Name: 用于鉴定和表征肉毒杆菌神经毒素轻链调节剂的高通量兼容 FRET 平台 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: 了解如何使用基于FRET的高通量筛选平台鉴定肉毒杆菌神经毒素A轻链抑制剂。该方法通过荧光板读数仪监测酶活性，帮助研究人员快速评估化合物效力和动力学常数。

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本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助（项目编号：AI082190，授予 T.J.D.）以及加州再生医学研究所（项目编号：TB1-01186 和 CL1-00502）提供支持。

手动筛选或 IC50 测定
本方案可用于通过配制化合物的系列稀释液来测定其相对效价（IC50值），或在单一浓度下手动筛选小分子抑制剂。
1. 缓冲液与试剂的配制&#160;以及所需仪器设备
<ol>
	<li>配制50 ml&#160;检测缓冲液（40 mM HEPES，pH 7.4，含0.01% Tween-20），过滤除菌。该缓冲液可在室温（RT）下保存数月。</li>
	<li>用检测缓冲液配制70 nM的工作浓度重组肉毒杆菌神经毒素/A轻链（LC/A (1-425)）17溶液，轻轻涡旋混匀后置于冰上保存。每种化合物的测试至少需要120 μl的LC/A工作液。</li>
	<li>在检测缓冲液中配制含10% DMSO的7 μM基于FRET的BoNT/A LC底物工作液。先将底物的5 mM储备液用适量100% DMSO稀释，然后在轻柔搅拌下缓慢（逐滴）加入检测缓冲液。用铝箔包裹后置于冰上保存。每种化合物的测试至少需要130 μl的底物工作液。</li>
	<li>将荧光酶标仪设置为在室温下以中等速度振板10秒，随后每隔5分钟监测一次荧光信号（动力学模式），激发波长和发射波长分别为490 nm和523 nm，持续90分钟。请注意，在此期间产物生成（即&#160;荧光信号的增加）呈线性关系（图1A）。</li>
</ol>
2. 化合物稀释系列的制备
<ol>
	<li>确定化合物浓度范围（即&#160;稀释系列中的稀释次数和稀释倍数；浓度范围根据预期的IC50 值，以确保获得最佳的曲线拟合。对于抑制浓度未知的化合物50使用未稀释的化合物原液作为最高浓度。</li>
	<li>用相应的化合物名称和浓度标记试管。</li>
	<li>将100% DMSO分装至所有试管中，以备进行化合物系列稀释。每管至少2 μl&#160;建议的终末稀释体积为每孔加入1 μl各浓度样品。例如，标准1:3稀释系列需在每管中加入2 μl化合物与4 μl DMSO混合。</li>
	<li>配制化合物的系列稀释液，每次稀释之间需充分涡旋或手动混匀，并在每次稀释时更换移液器吸头。对于标准的1:3稀释系列，取2 μl未稀释的化合物加入至稀释系列第一管中含4 μl DMSO的溶液，充分混匀。使用新的移液器吸头，吸取2 μl第一稀释液加入至第二管含4 μl DMSO的溶液中，充分混匀。重复上述步骤完成后续各稀释液的配制。务必充分混匀各化合物稀释液，以确保化合物浓度准确。</li>
	<li>盖上化合物管，室温放置。</li>
</ol>
3. 培养板制备与点样（表1）
<ol>
	<li>取一个平底、不透明的黑色96孔板。参见表1中推荐的板式设置，其中每种化合物的稀释系列在96孔板中按行排列。手动将相应化合物稀释液各1 μl直接加入对应孔的底部（第1–9孔）。将待测化合物的最高浓度溶液1 μl加入第11孔（化合物本底荧光对照）。</li>
	<li>手动向第12孔加入1 μl已知的强效抑制剂（阳性对照），向第10孔加入1 μl 100% DMSO（阴性对照）。</li>
	<li>使用自动移液器，向第1–10孔和第12孔（化合物稀释孔和阳性对照孔）的孔壁侧面各加入79 μl检测缓冲液，向第11孔（化合物本底荧光对照孔）的孔壁侧面加入89 μl。注意不要让吸头接触孔底已加有化合物的位置&#160;，以免造成孔间交叉污染。&#160;</li>
	<li>涡旋混匀LC/A工作稀释液，使用自动移液器向除第11孔（化合物本底荧光对照孔）外的每个孔的孔壁侧面加入10 μl。轻轻敲击板子，确保所有加入的酶液均流至孔底。</li>
	<li>轻轻&#160;混匀，盖上盖板，&#160;室温孵育5分钟。此孵育步骤可使化合物在加入底物前与LC/A充分结合，达到预平衡状态。</li>
</ol>
4. 底物添加与荧光检测
<ol>
