程效果并评估该操作的毒性。实验结果显示出重编程相关基因、多能性标志物及肝细胞特异性标志物在基因和蛋白质表达水平上的差异。此外，还通过生物化学和组织学证据验证了该方法的安全性。在体内重编程体细胞的主要优势在于其发生速度快、效率高且具有瞬时性。该方法有助于回答重编程领域中的关键问题，例如，在成年个体体内诱导多能性的结果。首先对一只六周龄的雌性bulby小鼠进行麻醉。然后按照随附文本方案中的描述，制备编码Yamanaka因子的质粒DNA溶液ENC以及生理盐水对照。为确保转染成功，需在注射后预设的时间点，于五至七秒内完成全部剂量的注射。通过暴露胸腔并用预热的HBSS缓冲液灌注肝脏，随后使用肝脏消化液以每分钟0.6升的流速持续灌注15分钟，直至肝脏肿胀且组织变松，从而分离原代肝细胞。然后用镊子剪断镰状韧带和冠状韧带后取出肝脏。有关原代肝细胞分离的更多细节，请参见此附加 JoVE 视频中的步骤。接下来，将肝脏通过100微米细胞筛网，同时用肝细胞洗涤液冲洗。为了获得细胞悬液，将细胞悬液收集到50毫升离心管中，并用肝细胞洗涤液调整体积至15毫升。然后在4摄氏度条件下以50 ×g离心4分钟。弃去上清液，重悬细胞沉淀。在10毫升肝细胞洗涤培养基中，应小心悬浮细胞沉淀，因为肝细胞是非常脆弱的细胞。重复离心步骤，共计三次，并将最终的细胞沉淀悬浮于10毫升肝细胞洗涤培养基中。然后使用血细胞计数板和光学显微镜估算细胞数量，以研究分离肝细胞的基因表达。首先，将 10 的 6 次方个细胞在 300 × g 条件下离心两次，弃去上清液。然后使用离心柱试剂盒按照供应商提供的说明从细胞中提取 RNA。接着，取处理组和对照组提取的 RNA 各 1 微克，进行两步法定量反转录聚合酶链式反应（Q-R-T-P-C-R），以检测重编程多能性相关基因及肝细胞标志物表达水平的变化。为了在蛋白质水平上分析细胞多能性的增强情况，取分离的肝细胞并将细胞密度调整至每毫升1 × 10⁷个细胞。进行流式细胞术时，准备100 µL的细胞悬液分样，然后加入100 µL BD CytoFix固定缓冲液，在室温下固定20分钟。固定后，离心收集细胞，弃上清，将细胞重悬于100 µL 1× BD破膜洗涤缓冲液中，室温孵育10分钟。接着，将细胞与多能细胞中表达的转录因子的一抗在30分钟内进行孵育。所用抗体包括抗小鼠T四per CP SCI 5.5或抗-US nag pe。务必同时设置阴性对照和同型对照。然后在质粒DNA注射后第四天，使用流式细胞仪通过PerCP-Cy5.5和PE通道分析染色的细胞，肝脏样本制备如随附文本方案所述。接着将甲醇固定的切片在室温下用封闭缓冲液孵育一小时，随后用洗涤缓冲液每次洗涤五分钟，共洗涤两次。接下来，将抗T四抗Socks2和抗Nag一抗分别加入不同的载玻片上，确保完全覆盖肝组织。覆盖样本以防止偏差，并在 4 摄氏度下孵育切片过夜。第二天，用洗涤缓冲液每次 5 分钟，共洗涤 3 次。随后，在室温下与相应的二抗孵育 1.5 小时。用 PBS 每次 5 分钟，清洗肝组织切片 3 次。将切片置于防淬灭封片剂中，并用盖玻片封固。随后使用落射荧光显微镜观察切片。将冷冻切片在室温下放置15分钟以使其升温，并用4%多聚甲醛固定2分钟。然后将载玻片在空气中干燥30分钟。干燥后，在37°C下用B-C-I-P-N-B-T液体底物孵育切片30分钟。在此期间，溶液将与组织中的碱性磷酸酶反应，形成可在显微镜下观察到的不溶性沉淀物。30分钟后，用蒸馏水洗涤切片，并使用水溶性封片剂封片。随后在第4、8、12和120天利用光学显微镜采集图像。转染后，直接从心脏心室采集 300 微升血液。在收集不同样本期间，将血液置于冰上，以防止血液过早凝固。所有样本收集完毕后，在 37 摄氏度下孵育 30 分钟，或直至血液完全凝固。然后以2000 G离心样品5分钟，并小心地用移液器将血清转移至新的离心管中。随后使用分光光度计检测血清中白蛋白以及肝酶ALT、AST、ALP和GLDH的水平。除了通过血液筛查评估肝毒性外，还需按照随附文本方案中的描述制备石蜡包埋的组织切片。然后用H和D或PIS染色法对组织进行染色，并分析所采集的图像。在质粒经水动力尾静脉注射后，通过光学显微镜观察，发现转染的重编程因子在mRNA水平上的基因表达显著增加，注射后第2天即可观察到T三四袜二和cmic的表达上升。这些因子的表达水平在注射后随时间推移逐渐下降。内源性多能性标志物 Nanog、ECAT1 和 REX1 在注射后第2天和第4天显著上调，与生理盐水注射动物的肝细胞相比具有统计学差异，从第8天起恢复至基线水平。同时，通过肝细胞特异性基因 Alb、Aat 和 Tfr 的下调证实了肝细胞群体的去分化，这些基因在第4天下调具有统计学意义，并从第8天起恢复至基线水平。此外，通过流式细胞术检测了T三四个蛋白水平的表达，如图所示。仅OC三四个在第一天表达。在HTV注射后，而对于内源性多能性标志物nano G的表达，则需等到第四天。通过肝组织的免疫组织化学分析进一步证实了体内细胞重编程的发生。在注射KSM的动物肝组织中，可重复地检测到所有标志物阳性和酶活性阳性细胞，而在注射生理盐水的对照组中则未检测到。H&E染色和PAS染色显示存在短暂但不严重的组织损伤迹象，该迹象在第2天后逐渐消失。在研究期间，未观察到畸胎瘤的形成或任何发育不良或形态学改变的迹象。通过此处显示的白蛋白和肝酶水平证实，在整个研究过程中，所有动物均未出现肝功能异常。本研究提供了体内细胞重编程实现多能性的原理性证据。在施用山中因子后，这一过程迅速、可传递且高效地发生。我们推测，只要具备适当的基因，除肝脏以外的其他组织也能实现体内重编程。肝脏载体被设计用于转染靶组织。此外，随着改进的方案和技术的发展，或许有可能提取体内程序化细胞用于进一步研究。

