利用单克隆抗体TG30和GCTM-2检测细胞表面抗原富集与清除人胚胎干细胞

本实验的总体目标是通过 TG30 和 GCTM-2 两种单克隆抗体对细胞表面抗原的结合特性，对人类胚胎干细胞亚群进行分选。首先将人类胚胎干细胞（hESC）培养物解离为单细胞悬液；第二步，使用单克隆抗体 TG30 和 GCTM-2 对 hESC 进行染色。

最后，通过荧光激活细胞分选法将细胞分离，并重新进行培养。最终，可通过流式细胞术和相差显微镜评估分选后细胞的集落形成能力。该技术相较于现有方法（如肉眼观察）的主要优势在于，它能够对大量细胞在单细胞水平上提供关于多能性的一个客观衡量指标，从而有助于将胚胎干细胞与已分化细胞分离开来。

该方法有助于回答多能性研究领域中的关键问题，例如培养条件的变化如何定量影响不同的人胚胎干细胞系和人诱导性多能干细胞系。今天演示该实验步骤的是我实验室的研究人员 George Zoe Hun Chi 和 Bay Wang。要制备Hess单细胞悬液，首先从两个含有培养的Hess细胞系的T75培养瓶中吸除Hess培养基。每个培养瓶用10毫升DPBS洗涤一次，然后在37摄氏度、5%CO2条件下，每个培养瓶加入3毫升三重E表达解离溶液进行孵育。

五分钟后，轻敲培养瓶侧面以使细胞脱落，然后在显微镜下确认细胞是否已完全脱离。接着，使用无菌的10毫升移液管向每个培养瓶中加入10毫升冷培养基。轻轻反复吹打贴壁的解离细胞数次，以获得以单细胞为主的悬液。

现在将单细胞悬液通过70微米细胞滤网收集到无菌的50毫升聚丙烯管中，用于染色Hes细胞表面抗原。首先，将约100,000个细胞用150微升培养基分装至六个对照用1.5毫升微量离心管中。接着，将对照管及剩余分选样品分别与目标一抗在终体积为200微升和约9毫升的培养基中孵育，培养基中需包含同型对照抗体。

将离心管水平放置在冰上，并在摇动平台上轻轻混匀30分钟。离心沉淀细胞后，弃去上清液，然后用20毫升冷培养基洗涤分选样品，对照样品则用200微升相同培养基洗涤。现在将分选样品在2.5毫升终体积的冷培养基中与适当的二抗孵育，对照样品则在200微升终体积的相同培养基中孵育；同时向相应的对照管中加入新配制的PE抗-US CD 90.2抗体。

再次将离心管置于摇床上，在冰上水平轻柔混匀30分钟。离心沉淀细胞后，将分选样品重悬于20毫升冷培养基中，对照组则重悬于200微升中，并用培养基洗涤细胞两次。将分选样品重悬于2至3毫升含碘化丙啶的冷培养基中，除未染色细胞外，各对照组均重悬于300微升相同培养基中。

然后将每份单个细胞悬液通过与5毫升聚苯乙烯圆底试管相连的35微米孔径滤网盖过滤，并离心试管，使滤网盖上残留的任何细胞悬液进入试管中。随后轻敲试管壁，重新悬浮每份单细胞悬液，并将细胞置于冰上。设置流式细胞仪进行TG30和GCTM-2的荧光激活细胞分选，使解离的Hess细胞悬液被设门为单细胞，以排除可能的细胞团块和双联体。

接下来，利用前向散射和侧向散射门去除可能存在的碎片，仅保留完整的细胞进行分选。然后根据碘化丙啶的表达情况排除非活细胞。通过阴性筛选，根据小鼠CD 90.2 pe的表达情况去除小鼠胚胎成纤维细胞或甲醇饲养细胞。

根据未染色细胞和同型对照的背景自发荧光，设定TG 30 G CTM双阴性门。随后，最终可将不含饲养层细胞的活体HESC组分进一步分选为TG 30阴性GCT M双阴性、TG 30低表达GCT M双低表达、TG 30中等表达GCT M双中等表达以及TG 30高表达GCTM双高表达亚群。设置流式细胞仪后，向两个5 mL聚苯乙烯圆底试管中各加入1 mL甲醇条件培养基，并置于冰上。

