Name: BMP-2的共价结合利用表面上的自组装单层膜法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: 学习利用自组装单层膜法将BMP-2共价结合到金表面并保持其生物活性的技术。该方法通过物理气相沉积和抗体结合检测，为研究生长因子信号传导提供可靠工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

我们感谢斯图加特马克斯·普朗克智能系统研究所生物物理化学系（海德堡大学）和新材与生物系统系的 J.P. Spatz 教授提供的大力支持。同时，我们衷心感谢马克斯·普朗克学会以及德国研究基金会（DFG SFB/TR79 项目，资助 E.A.C.-A.）提供的经费支持。

1. 11-巯基十一烷酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯（MU-NHS）的合成
<ol>
	<li>在室温下，将500 mg N-羟基琥珀酰亚胺和30 mg 4-(二甲氨基)吡啶溶于10 ml丙酮（p.a.）的溶液逐滴加入含有1 g 11-巯基十一烷酸的40 ml二氯甲烷（p.a.）溶液中。</li>
	<li>将反应液冷却至0 °C，在氮气氛围下，逐滴加入1.1 g N,N'-二环己基碳二亚胺溶于10 ml二氯甲烷的溶液。保持低温反应1小时，随后在室温下搅拌过夜。</li>
	<li>过滤析出的沉淀，并在减压条件下干燥。通过快速柱层析法纯化产物，洗脱剂为石油醚与乙酸乙酯（p.a.）按1:1比例混合的溶液。</li>
</ol>
2. 均匀金层的制备
<ol>
	<li>使用精密擦拭纸清洁玻璃盖玻片，并在含有1:1比例的乙酸乙酯（p.a.）和甲醇（p.a.）的溶液中超声处理5分钟。用甲醇冲洗基底，并在氮气流下吹干。</li>
	<li>将清洁的基底放入溅射镀膜仪中。抽真空至腔室达到所需真空度。通过溅射60秒去除铬靶材最上层的氧化铬层。将样品置于金属束下方，先镀上一层10 nm的铬层，随后再镀上一层40 nm的金层。</li>
</ol>
3. BMP-2 的表面固定化
<ol>
	<li>将MU-NHS溶解于 N,N-将二甲基甲酰胺（DMF）加入至终浓度约为1 mM，在氮气氛围下室温孵育金基底4小时。</li>
	<li>在DMF中对表面进行2分钟超声处理，用DMF和甲醇冲洗，并在氮气流下吹干。</li>
	<li>在无菌的4 mM HCl中配制浓度为100 μg/ml的rhBMP-2储备液（分装后于-80 °C保存）。工作液稀释时，用PBS/NaCl（含1 M NaCl的PBS）将储备液稀释至3.5 μg/ml，并在使用前立即调节pH至8.5。</li>
	<li>将功能化处理的MU-NHS表面置于rhBMP-2工作溶液中，4 °C孵育过夜。移除孵育后的上清液。用PBS/NaCl超声处理表面2分钟，并用无菌PBS/NaCl洗涤3次。</li>
</ol>
4. 表面表征
<ol>
	<li>为阻断抗体的非特异性吸附，先将表面与含5% BSA（w/v）的PBS溶液在室温下孵育1小时，随后与抗BMP-2抗体（1:100，溶于含1%（w/v）BSA的PBS溶液）在室温下孵育1小时。用PBS洗涤表面两次，并超声处理30秒。</li>
	<li>将基底与HRP标记的二抗（1:1,000，溶于含1%（w/v）BSA的PBS溶液）在室温下孵育30分钟，然后用PBS洗涤两次。</li>
	<li>使用Ampliflu Red检测试剂盒，通过酶标仪在570 nm处测定HRP的酶活性。</li>
</ol>
5. 生物活性分析
<ol>
	<li>在6孔板中，每孔接种1 × 105个鼠源C2C12成肌细胞，培养基为含丙酮酸的高糖DMEM，补充10% FBS和1%青霉素/链霉素，于37 °C、5% CO2条件下培养24小时。</li>
	<li>在接种至固定化BMP-2修饰的表面之前，用无血清DMEM对细胞进行3–5小时的饥饿处理。</li>
	<li>为研究短期信号诱导，将培养基更换为200 μl新鲜的无血清DMEM，然后将固定化BMP-2的表面置于细胞上方。操作时应使用精细尖头镊子，避免刮伤表面。</li>
	<li>轻柔移除表面材料，用移液器吸除培养基，并用PBS洗涤细胞两次。随后进行细胞反应的分析。</li>
	<li>为分析长期生物学活性，将细胞接种于上述表面，在低血清条件（2% FBS）下，于37 °C、5% CO2环境中培养六天。</li>
</ol>