	<li>轻轻涡旋混匀 BoNT/A LC 底物，使用自动移液器将 10 μl 底物加入每个孔的另一侧。注意将底物加至之前加入酶的孔壁对侧。</li>
	<li>轻敲酶标板以混匀试剂，立即放入酶标仪中，并按照步骤 1.4 中先前设定的参数开始荧光检测。</li>
	<li>酶反应速率通过绘制反应线性期内相对荧光单位（RFU）随时间变化曲线的斜率计算得出。</li>
</ol>
表1.&#160;推荐的检测板布局。
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<th>孔号</th>
			<th>孔描述</th>
			<th>化合物</th>
			<th>检测缓冲液</th>
			<th>底物</th>
			<th>LC</th>
			<th>DMSO</th>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>化合物剂量 1</td>
			<td>1 μl</td>
			<td>79 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>10 μl&#160;</td>
			<td>---</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>化合物剂量 2</td>
			<td>1 μl</td>
			<td>79 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>---</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>化合物剂量 3</td>
			<td>1 μl</td>
			<td>79 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>---</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>化合物剂量 4</td>
			<td>1 μl</td>
			<td>79 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>---</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>化合物剂量 5</td>
			<td>1 μl</td>
			<td>79 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>---</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>化合物剂量 6</td>
			<td>1 μl</td>
			<td>79 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>---</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td>化合物剂量 7</td>
			<td>1 μl</td>
			<td>79 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>---</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8</td>
			<td>化合物剂量 8</td>
			<td>1 μl</td>
			<td>79 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>---</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9</td>
			<td>化合物剂量 9</td>
			<td>1 μl</td>
			<td>79 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>---</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td>阴性对照 
			（100% LC 活性）</td>
			<td>---</td>
			<td>79 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>1 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11</td>
