通过鸟类消化系统传播后鉴定传染性朊病毒的实验步骤

该程序的总体目标是记录传染性 PreOn 物质通过 American Crows 的消化系统。这是通过首先使用传染性 PreOn 材料对乌鸦进行测量来实现的。第二步是在管饲后收集乌鸦粪便 4 小时，并准备注射到小鼠体内。

接下来，用 1 毫升乌鸦粪匀浆腹膜内接种小鼠。最后一步是每天监测小鼠，直到它们表现出小鼠刮擦的临床症状。最终，蛋白质印迹分析用于确认小鼠模型中是否存在感染性 PreOn 并验证疾病传播。

乌鸦可以运输的想法。CWD 在一个冬天的一天来找我们，当时我们开车到一个圈养的麋鹿设施，在那里我们做了一些研究，看到路杀麋鹿被乌鸦喂食，那天晚些时候，乌鸦不知从哪里冒出来，降落在这些饲料槽里，就在麋鹿旁边吃东西，在麋鹿吃的谷物上排便，除了从文献中观察到很多那个夏天整个科罗拉多州的乌鸦，怀俄明州冬天在新墨西哥州的一个集中地区，碰巧新墨西哥州的那个地区是一些 CABD 出现的地方，它距离快克消耗性疾病的中心有一百英里。所以这两个观察结果让我们想到，乌鸦可能在将 CWD 运送到景观中发挥作用。

这些技术的视觉演示至关重要，因为不正确的腹膜内和口腔灌胃技术会导致研究动物死亡。首先，在炒鸡蛋中加入四滴蓝色染料并充分混合。然后将 5 毫升染料和鸡蛋混合物吸入 2 英寸的管饲针中，一个人轻轻地束缚乌鸦。

将乌鸦的喙张得足够大，可以看到它的喉咙，然后小心地将管饲针插入它的食道。如果发现任何呼吸改变，请取出注射器并重试，因为它可能已放入气管中。一旦确定管饲针在食道中，慢慢挤出注射器的内容物。

每 30 分钟检查一次乌鸦，直到蓝绿色染色的粪便不再被排泄。测试乌鸦大约需要四个小时才能停止排泄蓝色染色的粪便。接下来，将一份未感染的 C 57 黑色六小鼠脑加入四份无菌 PBS 和一些玻璃珠中，放入子弹搅拌机中。

均质器将样品均质化 1 至 5 分钟，直到达到光滑的稠度。使用感染 C 57 黑色六只小鼠大脑的绝症 R ML Chandler 菌株重复该过程。接下来，将均质物以 3000 倍 G 离心 1 分钟。

去除较大的颗粒物。然后去除上清液，用等体积的无菌 one XPBS 稀释，以产生每体积脑物质 10% 的重量。在 PBS 中，将样品储存在负 80 摄氏度，直到需要，在管饲前 17 小时。

从乌鸦围栏中取出食物，但不要取出水。将乌鸦随机分配到治疗组，并使用 2 英寸管饲针用 5 毫升新鲜解冻、正常或感染的小鼠脑匀浆对每只乌鸦进行口服灌胃。然后将乌鸦转移到单独的笼子中。

在灌胃后 4 小时收集并合并每个笼内的所有粪便。接下来，在带有玻璃珠的蓝色子弹匀浆器中将每只乌鸦的混合粪便匀浆，直到获得均匀的质地。然后取 500 微升混合物，用 9.5 毫升无菌 PBS 离心机将其稀释 1 至 20 倍，稀释后的粪便匀浆 15 分钟。

加入 1， 300 倍 G，然后将上清液转移至新管中。为了尽量减少继发性微生物感染的威胁，每毫升匀浆添加 1 个单位的青霉素和 1 微克链霉素。然后在 3000 MP ator 中以 70 的功率设置对样品进行 30 秒的超声处理，以破坏任何残留微生物的膜。

首先，将小鼠随机分配到此处显示的四组中的一组。第一组将接收受感染的乌鸦粪便。第二组将接收未感染的乌鸦粪便。

第 3 组将接收受感染的小鼠大脑，第 4 组将接收正常的小鼠大脑。然后对于 MN 第 1 组和第 2 组，抽取 1 毫升 scrapy 阳性或 scrapy 阴性乌鸦粪便。根据小鼠的组号使用 25 号针头匀浆。