<ol><li>Helm, G., Andersson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Summary+statement%3A+Bone+morphogenetic+proteins%3A+Basic+science%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">Summary statement: Bone morphogenetic proteins: Basic science.</a> Spine. 27 (16S), S9(2002).</li>
<li>Hogan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+morphogenetic+proteins%3A+multifunctional+regulators+of+vertebrate+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Bone morphogenetic proteins: multifunctional regulators of vertebrate development.</a> Genes Dev. 10 (13), 1580-1594 (1996).</li>
<li>Reddi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMPs%3A+from+bone+morphogenetic+proteins+to+body+morphogenetic+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine+Growth+Factor+Rev%22%5BJournal%5D)">BMPs: from bone morphogenetic proteins to body morphogenetic proteins.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 16, 249-250 (2005).</li>
<li>Rengachary, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+morphogenetic+proteins%3A+basic+concepts%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurg+Focus%22%5BJournal%5D)">Bone morphogenetic proteins: basic concepts.</a> Neurosurg Focus. 13 (6), 1-6 (2002).</li>
<li>Schlunegger, M., Grütter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+unusual+feature+revealed+by+the+crystal+structure+at+2.2+%C3%85%3B+resolution+of+human+transforming+growth+factor-%CE%B22%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An unusual feature revealed by the crystal structure at 2.2 Å; resolution of human transforming growth factor-β2.</a> Nature. 358, 430-434 (1992).</li>
<li>Scheufler, C., Sebald, W., Hülsmeyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+human+bone+morphogenetic+protein-2+at+2.7+%C3%85+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of human bone morphogenetic protein-2 at 2.7 Å resolution.</a> J. Mol. Biol. 287 (1), 103-115 (1999).</li>
<li>Nimni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polypeptide+growth+factors%3A+targeted+delivery+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Polypeptide growth factors: targeted delivery systems.</a> Biomaterials. 18 (18), 1201-1225 (1997).</li>
<li>Wozney, J., Rosen, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+morphogenetic+protein+and+bone+morphogenetic+protein+gene+family+in+bone+formation+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Orthop.+Related+Res%22%5BJournal%5D)">Bone morphogenetic protein and bone morphogenetic protein gene family in bone formation and repair.</a> Clin. Orthop. Related Res. 346, 26(1998).</li>
<li>Rosen, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+and+BMP+inhibitors+in+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">BMP and BMP inhibitors in bone.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1068, 19-25 (2006).</li>
<li>Kirsch, T., Sebald, W., Dreyer, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+BMP-2-BRIA+ectodomain+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the BMP-2-BRIA ectodomain complex.</a> Nat. Struct. Biol. 7 (6), 492-496 (2000).</li>
<li>Keller, S., Nickel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+recognition+of+BMP-2+and+BMP+receptor+IA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular recognition of BMP-2 and BMP receptor IA.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 11 (5), 481-488 (2004).</li>
<li>Miyazono, K., Maeda, S., Imamura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+receptor+signaling%3A+transcriptional+targets%2C+regulation+of+signals%2C+and+signaling+cross-talk%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine+Growth+Factor+Rev%22%5BJournal%5D)">BMP receptor signaling: transcriptional targets, regulation of signals, and signaling cross-talk.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 16 (3), 251-263 (2005).</li>
<li>Nohe, A., Hassel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mode+of+bone+morphogenetic+protein+%28BMP%29+receptor+oligomerization+determines+different+BMP-2+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The mode of bone morphogenetic protein (BMP) receptor oligomerization determines different BMP-2 signaling pathways.</a> J. Biol. Chem. 277 (7), 5330-5338 (2002).</li>
<li>Sieber, C., Kopf, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+BMP+receptor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine+Growth+Factor+Rev%22%5BJournal%5D)">Recent advances in BMP receptor signaling.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 20 (5-6), 343-355 (2009).</li>
