使用视频分析系统对小鼠进行情境与线索性恐惧条件反射测试

情境性恐惧条件反射测试是一种行为学测试，被广泛用于评估劳伦斯（Lawrence）的学习能力，即记住攻击性经历与环境线索之间关联的能力。然而，该测试在不同工作场所之间存在一些方法学上的差异，这可能导致数据比较困难以及结果难以重复。

为了获得更稳定且有效的数据，尽可能标准化测试方案至关重要。本文中，我们演示了现场测试的方案。恐惧功能测试是一种简单、敏感且可靠的评估记忆能力的方法。

该实验常用于研究学习与记忆背后的神经及分子机制，同时也用于评估精神疾病小鼠模型（如创伤后应激障碍和精神分裂症）的认知功能。在该实验中，面对行为作为学习与记忆的指标，通常由人工观察者进行评分，但也存在一些可自动分析面对行为的自动化系统。我们开发了一种基于图像FG和图像A的软件程序的图像分析系统。

我们正在分发此类软件程序，可在以下地址免费下载。本文将介绍我们的测试方案及自动化分析系统。首先，我们将展示如何安全地安装该应用程序，并附上软件程序的界面示意图。

其次，我们演示该测试的详细方案，包括使用该系统进行的条件环境测试和设备的Q测试。最后，我们展示结果，表明N图像FD系统能够产生高度可靠的结果。现在，让我们开始。

从快速的恐惧条件反射测试开始。将一只小鼠放入带有格栅地板的实验箱中。OID 作为听觉刺激呈现。

呈现听觉队列30秒。随后给予一次电击。该听觉队列与足底电击的配对重复三次，以增强听觉队列与电击之间的关联。

在测试过程中，通过测量小鼠的僵直行为来评估其关联学习和恐惧记忆。其次，在24小时后，将小鼠再次放入相同的条件化实验箱中，并记录其僵直行为。为了测量情境性条件恐惧，随后将小鼠转移至形状不同的G箱中，且不给予任何听觉线索，之后再呈现听觉线索。

在此实验中，以冻结行为作为急性恐惧记忆的指标。测试过程中，通过连接到计算机的摄像头记录小鼠的行为，根据行为表现判断为冻结或非冻结状态。

通过图像软件程序，该程序可计算冻结时间百分比和移动距离。以下示例展示了测试过程中的图像分析。实时图像以每秒一帧的速率进行采集。

图像通过程序对每对图像中的每个实时图像创建二值图像。随着连续帧的处理，程序计算小鼠移动所经过的面积。当该面积低于某个阈值时，行为被判定为僵直（freezing），通常定义为除呼吸外几乎没有任何运动的状态。

持续时间短于预设时间阈值的僵直行为不被判定为僵直。该阈值必须预先设定，以使图像Z所测得的僵直时间与人工观察结果之间达到最佳吻合。当活动面积等于或大于阈值或X三Z时，该行为被视为非僵直行为。

在此，我们通过该视频分析系统在小鼠中演示了我们的测试方案。在本方案中，操作人员将小鼠置于一个带有金属网格的方格状实验箱内，并用透明盖板覆盖。FD 能够在每帧捕获的视频图像中区分深色物体与白色背景。

但此过程使我们能够分析实验对象的僵直行为，需要将实验箱放置在白色地板上，以便分析黑色或毛色较深的小鼠的行为。铝制小鼠的僵直行为也可通过使用黑色金属网格的图像D进行分析。在黑色规则下，发光二极管灯安装在装置上方的帆布上，LED灯以100勒克斯的光照强度照亮网格区域。

一个与白噪声音调发生器相连的扬声器安装在盖子上方的桅杆上。以55分贝的白噪声作为听觉提示。网格通过导线连接至电击发生器，以传递电刺激足部电击。

在启动测试前，电击风测试设定为0.3百万对。应使用金属检查电网上的电流强度，因为铁和小鼠尿液的积聚可能会降低电击测试的效果。测试室被放置在隔音罩内，以尽量减少外部噪音。测试期间，上诉实验所在的房间声音环境与进行趋近和情境测试的房间不同。

其结构包含一个与制凝室具有不同特性的腔室。为了提供一个正常的环境，有必要尽可能改变感觉编码，使小鼠将诺贝尔环境感知为与制凝室无关。在本方案中，装置是一个带有平坦丙烯酸尺和透明铅板的丙烯酸三角形腔室。

一个扬声器安装在引导装置上方的帆上，用于呈现一个或三个提示音。该提示音与之前提供给小鼠的提示音相同。地面的照度设置为研究所需的光照水平。

每个腔室均为一个立方体，内部装有带帆的电荷舱和用于监测小鼠行为的设备摄像头。每次测试开始前，需用超纯高电阻水浸湿的抹布擦拭亚克力墙壁和地板，并用70%乙醇清洁栅格。为避免基于嗅觉线索产生偏差，使用乙醇而非超纯高电阻水擦拭栅格，以确保栅格不会因前两到四只小鼠残留物而影响其电导率。小鼠饲养包置于温度受控的饲养室内，以减少运输过程中可能对行为造成的影响，并使小鼠适应实验环境。

在每次实验开始前至少30分钟，将装有小鼠的笼子转移至隔音的等候室。所有实验应在相同的时间段内进行，以尽量减少因在不同时间测试而引起的行为差异。每组小鼠应以交叉平衡的顺序进行测试，以降低实验时间可能带来的影响。

在行为表现测试顺序中，图像D可同时控制最多四台小鼠测试设备，以便研究人员节省时间，并减少实验操作对小鼠行为潜在影响的干扰。在开始下一轮测试前，运行A FD应用程序软件，选择插件菜单中的FD相关选项和FD在线选项，并按以下步骤设置参数值。