然后用老鼠的背颈毛捣碎。用拇指和食指轻轻旋转，露出腹侧。抬高鼠标的后端，使其头部略低。

将针头插入皮肤 1 厘米，中线外侧 1 厘米，骶髂关节前方 1 至 2 厘米。然后稍微向后拉，将均质缓慢注入小鼠体腔。接下来，准备冷冻的小鼠脑匀浆，有和没有 scrappy，以注射到第 3 组和第 4 组的动物中。

首先用无菌 PBS 将 haws 原液混合物稀释 1 至 10。然后将 1 毫升稀释的 scrapy 阳性脑匀浆注射到第 3 组的小鼠中，将 1 毫升稀释的 scrapy 阴性脑匀浆注射到小鼠中。在第四组中。

每天监测小鼠，直到它们表现出小鼠刮擦的临床症状。临床症状可能包括脊柱后凸、共济失调、尾巴僵硬、缺乏梳理、消瘦和嗜睡。为我的六种临床症状中的每一种每天评分。

当可见迹象明显时。零等于没有可见的标志。1 等于中度，2 等于严重程度的体征。

当每个体征的每日总分达到大于或等于 8 连续 3 天或 365 天达到大于或等于 6 的一天时，对小鼠实施安乐死。接种后，在安乐死后立即收获大脑，并将其储存在零下 80 摄氏度。然后妥善处理尸体以确认杂乱无章的诊断。

解冻冷冻的小鼠大脑，并在带有玻璃珠的蓝色子弹均质器中单独匀浆，直到获得均匀的质地。接下来，通过将 109.39 微升 PBS 与 12.5 微升 500 毫摩尔 EDTA 混合（pH 值为 8）和 3.1 微升 50 微克/毫升蛋白酶 K 溶液，制备 125 微升蛋白酶 K 消化液。然后将 3 微升消化液加入 17 微升大脑中。匀 浆。

将样品在 45 摄氏度下在摇动加热块上孵育 30 分钟。孵育完成后，加入 8 μL SDS 页面上样缓冲液使消化液失活，并在 95 摄氏度下孵育样品 5 分钟。然后将样品加载到 12% SDS 页面上。

凝胶电泳蛋白质并将凝胶转印到 IMON PVDF 膜上 转印后，用 5% 脱脂牛奶的 PBS 溶液（0.2% 在 20 之间）封闭 PVDF 膜，并在室温下摇动 1 小时。然后用 borrow 224 和与辣根过氧化物酶偶联的 IPRP 单克隆抗体探测膜，在超级封闭中稀释 1 至 20， 000 个，并在孵育后在室温下岩石 1 小时。在 20% 之间的 PBS 中用 0.2% 冲洗膜 1 小时。

通过将膜与化学发光底物孵育 5 分钟来观察蛋白质。然后在 G 盒凝胶成像系统上对膜进行成像。通过临床小鼠刮擦体征的表现识别患病小鼠，并通过 Western 血液分析完成疾病确认。

正常的小鼠大脑均匀，没有 scrapy，在左边的两个泳道中显示，有和没有蛋白酶 K 的帮助，没有蛋白酶 K，可以看到三个弯曲。然而，由于正常蛋白质易受蛋白酶的影响，因此在第二泳道中看不到弯曲。泳道 3 显示了蛋白酶消化的 scrapy 阳性对照样品。

蛋白质的 n 和 c 末端丢失，蛋白酶会导致三个原始条带发生偏移。但是受感染的蛋白质无法像在正常大脑样本中那样被完全消化。右图显示了接种了来自杂乱无章的乌鸦粪便的小鼠的蛋白酶 K 消化的大脑，并确认了样品中存在朊病毒，因为条带未被消化。

观看此视频后，您将对如何记录传染性朊病毒物质通过乌鸦消化系统的通道有更深入的了解。然后用腹膜间小鼠生物测定法验证感染性。