<li>Carragee, E. J., Hurwitz, E. L., Weiner, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+review+of+recombinant+human+bone+morphogenetic+protein-2+trials+in+spinal+surgery%3A+emerging+safety+concerns+and+lessons+learned%5BTitle%5D)+AND+%22Spine+J%22%5BJournal%5D)">A critical review of recombinant human bone morphogenetic protein-2 trials in spinal surgery: emerging safety concerns and lessons learned.</a> Spine J. 11, 471-491 (2011).</li>
<li>Luginbuehl, V., Meinel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+delivery+of+growth+factors+for+bone+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Pharm.+Biopharm%22%5BJournal%5D)">Localized delivery of growth factors for bone repair.</a> Eur. J. Pharm. Biopharm. 58 (2), 197-208 (2004).</li>
<li>Nakaji-Hirabayashi, T., Kato, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oriented+immobilization+of+epidermal+growth+factor+onto+culture+substrates+for+the+selective+expansion+of+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Oriented immobilization of epidermal growth factor onto culture substrates for the selective expansion of neural stem cells.</a> Biomaterials. 28 (24), 3517-3529 (2007).</li>
<li>Gonçalves, R., Martins, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioactivity+of+immobilized+EGF+on+self-assembled+monolayers%3A+Optimization+of+the+immobilization+process%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+Part+A.+94A%22%5BJournal%5D)">Bioactivity of immobilized EGF on self-assembled monolayers: Optimization of the immobilization process.</a> J. Biomed. Mater. Res. Part A. 94A. 2 (2), 576-585 (2010).</li>
<li>Pohl, T. L. M., Boergermann, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+immobilization+of+bone+morphogenetic+protein+2+via+a+self-assembled+monolayer+formation+induces+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Surface immobilization of bone morphogenetic protein 2 via a self-assembled monolayer formation induces cell differentiation.</a> Acta Biomater. 8 (2), 772-780 (2012).</li>
<li>Love, J., Estroff, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembled+monolayers+of+thiolates+on+metals+as+a+form+of+nanotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Self-assembled monolayers of thiolates on metals as a form of nanotechnology.</a> Chem. Rev. 105 (4), 1103-1169 (2005).</li>
<li>Katagiri, T., Yamaguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+morphogenetic+protein-2+converts+the+differentiation+pathway+of+C2C12+myoblasts+into+the+osteoblast+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Bone morphogenetic protein-2 converts the differentiation pathway of C2C12 myoblasts into the osteoblast lineage.</a> J. Cell Biol. 127 (6), 1755-1766 (1994).</li>
<li>Whitaker, M. J., Quirk, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+factor+release+from+tissue+engineering+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Growth factor release from tissue engineering scaffolds.</a> J. Pharm. Pharmacol. 53 (11), 1427-1437 (2001).</li>
<li>Uludag, H., D'Augusta, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implantation+of+recombinant+human+bone+morphogenetic+proteins+with+biomaterial+carriers%3A+a+correlation+between+protein+pharmacokinetics+and+osteoinduction+in+the+rat+ectopic+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res%22%5BJournal%5D)">Implantation of recombinant human bone morphogenetic proteins with biomaterial carriers: a correlation between protein pharmacokinetics and osteoinduction in the rat ectopic model.</a> J. Biomed. Mater. Res. 50 (2), 227-238 (2000).</li>
<li>Kashiwagi, K., Tsuji, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directional+BMP-2+for+functionalization+of+titanium+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Directional BMP-2 for functionalization of titanium surfaces.</a> Biomaterials. 30 (6), 1166-1175 (2008).</li>
<li>Karageorgiou, V., Meinel, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+morphogenetic+protein-2+decorated+silk+fibroin+films+induce+osteogenic+differentiation+of+human+bone+marrow+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res%22%5BJournal%5D)">Bone morphogenetic protein-2 decorated silk fibroin films induce osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells.</a> J. Biomed. Mater. Res. 71 (3), 528-573 (2004).</li>
<li>Rose, F. R. A. J., Hou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+systems+for+bone+growth+factors+-+the+new+players+in+skeletal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Delivery systems for bone growth factors - the new players in skeletal regeneration.</a> J. Pharm. Pharmacol. 56 (4), 415-427 (2004).</li>
<li>Masters, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalent+growth+factor+immobilization+strategies+for+tissue+repair+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Covalent growth factor immobilization strategies for tissue repair and regeneration.</a> Macromol. Biosci. 11 (9), 1149-1163 (2011).</li>