			<td>化合物自身荧光对照</td>
			<td>1 μl</td>
			<td>89 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>---</td>
			<td>---</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12</td>
			<td>阳性对照 
			（0% LC 活性）</td>
			<td>1 μl</td>
			<td>79 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>---</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
高通量筛选的自动化操作
5. 缓冲液、试剂、化合物板、条形码及所需仪器的准备
<ol>
	<li>将密封的化合物储备板在室温下解冻至少 1 小时。</li>
	<li>配制 500 ml（或根据待筛选化合物数量配制更多）检测缓冲液（40 mM HEPES，pH 7.4，含 0.01% Tween-20），过滤除菌。过滤后的检测缓冲液可在室温下保存数月。</li>
	<li>用检测缓冲液配制 8.75 nM 的重组 BoNT/A LC（1-425）工作稀释液，涡旋混匀后置于冰上保存。每块低容量 384 孔板的每个孔需要 8 μl。每块低容量 384 孔板需额外准备 10–15% 的量，约 3.7 ml。</li>
	<li>用含 10% DMSO 的检测缓冲液配制 3.5 μM 的基于 FRET 的 BoNT/A LC 底物工作稀释液。首先将底物的 5 mM 储备液直接溶于适量 100% DMSO 中，然后在轻柔搅拌下缓慢（逐滴）加入检测缓冲液。用铝箔包裹后置于冰上保存。每块低容量 384 孔板的每个孔需要 2 μl。每块低容量 384 孔板需额外准备 10–15% 的量，约 1 ml。</li>
	<li>为每块黑色低容量 384 孔微孔板（检测板）准备条形码，并将标签直接粘贴在条形码扫描仪可读取的板侧；确保标签不&#160;超出板边缘，以免影响自动化操作中的板处理和堆叠。将微孔板按编号顺序堆叠并放置一旁，顶部微孔板需加盖保护。请注意，此步骤为可选，但在使用多块板时有助于将检测结果与相应化合物对应。</li>
	<li>将已解冻的密封化合物储备板在室温下以 200 × g 离心 30 秒。小心移除密封膜，确保清除所有残留胶粘物，并用干净的塑料盖盖住微孔板以防止蒸发。请注意，若板表面残留胶粘物，可能干扰自动化移盖和板堆叠操作。将盖好的微孔板放入连接至液体处理系统的孵育位中。切勿使微孔板长时间暴露，以免发生蒸发。</li>
	<li>设置堆叠式荧光微孔板读板仪，在室温下以每 30 分钟一次的频率（动力学模式）连续读取每块检测板的荧光信号，激发波长为 490 nm，发射波长为 523 nm，共读取 3–6 个循环。</li>
</ol>
6. 针具的制备
<ol>
	<li>目视检查384头针工具是否存在任何异常，包括变形、开裂或大块残留物。</li>
	<li>准备三个独立的托盘，分别加入约1英寸深的100%甲醇（HPLC级）、100%异丙醇（HPLC级）以及用超纯水稀释的针具清洗液。</li>
	<li>将液体处理设备上的清洗站加入100% DMSO。</li>
	<li>在托盘中叠放2至3张洁净、全新的吸水纸。重要的是要在Z轴方向校准机器人，使针头能够接触到吸水纸但不刺穿。</li>
	<li>在工作区域安装风扇附件，用于清洗后干燥针头。</li>
	<li>将针具安装至液体处理设备的机械臂上，并通过以下步骤进行预清洗：浸入DMSO中，于吸水纸上干燥，再在清洗液中浸泡2分钟&#160;，于吸水纸上干燥，浸入异丙醇中，于吸水纸上干燥，浸入甲醇中，于吸水纸上干燥，最后通过风扇吹干。</li>
</ol>
7. 低体积液体分配器的制备
<ol>
	<li>将低体积（1-10 μl）加样盒连接至液体分配仪，并将废液管连接至适当的废液容器。</li>
	<li>目视检查加样盒的分配喷嘴，确认其无变形、撕裂或堵塞。保持通道和喷嘴清洁至关重要，因为沉淀物或碎屑会影响液体分配。</li>
	<li>通过向废液容器中依次加入30 ml超纯水、30 ml 70%乙醇，再加入30 ml超纯水，对通道进行预冲洗。</li>
	<li>将低体积384孔检测板放入液体分配仪中，并向每孔加入已知体积的水。目视检查以确保每孔均接收到正确体积的液体，且孔间无液体溢出或错加现象。</li>
