一种适用于高通量筛选的基于FRET的平台，用于肉毒杆菌神经毒素轻链调节剂的鉴定与表征

本实验的总体目标是筛选能够抑制肉毒杆菌神经毒素轻链的小分子化合物。首先，需以高准确度和精密度配制化合物的稀释系列。第二步是将化合物稀释液转移至黑色96孔板中。

随后将稀释的轻链酶加入到孔板中，并在室温下与化合物孵育五分钟。最后一步是加入轻链FRET底物以启动反应，通过荧光酶标仪监测反应过程。最终，应采用使用非荧光肽底物的二次筛选实验来确认化合物的活性，并测定更为严格的动力学常数，例如抑制剂解离常数（ki）。

与现有的 HPLC 分析法或细胞分析法相比，该检测方法的主要优势在于操作简便、易于自动化，并可用于比较多种化合物的相对效价。初学者在制备化合物稀释系列以及在加入所有组分后对培养板进行充分混匀时可能会遇到困难。开始本实验前，需按照文本方案中的描述准备好缓冲液和试剂。

将酶标仪设置为在室温下以中等速度振板10秒，然后以动力学模式每5分钟监测一次荧光，激发波长为490纳米，发射波长为523纳米，持续监测1小时30分钟。确定化合物浓度范围后，用相应的化合物名称和浓度标记试管，并向所有试管中加入Eloqua、100%二甲基亚砜（DMSO），以准备进行化合物系列稀释。接下来，为标准的1至3倍稀释系列制备化合物的梯度稀释液。

在稀释系列的第一支试管中，加入2微升未稀释的化合物至4微升DMSO中，并用新的移液枪头充分混匀。从第一次稀释液中取出2微升，加入第二支试管的4微升DMSO中，充分混匀。对后续各次稀释步骤重复此操作。

务必充分混匀化合物稀释液，以确保化合物浓度准确。盖好化合物管并置于室温下备用。取平底、不透明黑色96孔板，按照文本方案中推荐的板式设置进行操作。

手动将每种化合物稀释液各取一微升，直接加入第1至第9孔的每个对应孔底部；向第11孔加入一微升待测化合物的最高浓度溶液，作为化合物自身荧光对照。该对照用于确定化合物本身是否具有荧光，或是否影响底物的水解。

使用自动移液器，向第12号孔中手动加入1 µL已知的强效抑制剂作为阳性对照，向第10号孔中加入1 µL 100% DMSO作为阴性对照；向第1至10号及第12号孔的侧壁加入79 µL检测缓冲液，向第11号孔的侧壁加入89 µL检测缓冲液。

注意不要将枪头接触到含有化合物的孔底，以避免孔间交叉污染。将稀释后的轻链酶涡旋混匀，并使用自动移液器向除第11孔外的每孔侧壁加入10 µL酶液。轻轻敲击酶标板，确保加入的酶液全部流至孔底，轻柔混匀后盖上盖板膜，室温孵育5分钟。

该孵育步骤可使化合物在与轻链结合前达到预平衡状态。在加入底物之前，轻轻涡旋混匀肉毒杆菌神经毒素A轻链底物。然后使用自动移液器，将10 µL底物沿每孔侧壁加入。

务必在酶先前加入位置的对侧孔壁加入底物。轻轻敲击酶标板以立即混匀试剂。将酶标板放入荧光酶标仪中，并启动先前已设置好的程序。

程序结束后，通过绘制相对荧光单位随时间变化的曲线，并计算反应线性期内曲线的斜率，来确定酶反应速度。按照文本方案中所述，准备进行自动化操作以实现高通量筛选。本视频将演示高通量筛选方案的部分内容，由本实验室的博士后 de young 负责展示。他将演示如何使用实验室自动化设备将化合物转移至微孔板中进行高通量筛选，在向检测板中加入稀释后的肉毒神经毒素轻链酶后进行操作。

在液体处理平台指定化合物板、检测板以及清洗液容器的放置区域。编程控制液体处理设备，将化合物板和检测板移至指定位置，并在点样前移除板盖。校准点样程序软件，确保点样针浸入液体中但不触碰检测板底部。

将50纳升化合物直接点样到含有8微升肉毒杆菌神经毒素A轻链的检测板中。每次点样后，将点样针浸入DMSO中清洗，然后在吸水纸上干燥，并依次用异丙醇和甲醇重复此清洗过程。

最后，在化合物用酶点样到检测板后，将针头放在风扇下吹干。分别将化合物库存板和检测板叠放，并用盖子盖住叠放的检测板最上层，以防止蒸发，然后置于一旁。确保轻链与化合物在室温下孵育至少五分钟。

在点样大量酶标板时，可使用较长的孵育时间。最后，将底物加入检测板中，并按照文本方案所述测量荧光信号。无论以低通量还是高通量方式开展基于FRET的肉毒杆菌神经毒素A轻链检测，当肉毒杆菌神经毒素A轻链与底物共同孵育时，随时间推移均应观察到荧光信号的增加。

如果测试了某种化合物的系列稀释液，则通常会得到一系列斜率不同的直线。此处，基于羟基的化合物的终浓度以微摩尔（µM）为单位列出。在本实验板布局中，第10孔作为阴性对照，仅加入溶剂。

该反应的速率被定义为100%酶活性，含有化合物时的反应速率可相对于此值进行归一化，以获得相对速率或抑制百分率。当使用化合物的系列稀释液进行检测时，可通过绘制反应速率相对于抑制剂浓度的曲线图来确定半数最大抑制浓度（IC 50）。应选择适当的稀释范围，使曲线呈S形，以实现最佳的曲线拟合。

IC50 值是一种相对效力度量，最好被描述为表观 KI 值，因为它取决于测定中所用酶的浓度。该值可用于比较和排序若干化合物的效力（若已进行测试）。同时，在加入每个组分后对孔板进行充分混匀至关重要，以获得随时间平滑线性增加的荧光信号，这是准确测定初始反应速率所必需的。

该图显示了一个混合不充分的代表性实验，产物生成速率随时间不呈线性。掌握该技术后，可在不到两小时内完成多达八种化合物的实验，从而避免数据解读的干扰。本实验完成后，可使用非荧光性肽类底物进行其他检测，以确认化合物是否抑制肉毒杆菌神经毒素轻链及其体细胞活性。

观看本视频后，您应能充分理解如何测定肉毒杆菌神经毒素轻链抑制剂的相对效价。该实验方案共分为三个步骤：第一步，制备化合物稀释系列。

其次，加入重组轻链酶；第三，加入荧光底物，并在荧光酶标仪上进行后续检测。