<li>Crouzier, T., Fourel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presentation+of+BMP-2+from+a+soft+biopolymeric+film+unveils+its+activity+on+cell+adhesion+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Presentation of BMP-2 from a soft biopolymeric film unveils its activity on cell adhesion and migration.</a> Adv. Mater. 23 (12), H111-H118 (2011).</li>
<li>Ruppert, R., Hoffmann, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+bone+morphogenetic+protein+2+contains+a+heparin-binding+site+which+modifies+its+biological+activity%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Human bone morphogenetic protein 2 contains a heparin-binding site which modifies its biological activity.</a> European Journal of Biochemistry. 237 (1), 295-302 (1996).</li>
<li>Love, J., Estroff, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembled+monolayers+of+thiolates+on+metals+as+a+form+of+nanotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Self-assembled monolayers of thiolates on metals as a form of nanotechnology.</a> Chem. Rev. 105 (4), 1103-1169 (2005).</li>
<li>Kato, K., Sato, H., Iwata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+of+histidine-tagged+recombinant+proteins+onto+micropatterned+surfaces+for+cell-based+functional+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Immobilization of histidine-tagged recombinant proteins onto micropatterned surfaces for cell-based functional assays.</a> Langmuir. 21 (16), 7071-7075 (2005).</li>
<li>Martins, M., Curtin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecularly+designed+surfaces+for+blood+deheparinization+using+an+immobilized+heparin-binding+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res%22%5BJournal%5D)">Molecularly designed surfaces for blood deheparinization using an immobilized heparin-binding peptide.</a> J. Biomed. Mater. Res. 88 (1), 162-173 (2009).</li>
<li>Limbut, W., Kanatharana, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+of+capacitive+immunosensors+based+on+self-assembled+monolayers+formed+from+thiourea%2C+thioctic+acid%2C+and+3-+mercaptopropionic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">A comparative study of capacitive immunosensors based on self-assembled monolayers formed from thiourea, thioctic acid, and 3- mercaptopropionic acid.</a> Biosens. Bioelectron. 22 (2), 233-240 (2006).</li>
<li>Patel, N., Davies, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+of+protein+molecules+onto+homogeneous+and+mixed+carboxylate-terminated+self-assembled+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Immobilization of protein molecules onto homogeneous and mixed carboxylate-terminated self-assembled monolayers.</a> Langmuir. 13 (24), 6485-6490 (1997).</li>
<li>Hu, J., Duppatla, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+PEGylation+of+bone+morphogenetic+protein-2+cysteine+analogues%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug.+Chem%22%5BJournal%5D)">Site-specific PEGylation of bone morphogenetic protein-2 cysteine analogues.</a> Bioconjug. Chem. 21 (10), 1762-1772 (2010).</li>
<li>Hersel, U., Dahmen, C., Kessler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RGD+modified+polymers%3A+biomaterials+for+stimulated+cell+adhesion+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">RGD modified polymers: biomaterials for stimulated cell adhesion and beyond.</a> Biomaterials. 24 (24), 4385-4415 (2003).</li>
<li>Cao, T., Wang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+spacer+length+effect+on+immobilized+Escherichia+coli+pili-antibody+molecular+recognition+by+AFM%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Investigation of spacer length effect on immobilized Escherichia coli pili-antibody molecular recognition by AFM.</a> Biotechnol. Bioeng. 98 (6), 1109-1122 (2007).</li>
<li>Puleo, D., Kissling, R., Sheu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+technique+to+immobilize+bioactive+proteins%2C+including+bone+morphogenetic+protein-4+%28BMP-4%29%2C+on+titanium+alloy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A technique to immobilize bioactive proteins, including bone morphogenetic protein-4 (BMP-4), on titanium alloy.</a> Biomaterials. 23 (9), 2079-2087 (2002).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在本实验方案中，我们描述了用生物活性重组人骨形态发生蛋白-2（rhBMP-2）功能化修饰表面的制备方法。该方法包括两个步骤：1）在金表面上首先形成双功能连接分子的自组装单分子层（SAM）；2）rhBMP-2蛋白的共价固定。在前期研究中，我们已验证了双功能连接分子与生长因子的有效结合，并证明表面固定的rhBMP-2能够保持其生物学活性19。其他研究也证实了以固定化形式呈现的生长因子具有生物活性，表明蛋白的释放及其后续的细胞内化并非细胞刺激所必需24,25。事实上，生长因子的共价固定可实现对靶细胞的持续刺激，同时由于提高了细胞膜上多种受体的占据率，从而维持有效的剂量效应22,23,26-28。
在制备固定化rhBMP-2的表面时，整个操作过程中应谨慎处理表面材料，并小心配制rhBMP-2溶液。玻璃盖玻片应保持清洁、干燥，表面不得有缺陷或杂质可见。应避免使用镊子或移液器刮伤表面。在采用rhBMP-2进行表面功能化步骤时，必须使用无载体蛋白的重组蛋白。 即 不添加牛血清白蛋白进行制备，以避免载体在表面发生非...