	<li>用空气对管路吹扫约5秒，以去除残留水分并干燥通道。</li>
</ol>
8. 将BoNT/A轻链分配至检测板
<ol>
	<li>将液体分配器的吸液管浸入BoNT/A LC工作溶液中，进行引液以排除空气，然后向384孔低体积检测板的每孔中分配8 μl。注意：可手动将板放置在液体处理系统的操作区域，也可使用连接的板架实现自动定位和重叠堆叠。</li>
	<li>用干净的塑料盖盖好每块板，并将其堆叠在连接于液体处理系统上的板架的不同列中。切勿使板未密封放置，否则会导致蒸发。</li>
	<li>通过将30 ml&#160;超纯水、30 ml&#160;70%乙醇以及再次30 ml&#160;超纯水直接排入废液容器，清洗液体分配器。</li>
	<li>用空气对管路进行约5秒的引液，以干燥通道。</li>
</ol>
9. 将化合物 Stamp 至检测板
<ol>
	<li>在液体处理平台指定区域放置化合物板、检测板以及盛有清洗液的容器。</li>
	<li>编程液体处理设备，将化合物板和检测板放置于指定位置，并在点样前移除板盖。</li>
	<li>将50 nl&#160;化合物直接点样至含有8 μl BoNT/A LC的检测板中。校准点样程序时，确保点样针浸入液体，但不刮擦检测板底部。需注意，以100% DMSO加入化合物可能会在扩散过程中形成局部酶变性区域。因此，应通过比较仅含DMSO的对照组与未处理对照组（i.e.&#160;未添加DMSO的酶）来评估酶变性程度。</li>
	<li>每处理一块板后，依次将点样针浸入DMSO、在吸水纸上干燥、浸入异丙醇、在吸水纸上干燥、浸入甲醇、在吸水纸上再次干燥，最后通过风扇吹干。</li>
	<li>化合物点样至含酶的检测板后，分别叠放母液化合物板和检测板。用盖子覆盖堆叠的最上层检测板以防止蒸发，并置于一旁。确保LC与化合物在室温下孵育至少5分钟；若需处理大量板，可适当延长孵育时间。</li>
</ol>
10. 将底物加入检测板
<ol>
	<li>将液体处理仪的进液管浸入肉毒杆菌神经毒素A型轻链（BoNT/A LC）底物工作液中，并避光保存。检查分配喷嘴，确保其干燥且无堵塞。对通道进行预冲洗，以去除所有气泡。</li>
	<li>将检测板拆开，向每孔中加入2 μl底物工作稀释液。检查底物是否准确分配至各孔中。加样后将检测板叠放，并在最上层检测板上方和最下层检测板下方各放置一个空的检测板，以防止在酶标仪读数及重新堆叠过程中发生蒸发。</li>
</ol>
11. 荧光测量
<ol>
	<li>立即将检测板堆叠放入荧光酶标仪中。</li>
	<li>按照步骤5.7中预先设定的参数开始荧光测定。每种化合物的检测速率由以下图形计算得出： &#160;随时间变化的相对荧光单位（RFU）。需要注意的是，应包含阴性对照（DMSO）以获得未受抑制的反应速率；也可在每块板中加入已知抑制剂作为阳性对照。下图显示的是单个时间点的代表性结果。 图2.</li>
</ol>
12. 清理工作
<ol>
	<li>使用压辊将每块化合物储备板用铝箔密封，并在 -80 °C 下保存。</li>
	<li>每次检测板读数完成后，将检测板以及任何剩余的LC/A或底物稀释液作为生物危害废物丢弃。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述基于FRET的BoNT/A轻链（LC）检测方法是一种用于发现和表征可调节BoNT/A LC活性小分子的优良手段。该检测方法基于溶液体系，因此适用于本实验方案“自动化操作”部分所述的高通量筛选（HTS）。Z因子常用于评估一种检测方法是否适用于HTS项目18。Z因子的计算公式为 Z = 1 – 3 (σp + σn)/(μp - μn)，其中Z值为1时最为理想，0.5至1之间为优秀，低于0.5则为勉强可用。本文所述HTS方案的Z因子为0.89（阳性与阴性对照的标准差分别为 σp = 6.67 RFU/min 和 σn = 0.788 RFU/min；阴性与阳性对照的平均反应速率分别为 μp = 196.1 RFU/min 和 μn = -7.67 RFU/min），表明该检测方法非常适用于高通量筛选。
该检测在最终体积中可耐受高达2%的DMSO，不会显著降低检测信号或影响酶的功能。先...

