利用共培养检测化学介导的种间相互作用

以下实验的总体目标是鉴定由分泌化合物介导并导致细菌基因表达变化的不同微生物之间的相互作用。该目标通过在琼脂培养皿上将含有荧光转录报告系统的细菌菌株与环境微生物以菌落形式共培养来实现。橙色圆圈代表环境微生物的菌落。

蓝色圆圈代表报告菌的菌落，而在固体培养基上的生长使得这些菌落产生的代谢物能够扩散通过琼脂，从而激活邻近报告菌菌落的基因表达。此处用星号标记的潜在阳性菌落，可能是分泌了能够改变报告菌基因表达的化合物的菌株。这些微生物是从共培养筛选平板上分离得到的。

这些潜在的诱导物将在二次筛选中重新测试，以确认它们确实是分泌能够改变报告菌中细菌基因表达分子的生物体。尽管该方法可揭示枯草芽孢杆菌与土壤生物之间在生物膜形成方面的相互作用，但也可应用于其他系统，例如影响金黄色葡萄球菌或假单胞菌属物种毒力表达的微生物相互作用。事实上，理论上该方法可用于鉴定任何遗传上可操作的微生物中，能够改变任意报告系统的基因表达的微生物相互作用。在根据文本方案构建目标生物的荧光报告载体后，用刮勺刮去暴露地表最上层0.5厘米的土壤，并收集土壤至锥形管中；按每1克土壤加入10毫升0.85%无菌生理盐水的比例制备土壤悬液，并涡旋震荡1分钟，使细菌从土壤颗粒上脱离。

静置土壤悬液1分钟后，将上层水相转移至新的离心管中，按照文本方案稀释报告菌和土壤样品，并将各50微升点样到共培养筛选平板的中心位置，点样条件应确保不会单独激活报告菌构建体。同时分别点样土壤样品单独组和报告菌单独组作为对照。在每个平板中加入约23毫米的无菌玻璃珠，通过将平板置于实验台面上并前后摇动来均匀分散细胞。

一边旋转直至液体被吸收，一边将平板翻转，并将珠子丢弃至含有乙醇的废液杯中。将共培养平板在荧光条件下孵育后，从平板顶部开始，缓慢地将平板在视野中来回移动，以寻找明亮的斑点。完成一次完整的扫描后，将平板旋转90度，并重复该过程。

当检测到荧光点时，缓慢打开明场照明，判断荧光是否与细菌菌落相关联。为分离潜在的诱导生物体（即位于荧光菌落附近且无荧光的菌落），将其置于视野中央，并确保位于你惯用手可触及的位置，同时保持荧光灯开启。

缓慢打开明场光源，根据形状和位置识别荧光菌落及周围诱导生物体。用玻璃棒取一支无菌的200微升凝胶上样枪头，像握笔一样握住。将手掌外侧靠在载物台上，以稳定工作台面上的操作。然后将另一只手放在持握工具的手的内侧拇指一侧，以稳定挑取工具，同时保持枪头位于培养皿表面之上。

将其移入视野范围内，并对准您要挑选的菌落上方居中。此时提示将失焦。使用手掌外侧缓慢地将移液器吸头向下旋转，直至接触待挑选的菌落。

轻轻触碰，尽量减少枪头接触到的其他菌落数量，且不要旋转挑取工具。将枪头在新鲜培养皿的一个区域上划线。挑取菌落后，根据实验方案的指导进行培养。

当菌落可见时，使用体视显微镜判断平板上生长的是单一类型还是多种类型的生物体。将每种形态型菌落转接划线至新的平板，并培养至菌落生长。为验证假定的诱导物是否为真正的诱导物，需制备报告菌株和非荧光亲本菌株的菌苔。待平板干燥后，用无菌牙签挑取待测菌落的细胞。

将菌落点种到空白平板上，然后点种到两个涂布好的平板上。或者，将疑似诱导菌株重悬于1毫升液体培养基中，置于无菌塑料离心管内，调整各菌悬液的光密度使其归一化，使每个菌悬液的OD600达到0.5，随后取1微升每种菌悬液点种到三个平板上。最后，在菌株生长一段时间后，利用体视显微镜下观察荧光信号，鉴定能够激活荧光报告菌株但不能激活亲本对照菌株的疑似诱导菌株。

此处的筛选方法用于鉴定能够分泌化合物的土壤微生物，这些化合物可改变枯草芽孢杆菌生物膜基质中结构组分基因表达，检测依赖于荧光转录报告系统。理想情况下，每个共培养平板中报告菌株与土壤菌落的比例应为1:1，且两者为彼此靠近的独立菌落。本文图示说明，当报告菌落（以蓝色圆圈表示）相对于土壤菌落（以棕色圆圈表示）的比例较高时，可提高从共培养平板中精确定位实际诱导微生物的可信度。

诱导性土壤生物分泌的化合物会激活报告菌。在报告菌与土壤比例较高的培养皿中，多个报告菌落将被诱导产生，从而有助于从以星号标示的其他潜在诱导物中识别出真正的诱导物（以红色显示）。营养成分控制菌落生长的程度，而接种物的稀释度则决定所形成的菌落是否分布适当。

如该共培养图像所示，菌株B在响应土壤中多种微生物时，会生成荧光生物膜基质。在我们检测的土壤样本中，Ptap A YFP基质报告系统的阳性检出率较高。这与我们尚未发表的类似筛选结果形成对比。

使用孢子形成和感受态报告系统时，仅发现极少或没有阳性克隆。因此，不同细胞类型的高频诱导率（HI rates）具有高度变异性，可能难以提前预测。此处展示的是共培养筛选平板在挑取潜在诱导菌落进行分离前后的两个示例。

此处展示了贴片法和点样法的阴性与阳性结果，在我们的二次筛选中，约有50%的菌落为真实阳性。在完成本实验流程后，可进一步采用其他方法回答更多问题，例如通过16S rRNA基因测序确定诱导生物的系统发育身份，或利用高效液相色谱-质谱联用及核磁共振技术确定活性化合物的化学结构。