骨形态发生蛋白2（BMP-2）是转化生长因子β（TGF-β）家族的一员，具有诱导作用 从头合成 骨形成以及在胚胎发育和成体稳态过程中多种组织的调控者1-3. 生物活性同源二聚体BMP-2蛋白的每个单体均包含一个 &#34;半胱氨酸结&#34; 在所有骨形态发生蛋白（BMPs）中高度保守的基序4七个半胱氨酸残基中有六个形成分子内二硫键，从而稳定每个单体结构，而第七个半胱氨酸参与二聚化，介导两个单体之间的分子间二硫键形成。5,6这种高度保守的半胱氨酸结构决定了BMP-2蛋白的三维结构，并赋予其独特的性质，例如对热、变性剂和酸性pH的抗性。7-9BMP-2 与丝氨酸/苏氨酸激酶跨膜受体结合，从而诱导信号转导10-12根据受体寡聚化方式的不同，会激活不同的信号通路：一种非Smad依赖性信号级联通过p38信号通路诱导碱性磷酸酶的表达；而另一种由受体磷酸化激活的Smad依赖性通路则导致Smad复合物向细胞核转位，进而激活特定靶基因（如分化抑制因子（Id））的转录12-14.
在骨组织中，BMP-2 可诱导间充质干细胞向成骨细胞分化，从而促进骨愈合与修复 从头合成 骨的形成。目前，临床上应用重组表达的BMP-2以促进骨折部位的愈合。在骨组织工程中，一种常见策略是使用可注射的生长因子，相较于局部递送系统，该方法侵入性更小。然而 体内 研究表明，BMP-2 的短生物半衰期、非特异性定位以及快速的局部清除可能导致多种局部、异位及全身性问题15因此，为了实现有效的递送，必须将BMP-2包埋或固定于材料内部或表面，以实现其在靶向部位的局部持续释放。通过非共价保留方法（如物理包埋、吸附或离子络合）可实现持续释放。16然而，已知蛋白质非特异性吸附到表面可能导致分子变性17. 近十年来，为实现生长因子的共价结合，已开发出多种类型的载体。其中一种方法是使用双功能连接分子，靶向蛋白质的氨基或羧基，从而无需对蛋白质进行修饰即可实现其固定化。事实上，尽管蛋白质修饰具有可控制蛋白质取向的优势，但引入人工结构域、肽标签和位点特异性链可能会改变生长因子的生物活性17因此，为了规避因与支撑材料相互作用而导致的变性，可预先对表面进行功能化处理，例如，先修饰一层连接分子的自组装单分子层（SAM），再偶联目标因子18我们采用基于SAM的方法，通过靶向BMP-2的游离胺基团将其共价固定于表面，并证实固定化后的蛋白仍保持其短期和长期的生物学活性19. 本方案提供了一种简单高效的方法，将BMP-2递送至细胞 体外 研究发生在细胞膜上的机制及其调控成骨信号相关细胞内信号传导的过程。