肉毒杆菌神经毒素A型（BoNT/A）是目前已知最强的毒素（LD50 ~1 ng/kg）1，由细菌Clostridium botulinum产生，是一种强效神经毒素。在受感染的宿主体内，BoNT/A通过结合运动神经元、内化进入细胞质，并最终切割对乙酰胆碱胞吐作用至关重要的神经元蛋白，从而破坏神经肌肉接头处的神经传导。一旦进入神经元，BoNT/A可在体内持续数月之久2。乙酰胆碱释放的长期抑制会阻碍正常的肌肉收缩，导致弛缓性麻痹，在严重情况下，可能引发心脏和/或呼吸衰竭。由于其极高的毒性、易于生产以及在宿主体内的长期作用，美国疾病控制与预防中心（CDC）已将所有BoNT血清型列为高风险生物恐怖主义制剂。
该毒素的作用机制涉及多个步骤，包括与神经元表面受体结合、通过受体介导的内吞作用进入细胞，以及转位至神经元胞质溶胶。BoNT/A 由两条链组成，即重链和轻链，两条链均对毒性至关重要。重链（HC）包含结合域和转位域，而轻链（LC）是一种依赖锌的金属蛋白酶，可从内体转位至细胞质。一旦进入胞质溶胶，LC/A 金属蛋白酶会定位于内侧胞质膜，并切割膜结合的宿主蛋白 SNAP-25。SNAP-25 属于 SNARE（可溶性 N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体）蛋白家族，该家族在乙酰胆碱外排过程中发挥关键作用（参见参考文献3）。LC/A 对 SNAP-25 的切割会损害 SNARE 复合物的功能，从而抑制乙酰胆碱神经递质的释放，并阻碍肌肉收缩。
目前，肉毒中毒的治疗手段有限，通常包括给予马源中和抗体4；然而，由于该毒素会迅速被神经元内化，抗体的给药时间窗口非常狭窄。因此，许多研究人员认为，BoNT/A 轻链（LC）可能是更理想的治疗靶点。由于 LC 是一种依赖锌离子的金属蛋白酶，抑制 LC/A 活性的一种策略是开发能够螯合活性位点锌离子的化合物。例如，羟肟酸类化合物可螯合活性位点的锌离子，并表现出优异的抑制效果 体外 效价（Ki 迄今为止最好的BoNT/A LC小分子抑制剂的IC50为77 nM5然而，许多小分子由于各种问题而未能推进成为治疗药物 离体 或 体内，包括水溶性差、代谢迅速和/或细胞毒性高。因此，需要开发具有更优药理学和药代动力学特性的新化合物。小分子化合物的筛选通常涉及高通量筛选（HTS），以鉴定新颖的骨架结构。早期针对BoNT/A LC活性的筛选方法基于高效液相色谱法（HPLC）检测短肽底物的切割，该方法耗时较长，且不适用于高通量筛选应用6-8随后，Schmidt 及其同事9 开发了一种高通量的BoNT/A LC活性检测方法，该方法利用共价连接到微孔板上的荧光素标记肽底物。BoNT/A LC可切割该底物并释放荧光素，释放的荧光素可通过荧光计进行定量。该检测方法的微孔板形式可实现对大量化合物的同步筛选；然而，该方法需要对合成肽进行荧光素标记，并将衍生化的底物分子包被至检测板上，这些步骤较为繁琐。随后，Schmidt报道了一种更为简便的方法，可用于在低浓度下检测BoNT/A LC的活性 等，其中使用一系列荧光底物实时监测 BoNT LC 活性10文献中描述的其他技术包括基于共振能量转移的去极化检测法，用于检测和定量粗提物中肉毒神经毒素（BoNT）的活性；该方法适用于高通量应用。10,11，尽管该方法需要复杂的设备来检测荧光共振能量转移（FRET）和偏振信号。最后，已有多种基于细胞的肉毒神经毒素（BoNT）中毒模型被报道（详见参考文献）11）使研究人员能够研究前述化合物常具有的限制性特性，包括细胞毒性、细胞通透性和稳定性。然而，大多数现有的基于细胞的检测方法并不适用于高通量筛选（HTS），且耗时耗力。
本文介绍了一种高通量筛选（HTS）方法的详细实验方案，该方法利用 commercially available 的基于荧光共振能量转移（FRET）的肉毒神经毒素A型轻链（BoNT/A LC）底物。该底物基于SNAP-25的切割序列，是一种合成的13聚肽，其末端带有荧光团和淬灭基团。BoNT/A对底物的切割会使荧光团与淬灭基团分离，从而消除FRET效应，并导致检测到的荧光信号增强，该信号可在荧光酶标仪中持续测定。本实验方法已被我们实验室及其他多个实验室常规用于发现新型BoNT/A LC抑制剂，或评估已知化合物的相对抑制活性5,12-15。由于该方法操作简便、易于自动化、试剂成本低，并可同时筛选大量化合物，因此适用于高通量筛选（参见参考文献16；Caglič et al.，已投稿；Bompiani&#160;et al.，正在准备中）。除用于高通量筛选外，本实验还可通过测定化合物的IC50值（即抑制50% BoNT/A LC活性所需的浓度）来比较不同化合物的相对活性。该实验既可在96孔板中手动操作（见《实验方案》中的“手动筛选”部分），也可在384孔板中实现自动化操作以进行高通量筛选（见《实验方案》中的“自动化操作”部分）。