然后，分别从已分化的 TG30 阴性 GCTM2 阴性细胞亚群和多能性 TG30 高表达 GCTM2 高表达细胞亚群中各回收 400,000 个细胞。将收集管离心后，将每个细胞沉淀重悬于 1 毫升预先平衡的 MEF 条件培养基中。随后，将来自每个细胞亚群的 hESC 接种至预先平衡、MEF 密度为三分之一的 T75 培养瓶中，使用甲醇处理的条件培养基，在 37°C、5% CO₂ 条件下培养细胞，每日更换培养基，持续约两周。

多能性 TG30 高表达、GCTM-2 高表达细胞的培养物在培养一周后呈现类似人类干细胞的克隆形态，并在 9 至 11 天时达到约 80% 的汇合度。而 TG30 阴性、GCTM-2 阴性细胞的培养物则主要以类似成纤维细胞的单层细胞形式生长，并在 11 至 13 天时达到汇合状态。联合检测细胞表面抗原 TG30 与 GCTM-2 可以区分多能阶段以及早期人胚胎干细胞（hESC）不同分化阶段的多个细胞亚群，这一结果与既往报道一致，表现为这些亚群表达干细胞标志物及谱系特异性转录因子。如本研究所采用的人胚胎干细胞男性 1 号细胞系所示，TG30 阴性、GCTM-2 阴性、低表达、中表达及高表达的不同亚群可被有效区分。本实验展示了 TG30 与 GCTM-2 流式细胞术分析中典型的不同设门亚群所占百分比。

分选后，将确定数量的TG30阴性GCTM2阴性细胞连续培养约两周，然后重新分选，仅收集TG30阴性GCTM2阴性细胞亚群，再进行传代培养。每次传代结果表明，初始的TG30阴性GCTM2阴性亚群在连续传代培养后富集了TG30阴性GCTM2阴性分化细胞。在初次传代时可检测到少量TG30高表达GCTM2高表达细胞，但随着进一步传代培养，这些细胞最终消失，仅留下无多能干细胞的样本。

此处显示的是分化后的 TG30 阴性 GCTM2 阴性细胞在培养 14 天后的典型菌苔形态。请注意，在培养 14 天后，可见零星分布的类似人胚胎干细胞（HESC）的克隆，它们与 TG30 阴性 GCTM2 阴性细胞混合存在，这些克隆很可能来源于污染的 TG30 高表达 GCTM2 高表达细胞。但需注意，这种情况极为罕见；根据此前使用该检测方法的观察结果，在初次传代后，分离和培养 TG30 高表达 GCTM2 高表达细胞有望富集具有克隆形成能力的多能性 HSCs。

因此，在这些代表性培养物中，也研究了通过流式细胞术分选后的多能性TG 30高表达、GCTM-2高表达细胞的连续传代情况；细胞使用TG 30和GCTM-2进行分选，每次传代仅保留TG 30高表达、GCTM-2高表达的细胞。通过这种方式观察到，大部分细胞位于与多能性相关的亚群中，表明获得了富集的多能性细胞群体，这些细胞仍具有分化能力，并可再生出少量TG 30阴性、GCTM-2阴性的细胞。此外，连续传代的TG 30高表达、GCTM-2高表达分选细胞在传代后表现出大量类似人胚胎干细胞（hESC）的克隆，也进一步说明其多能性状态得以维持。

在进行该实验操作时，重要的是每次使用前均需校准传真机，以确保按照此实验流程获得结果的可重复性。在该技术建立后，还可采用其他方法（如微阵列、全基因组测序或畸胎瘤形成实验）来回答诸如“这些细胞是否真正具有多能性”等问题。该技术为诱导性多能干细胞领域的研究人员提供了基础，使其能够比较诱导性多能干细胞与人胚胎干细胞在安全性和稳定性方面的差异。

观看本视频后，您应能够充分理解如何仔细制备和染色人胚胎干细胞的混合培养物，以富集壁细胞。请务必注意，操作人源细胞可能具有极高危险性，在进行本实验操作时，必须始终采取相应预防措施，例如佩戴手套并在二级生物安全柜内操作。