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;N-羟基琥珀酰亚胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>130672</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>4-(二甲氨基)吡啶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>522805</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>丙酮</td><td>AppliChem</td><td>A2282</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>11-巯基十一烷酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>674427</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>二氯甲烷</td><td>默克</td><td>106050</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N&#039;&lt;/em&gt;二环己基碳二亚胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D80002</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>石油苯</td><td>默克</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>玻璃盖玻片</td><td>卡尔·罗斯</td><td>M 875</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>乙酸乙酯</td><td>AppliChem</td><td>A3550</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>卡尔·罗特</td><td>4627</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N&lt;/em&gt;二甲基甲酰胺</td><td>卡尔·罗特</td><td>T921</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>rhBMP-2</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>355-BM</td><td>无载体；在...中表达 &lt;em&gt;大肠杆菌&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>PBS</td><td>聚丙烯酸</td><td>H15-002</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>卡尔·罗特</td><td>HN00.2</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>聚二甲基硅氧烷（PDMS）</td><td>道康宁</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Sylgard 184 硅胶弹性体试剂盒</td><td>道康宁</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>抗-重组人骨形态发生蛋白-2</td><td>Sigma</td><td>B9553</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 IgG-HRP</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2005</td><td>二抗</td></tr><tr><td>Ampliflu Red 检测</td><td>Sigma</td><td>90101</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）（1×），液体</td><td>Gibco</td><td>41966</td><td>高葡萄糖</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Sigma</td><td>F7524</td><td>经无菌过滤，细胞培养测试</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>0.05% 胰蛋白酶（1×）含 EDTA 4Na</td><td>Gibco</td><td>25300</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>甘氨酸（0.1 M）</td><td>Riedel-de Ha&amp;euml;n</td><td>33226</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630（1%）</td><td>Sigma</td><td>I8896</td><td>碱性磷酸酶检测裂解缓冲液&lt;sup&gt;19&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>氯化镁（MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)(1 mM)</td><td>卡尔·罗特</td><td>HNO3.2</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>氯化锌（ZnCl₂）&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;) (1 mM)</td><td>卡尔·罗特</td><td>3533.1</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>对硝基苯基磷酸酯（pNPP）</td><td>Sigma</td><td>S0942</td><td>磷酸酶底物</td></tr><tr><td>抗肌球蛋白重链（MHC）</td><td>发育研究杂交瘤库，爱荷华大学</td><td>MF20</td><td>单克隆抗体</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>超声波清洗仪（Sonorex Super RK 102H），频率 35 kHz</td><td>BANDELIN electronic GmbH & Co. KG</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>MED 020 溅射镀膜系统</td><td>BAL-TEC AG</td><td></td><td>镀膜条件&lt;br/&gt; Cr：120 mA，1.3 × 10&lt;sup&gt;-2&lt;/sup&gt; 毫巴，30 秒&lt;br/&gt; Au：60 mA，5.0 × 10&lt;sup&gt;-2&lt;/sup&gt; 毫巴，45 秒</td></tr><tr><td>Tecan Infinite M200 酶标仪</td><td>Tecan</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