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>Teknova</td><td>H1021</td><td></td></tr><tr><td>吐温-20</td><td>菲舍尔科技</td><td>BP337-100</td><td></td></tr><tr><td>甲醇（HPLC级）</td><td>西格玛-奥德里奇</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇（HPLC级）</td><td>西格玛-奥德里奇</td><td>650447</td><td></td></tr><tr><td>96孔黑色检测板</td><td>康宁</td><td>3915</td><td></td></tr><tr><td>384孔低体积黑色检测板</td><td>格瑞纳</td><td>788076</td><td></td></tr><tr><td>SNAPtide FITC/Dabcyl 底物</td><td>List 生物实验室</td><td>521</td><td>基于FRET的肉毒杆菌神经毒素A型轻链底物</td></tr><tr><td>针头清洁液</td><td>V&amp;P 科学公司</td><td>VP 110</td><td></td></tr><tr><td>无尘擦拭纸</td><td>V&amp;P 科学公司</td><td>VP 540DB</td><td></td></tr><tr><td>Biomek 密封盖和样品用铝箔盖</td><td>贝克曼库尔特</td><td>538619</td><td></td></tr></tbody></table>

一种适用于高通量筛选的基于fret的平台，用于肉毒杆菌神经毒素轻链调节剂的鉴定与表征

A High-throughput-compatible FRET-based Platform for Identification and Characterization of Botulinum Neurotoxin Light Chain Modulators

肉毒神经毒素（BoNT）是一种强效且可能致命的细菌毒素，可结合宿主运动神经元，被细胞内化，并切割细胞内对神经递质释放至关重要的蛋白质。BoNT由一条重链（HC）和一条轻链（LC）组成：重链介导宿主细胞的结合与内化，轻链则切割细胞内对乙酰胆碱释放至关重要的宿主蛋白。尽管抑制毒素结合或内化的疗法给药时间窗较窄，但靶向细胞内LC活性的化合物具有更宽的给药时间窗，这一点尤其重要，因为该毒素的半衰期极长。近年来，小分子因其相对于大分子治疗剂（如肽类、适配体、 等等。）。先导化合物的鉴定通常涉及高通量筛选（HTS），即基于大量小分子化合物库对治疗靶点功能的调节能力进行筛选。本文描述了一种基于FRET的检测方法，该方法采用商业化的BoNT/A轻链（LC）底物和重组LC蛋白，可实现对潜在BoNT抑制剂的高通量筛选自动化。此外，我们还介绍了一种手动操作的技术，可用于后续的二次筛选，或用于比较多个候选化合物的抑制效力。

基于FRET的BoNT/A轻链（LC）检测可手动以低通量方式进行，用于表征已知抑制剂或筛选小型化合物库；或者，该方案也可缩小规模并实现自动化，以便利用大型化合物库进行高通量筛选（HTS），旨在发现新的BoNT/A LC抑制剂。无论采用何种方法，当BoNT/A LC与底物共同孵育时，随时间推移应观察到荧光信号的增加（图1A展示了荧光随时间变化的代表性曲线）。若对化合物进行系列稀释测试，则通常会得到一系列斜率不同的曲线（图1B）。本实验板布局中的第10孔作为阴性对照，仅加入溶剂（DMSO）；该反应速率被定义为“100%酶活性”（即未抑制活性），其他含化合物孔的反应速率可据此进行归一化处理，以获得相对速率或抑制百分比。第11孔（化合物自身荧光对照）和第12孔（阳性对照）应呈现水平曲线（即斜率接近于0）。
当使用化合物的系列稀释液进行测定时，可通过绘制反应速率（测定斜率）与抑制剂浓度的关系图来确定IC50 (图1C）。稀释范围应选择得当，以使曲线呈现...

A型肉毒神经毒素轻链（BoNT/A LC）是一种金属蛋白酶，可进入运动神经元，切割其底物SNAP-25，破坏神经递质传递，从而导致弛缓性麻痹。利用与高通量筛选兼容的基于荧光共振能量转移（FRET）的检测方法，可对大量小分子化合物库进行筛选，评估其对BoNT/A LC酶活性的影响。

一种适用于高通量筛选的基于FRET的平台，用于肉毒杆菌神经毒素轻链调节剂的鉴定与表征