第一步，指定用于存储文件数据的文件夹的项目编号。第二步，输入会话名称。会话框中的任意文字为实验日期，以及指向文件的参考文本，该参考文本中包含白噪声和食物刺激的开始时间及持续时间。

必须在图像中的对照文件夹内预先准备好用于比对的文本文件。第三步：参数设置。输入持续时间、时间以及冻结标准等参数值，具体如视频中所示。

第四步，受试者编号。输入受试者的识别信息。第五步，相机设置，调整所捕获图像的亮度和对比度。

第六步，阈值设置。首先，为了测量连续图像中颗粒移动的距离，需调整程序的阈值主值，该值用于将图像分割为黑色颗粒和白色背景。通过连续图像中颗粒重心的XY坐标，计算每组坐标之间的距离，从而得到移动距离。

除了根据连续图像中动物的行为进行主要判断外，还需假设程序的一个额外参数值，该参数用于将图像分割为背景下的黑色颗粒，并计算连续图像对之间颗粒非重叠区域的面积大小，以显示在特定连续图像采集时间窗口内的非重叠区域变化。变化表达意味着当小鼠表现出行为活动时，该非重叠区域的数值应低于设定的阈值（ING cry值）。这些参数值应进行调整，使得基于图像分析所得的数据与人工观察结果相匹配。

第七步，设置捕获区域：在工具栏中点击矩形按钮，围绕活体图像窗口中腔室的底部绘制矩形，以指定要捕获的区域。接着选择目标腔室并点击“设置”按钮，最后点击“完成”按钮。

在设定好参数后，应在当天首次测试前使用练习用小鼠进行预备测试，以确认图像分析系统和噪声刺激发生器是否正常工作。将装有练习用小鼠的组合笼从等候暗室移至相邻的声音测试暗室，并在将每只小鼠放入条件化舱室后，立即点击图像Z的开始按钮。允许小鼠在舱室内自由探索120秒。随后，给予30秒的白噪声作为听觉线索，在声音的最后2秒对小鼠施加足底电击。该过程在一次实验会话中重复三次，以加强线索与足底电击之间的关联。

在最后一次配对后，将面罩留在实验箱中90秒，以进一步建立实验箱环境与被动体验之间的关联。480秒结束后，将小鼠放回饲养笼中，再将笼子放回饲养室的架子上。

每次测试后，仔细清洁小室和网格。然后点击下一个分析按钮，并在测试小鼠中重复该实验过程。在相关操作约24小时后，将小鼠笼转移至隔音等候室。

每次测试开始前，至少将样品在保持装置中放置 30 分钟。拍摄长图像，并以与调节过程中相同的方式设置软件参数。然而，将持续时间设置为 300 秒，并为上下文测试选择 35 条文本保存至文件。

35 秒时文本文件为空。将鼠标移入条件化实验箱并点击开始按钮。让小鼠在无任何刺激呈现的情况下充分探索实验箱 300 秒。

300 秒后，将小鼠放回其饲养笼中，并清洁实验舱室。然后点击下一个分析按钮，对测试小鼠的长时图像 D 重复上述操作，并以与之前相同的方式设置参数值。这是本实验的参考文本文件，将持续时间设置为 360 秒。这是本实验的参考文本文件。

将每只小鼠放入三角形实验箱中，然后点击图像Z的开始按钮。在最初三分钟内，让所有小鼠自由探索实验箱，期间不给予白噪声刺激或足底电击。该实验箱具有不同的环境特征，可提供一种新的情境，与之前的实验箱环境有所区别。

在此环境中，小鼠通常需要大量活动，且不应表现出僵直行为。在前3分钟结束时，向小鼠呈现来自Concho的白噪声，持续3分钟。在听觉刺激呈现期间，观察小鼠是否在360秒后出现刻板行为。一旦观察到该行为，立即将小鼠放回其饲养笼中，并将笼子放回饲养室的架子上。

测试结束后，仔细清洁实验舱。然后点击下一个分析按钮，并使用测试小鼠重复该步骤。本视频显示，系统图像分析所测得的僵直时间与人工观察者测量的结果更为接近。

该观察结果通过细节得到证实，这些细节显示，通过图像物理测量的每次测试中的僵直百分比与人类观察者给出的评分高度相关。此外，该图表明，人类观察所测得的僵直百分比与图像系统所测结果之间的差异最小。这些结果表明，图像系统所测得的僵直百分比与人类观察所得结果相似，且通过图像Z测量僵直程度的准确性较高。好的。

您觉得如何？正如您所看到的，标准的行为学分析可以轻松完成。在使用该系统的图像时，有一些技巧和需要注意的重要事项，让我来请教一下ika。好的。

首先，您对本系统的图像测试流程有何感受？我认为我们的测试流程非常简便，系统图像是一种能够准确且快速测量推理能力和行为的有用工具。任何人只要经过前期培训，都可以轻松使用该软件程序。因此，该系统可在短时间内完成对记忆能力的评估，并支持长达数月的持续监测，这将为我们节省大量时间和后续工作。

我明白了。那么我们在进行测试时有什么需要特别注意的吗？是的，操作者指出，获得最清晰的图像以精确测量行为非常重要，因此您应调整相机长度以及下方的书写内容。

在该实验方案研究中，您需要仔细设定性状数值和判断标准，以确定某种行为是否可被认定为具有特定原因。重要的是，结果应是即时的，该程序需结合人为观察进行考量，如本研究结果所示。如您所见，本文提供了有关测试流程及软件程序使用的详细信息。

我们希望本文能够增进您对检测方法的理解，并有助于该实验方案的标准化。