采用自组装单分子层方法将bmp-2共价结合至表面

Covalent Binding of BMP-2 on Surfaces Using a Self-assembled Monolayer Approach

骨形态发生蛋白2（BMP-2）是一种嵌入骨组织细胞外基质中的生长因子。BMP-2可触发间充质细胞向成骨细胞分化，从而促进骨组织修复与愈合 从头合成 骨形成。近年来，重组人骨形态发生蛋白-2（rhBMP-2）与支架材料联合应用于临床时引发了争议，主要涉及其呈递方式和递送剂量。本文所述方案提供了一种简单高效递送BMP-2的方法 体外 关于细胞的研究。我们描述了如何形成由异双功能连接分子组成的自组装单分子层，并展示了随后的结合步骤以实现rhBMP-2的共价固定。通过该方法，可在维持蛋白生物学活性的同时实现BMP-2的持续呈递。事实上，BMP-2的表面固定化可通过防止非特异性吸附而实现靶向研究，同时减少生长因子的用量，尤其重要的是可抑制其从表面的不受控释放。当细胞接触呈递共价固定化rhBMP-2的表面时，可触发BMP-2介导的短期和长期信号事件，表明该方法适用于 体外 细胞对BMP-2刺激反应的研究。

在我们的实验设计中，选择金作为辅料，因为它提供了一个生物学上非特异性但化学上可调控的体系。此外，自组装单分子层的应用具有诸多优势：SAMs通过其“头部基团”在金属表面自发吸附，形成缺陷较少的单分子层，而其功能化的末端基团可进一步修饰。因此，SAMs提供了一个可控且高度可调的平台，用于定制界面的性质20。
为了将BMP-2固定在镀金表面上，我们采用两步法：1）将MU-NHS连接剂结合到金层上，然后2）使该连接剂与蛋白质反应（见图1）。为验证rhBMP-2的结合，我们使用了酶联免疫测定法。在此实验中，含有固定化rhBMP-2的表面与BMP-2特异性抗体以及HRP标记的二抗共同孵育。通过Ampliflu Red溶液可检测后者二抗的结合。在过氧化氢存在下，HRP催化无色的Ampliflu Red（10-乙酰基-3,7-二羟基吩噁嗪）转化为荧光产物试卤灵（resorufin）。我们在功能化表面从上方接近贴壁细胞之前和之后，均检测了表面固定的rhBMP-2（iBMP-2）。请注意，在使用Ampliflu Red法检测rhBMP时，样品需经...

我们描述了一种在表面高效固定BMP-2的方法。该方法基于自组装单分子层的形成，通过BMP-2的游离胺基实现其共价结合。此方法是研究细胞膜信号传导的有用工具。

采用自组装单分子层方法将BMP-2共价结合至表面

骨形态发生蛋白2（BMP-2）是一种嵌入骨组织细胞外基质中的生长因子。BMP-2可作为间充质细胞分化的触发因子……

本实验的总体目标是将 BMP-2 分子共价结合到表面，同时不丧失其生物活性。该目标首先通过物理气相沉积法在基底上形成一层金膜来实现。第二步是构建一层自组装的双功能 NHS-硫醇连接分子 mu NHSA 单分子层。接下来，将重组人BMP-2（RH BMP two）共价结合到连接子上。最后一步是通过超声处理去除未结合的BMP-2。最终，采用抗体结合实验验证BMP-2成功结合至表面，并通过分析细胞中SMAD1/5/8的磷酸化水平来确定表面结合的BMP-2的生物学活性。该方法有助于解答生长因子生物学领域中的关键问题，例如生长因子在细胞表面与其受体的初始结合是否足以触发信号转导反应。演示本实验步骤的将是我实验室的两名成员，Teresa Paul 和 Elizabeth Schwab。开始此操作前，先用精密擦拭纸清洁玻璃盖玻片，然后将其在乙酸乙酯与甲醇按1:1比例配制的混合液中超声处理五分钟。超声处理后，用甲醇冲洗基底，并在氮气流下吹干。将清洁的基底放入溅射镀膜设备中，抽真空。通过溅射60秒去除铬靶材最上层的氧化铬层。然后在基底上镀一层10纳米的铬层，接着再镀一层40纳米的金层。完成后，将金基底从腔室中取出并放置一旁。将金基底转移至一个双颈圆底烧瓶中，在氮气氛围下，用1毫摩尔的M-U-N-H-S DMF溶液于室温孵育4小时。孵育后，将底物在DMF中超声处理两分钟。用DMF和甲醇冲洗，并在氮气流下干燥。用含1摩尔氯化钠的PBS缓冲液稀释RHB MP two储备液，使其终浓度为每毫升3.5微克。使用无菌的10毫摩尔氢氧化钾在使用前立即调节该工作液至pH 8.5。将A-P-D-M-S环置于样品上方。将基底转移至六孔板中，以确保仅有基底表面暴露于孵育溶液中。然后将功能化的 M-U-N-H-S 基底与 RHB MP 二抗工作液在 4 摄氏度下孵育过夜。去除孵育后的上清液后，加入含 1 M 氯化钠的 PBS 溶液，并将基底超声处理 2 分钟。完成后，用含 1 M 氯化钠的无菌 PBS 溶液洗涤基底三次，以阻断抗体的非特异性吸附。将底物在含5% BSA的PBS中室温孵育1小时。随后，将底物与抗BMP二抗溶液在室温下孵育1小时；孵育结束后，用PBS洗涤底物两次，并超声处理30秒。接着，将底物在HRP标记的二抗溶液中室温孵育30分钟，然后用PBS洗涤两次。使用Ampliflu红色检测试剂，在酶标仪上于570纳米处测定HRP的酶活性。在六孔板中，以每孔1×10⁵个C2C12成肌细胞的密度接种于生长培养基中，并在37°C和5% CO₂条件下培养24小时。待培养板从培养箱中取出后，吸除各孔中的培养基，并在接种至功能化的BMP-2底物表面以研究短期信号诱导之前，用无血清DMEM对细胞饥饿处理3至5小时。随后，更换为200微升新鲜的无血清DMEM，并使用细尖镊子将固定化的BMP-2底物置于细胞上方