in-vivo-reprogramming-adult-somatic-cells-to-pluripotency

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

体内通过过表达 Yamanaka 因子将成体细胞重编程为多能性

本视频展示了使用可诱导的慢病毒表达Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4来生成诱导性多能干细胞的实验步骤。...

通过强制表达 Sox-2、Oct-4、c-Myc 和 Klf4 从小鼠胚胎成纤维细胞生成诱导多能干细胞

Stemgent Dox 诱导型小鼠转录因子慢病毒套装可将小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）重编程为诱导性多能干细胞（iPS 细胞）。本文演示了使用 DOX 诱导表达小鼠重编程转录因子 Oct4、Sox2、Klf4 和 c-Myc 的实验方案，以生成表达常见小鼠胚胎干细胞多能性标志物的 iPS...

利用四转录因子、多西环素诱导型慢病毒转导系统重编程小鼠胚胎成纤维细胞生成诱导性多能干细胞

我们展示了利用慢病毒介导递送人源因子Oct4、Sox2、Nanog和Lin28，将人体体细胞重编程为诱导性多能干细胞的实验方案。通过细胞形态及胚胎干细胞（ES）特异性标志物的表达，证实了细胞的多能性。...

利用Stemgent人转录因子慢病毒套装重编程人成纤维细胞以生成诱导性多能干细胞

我们介绍一种利用编码Oct3/4、Sox2、Klf4和c-myc（OSKM）的逆转录病毒载体，将人类体细胞高效重编程为人类诱导性多能干细胞（hiPSC），并通过Tra-1-81抗体活细胞染色鉴定正确重编程的hiPSC的实验方案。...

从成人成纤维细胞重编程获得的人诱导性多能干细胞克隆的筛选与分离

诱导多能干细胞的生成为自体移植的获取提供了广阔的前景。然而，经历多能性状态以及繁琐的再分化过程仍然阻碍着其临床转化。本文描述了成人人类成纤维细胞的获取及其直接转化为诱导性神经前体细胞，并进一步分化为神经谱系细胞的方法。...

成年成人成纤维细胞的分离及其直接转化为可扩增的神经前体细胞

诱导性多能干细胞（iPSCs）是临床应用和基础研究中患者特异性组织的重要来源。本文详细介绍了一种利用非整合型附加体质粒将来自冻存富集白细胞层的人外周血单个核细胞（PBMNCs）重编程为无病毒iPSCs的实验方案。...

利用非整合型附加体质粒从冻存的血沉棕黄层中生成诱导性多能干细胞

体细胞干细胞的可获得性对于再生医学、疾病建模以及深入理解干细胞特性至关重要。本文介绍了重编程的实验策略， 体外...

De Novo 通过 YAP/TAZ 生成体细胞干细胞

本文介绍一种具有临床相关性、高效且无需饲养层的重编程方法，利用编码重编程因子的修饰mRNA以及成熟的microRNA-367/302模拟物，将人原代成纤维细胞重编程为诱导性多能干细胞。文中还包括评估重编程效率、扩增单克隆iPSC集落以及验证多能性标志物TRA-1-60表达的方法。...

基于RNA的体细胞重编程将人原代成纤维细胞诱导为多能干细胞

细胞重编程需要导入关键基因，这些基因调控并维持多能细胞状态。本方案描述了一种非病毒、非整合的方法，通过使用未修饰RNA（NM-RNA）并结合免疫逃逸因子以降低细胞防御机制，从而实现由人皮肤成纤维细胞生成诱导性多能干细胞（iPSCs）克隆。...

从腹部皮肤分离成人人类真皮成纤维细胞及使用非整合方法生成诱导性多能干细胞

肝窦内皮细胞（SECs）的研究必须使用从动物体内获取的原代细胞进行，因为目前尚无可用的细胞系。该方法依赖于肝脏消化和差速离心法来纯化SECs，以便后续培养和实验操作。...

体内 肝脏内吞作用的观察及通过肝脏灌注纯化肝细胞

了解如何通过尾静脉水动力注射Yamanaka因子质粒DNA，在成年小鼠肝脏中将体细胞重编程为多能性细胞。该方法利用实时定量PCR和流式细胞术分析基因与蛋白表达变化，为再生医学研究提供安全高效的新策略。

体内通过过表达山中因子将成体体细胞重编程为多能性

探索更多视频

体内 通过过表达山中因子将成体体细胞重编程为多能性

探索更多视频

体内通过过表达山中因子将成体体细胞重编程为多能性