covalent-binding-bmp-2-on-surfaces-using-self-assembled-monolayer

Research

科研

JoVE Journal

Chemistry

化学

BMP-2的共价结合利用表面上的自组装单层膜法

本文展示了如何利用邻近连接技术（PLA），结合特异性抗体来可视化固定细胞中骨形态发生蛋白（BMP）信号通路。该技术使我们能够追踪内源性BMP激活的效应复合物在细胞核中的累积，并在BMP4刺激条件下随时间定量其表达水平。...

使用 BMP4 下游信号效应复合物的检测 原位 PLA，一种邻近连接检测技术

本文介绍了一种将多种单分子共价偶联到原子力显微镜（AFM）探针尖端的实验方案，并提供了测定这些分子在固体载体及生物界面黏附力和自由能的步骤与实例。...

通过原子力谱学研究单分子粘附

我们描述了纳米生物系统的制备与表征，该系统将纳米结构基底与固定化的蛋白质和适配体进行界面结合。文中报道了涉及纳米结构基底的光刻制备、生物功能化以及表面增强拉曼光谱（SERS）表征等相关实验步骤。展示了对表面固定化蛋白质的SERS检测，以及对蛋白质-配体和适配体-配体结合相互作用的探测。...

利用电子束光刻制备的纳米结构基底通过表面增强拉曼光谱检测生物分子

我们提出了一种在玻璃表面进行功能化的方法，使其形成被流动脂双层包围的纳米级蛋白质斑块。这些基底适用于先进的光学显微镜技术，有望作为细胞黏附与迁移研究的平台。...

支撑脂双层中的配体纳米簇阵列

掺杂骨形态发生蛋白2（BMP2）的生物材料已被用作治疗骨不连骨折的一种新治疗策略。为了克服因该因子不可控释放所导致的副作用，我们提出一种新的策略，可将该因子定点固定，从而制备出具有增强成骨能力的材料。...

通过点击化学实现骨形态发生蛋白2在固体表面的定点固定

本方案描述了使用异双功能硅烷偶联剂将蛋白质共价固定在二氧化硅表面的方法，该表面专为基于原子力显微镜的单分子力谱技术而设计，并以肺炎链球菌（S.

用于单分子力谱的蛋白质共价固定

将探针分子共价连接到原子力显微镜（AFM）悬臂尖端是研究其物理性质的关键技术。通过基于AFM的单分子力谱法，可高度可重复地测定聚合物的拉伸力、脱附力及其长度。...

用于基于原子力显微镜的力谱单分子共价连接

生物膜力探针（BFP）是一种 原位 动态力谱学（DFS）技术。BFP可用于测量活细胞上分子相互作用的弹簧常数。本方案介绍了通过BFP检测到的分子键的弹簧常数分析方法。...

利用生物膜力探针光谱法进行分子弹簧常数分析

当转化生长因子ß家族前体蛋白在非洲爪蟾（Xenopus...

囊胚腔内分泌的转化生长因子β家族切割产物分析 非洲爪蟾 胚胎

一个 体外 通过将间充质细胞和内皮细胞接种到预先制备的三维聚乙二醇水凝胶上，建立骨髓血管微环境模型。该微环境中的内皮网络、细胞外基质成分以及碱性磷酸酶活性会因所使用的生长因子不同而发生变化。该平台可用于构建高级癌症模型。 <br...

利用预铸聚乙二醇（PEG）水凝胶在成像微孔板中简便构建血管化成骨骨髓微环境

本方案介绍了利用聚合物接枝的金属有机框架（MOF）晶体合成与表征自组装MOF单层膜的方法。该方法表明，聚合物接枝的MOF颗粒可在气-水界面自组装，形成结构完整、可自由支撑的单层结构，扫描电子显微镜成像结果证实了这一点。...

利用聚合物包覆颗粒合成与表征自组装金属-有机框架单层

学习利用自组装单层膜法将BMP-2共价结合到金表面并保持其生物活性的技术。该方法通过物理气相沉积和抗体结合检测，为研究生长因子信号传导提供可靠工具。

采用自组装单分子层方法将BMP-2共价结合至表面

探索更多视频