肉毒杆菌神经毒素（BoNT）是一种强效且可能致命的细菌毒素，可结合宿主运动神经元，被细胞内化，并……

本实验的总体目标是筛选能够抑制肉毒杆菌神经毒素轻链的小分子化合物。首先，需以高准确度和精密度配制化合物的稀释系列。第二步是将化合物稀释液转移至黑色96孔板中。随后将稀释的轻链酶加入到孔板中，并在室温下与化合物孵育五分钟。最后一步是加入轻链FRET底物以启动反应，通过荧光酶标仪监测反应过程。最终，应采用使用非荧光肽底物的二次筛选实验来确认化合物的活性，并测定更为严格的动力学常数，例如抑制剂解离常数（ki）。与现有的 HPLC 分析法或细胞分析法相比，该检测方法的主要优势在于操作简便、易于自动化，并可用于比较多种化合物的相对效价。初学者在制备化合物稀释系列以及在加入所有组分后对培养板进行充分混匀时可能会遇到困难。开始本实验前，需按照文本方案中的描述准备好缓冲液和试剂。将酶标仪设置为在室温下以中等速度振板10秒，然后以动力学模式每5分钟监测一次荧光，激发波长为490纳米，发射波长为523纳米，持续监测1小时30分钟。确定化合物浓度范围后，用相应的化合物名称和浓度标记试管，并向所有试管中加入Eloqua、100%二甲基亚砜（DMSO），以准备进行化合物系列稀释。接下来，为标准的1至3倍稀释系列制备化合物的梯度稀释液。在稀释系列的第一支试管中，加入2微升未稀释的化合物至4微升DMSO中，并用新的移液枪头充分混匀。从第一次稀释液中取出2微升，加入第二支试管的4微升DMSO中，充分混匀。对后续各次稀释步骤重复此操作。务必充分混匀化合物稀释液，以确保化合物浓度准确。盖好化合物管并置于室温下备用。取平底、不透明黑色96孔板，按照文本方案中推荐的板式设置进行操作。手动将每种化合物稀释液各取一微升，直接加入第1至第9孔的每个对应孔底部；向第11孔加入一微升待测化合物的最高浓度溶液，作为化合物自身荧光对照。该对照用于确定化合物本身是否具有荧光，或是否影响底物的水解。使用自动移液器，向第12号孔中手动加入1 µL已知的强效抑制剂作为阳性对照，向第10号孔中加入1 µL 100% DMSO作为阴性对照；向第1至10号及第12号孔的侧壁加入79 µL检测缓冲液，向第11号孔的侧壁加入89 µL检测缓冲液。注意不要将枪头接触到含有化合物的孔底，以避免孔间交叉污染。将稀释后的轻链酶涡旋混匀，并使用自动移液器向除第11孔外的每孔侧壁加入10 µL酶液。轻轻敲击酶标板，确保加入的酶液全部流至孔底，轻柔混匀后盖上盖板膜，室温孵育5分钟。 该孵育步骤可使化合物在与轻链结合前达到预平衡状态。在加入底物之前，轻轻涡旋混匀肉毒杆菌神经毒素A轻链底物。然后使用自动移液器，将10 µL底物沿每孔侧壁加入。务必在酶先前加入位置的对侧孔壁加入底物。轻轻敲击酶标板以立即混匀试剂。将酶标板放入荧光酶标仪中，并启动先前已设置好的程序。程序结束后，通过绘制相对荧光单位随时间变化的曲线，并计算反应线性期内曲线的斜率，来确定酶反应速度。按照文本方案中所述，准备进行自动化操作以实现高通量筛选。本视频将演示高通量筛选方案的部分内容，由本实验室的博士后 de young 负责展示。他将演示如何使用实验室自动化设备将化合物转移至微孔板中进行高通量筛选，在向检测板中加入稀释后的肉毒神经毒素轻链酶后进行操作。在液体处理平台指定化合物板、检测板以及清洗液容器的放置区域。编程控制液体处理设备，将化合物板和检测板移至指定位置，并在点样前移除板盖。校准点样程序软件，确保点样针浸入液体中但不触碰检测板底部。将50纳升化合物直接点样到含有8微升肉毒杆菌神经毒素A轻链的检测板中。每次点样后，将点样针浸入DMSO中清洗，然后在吸水纸上干燥，并依次用异丙醇和甲醇重复此清洗过程。最后，在化合物用酶点样到检测板后，将针头放在风扇下吹干。分别将化合物库存板和检测板叠放，并用盖子盖住叠放的检测板最上层，以防止蒸发，然后置于一旁。确保轻链与化合物在室温下孵育至少五分钟。在点样大量酶标板时，可使用较长的孵育时间。最后，将底物加入检测板中，并按照文本方案所述测量荧光信号。无论以低通量还是高通量方式开展基于FRET的肉毒杆菌神经毒素A轻链检测，当肉毒杆菌神经毒素A轻链与底物共同孵育时，随时间推移均应观察到荧光信号的增加。如果测试了某种化合物的系列稀释液，则通常会得到一系列斜率不同的直线。此处，基于羟基的化合物的终浓度以微摩尔（µM）为单位列出。在本实验板布局中，第10孔作为阴性对照，仅加入溶剂。该反应的速率被定义为100%酶活性，含有化合物时的反应速率可相对于此值进行归一化，以获得相对速率或抑制百分率。当使用化合物的系列稀释液进行检测时，可通过绘制反应速率相对于抑制剂浓度的曲线图来确定半数最大抑制浓度（IC 50）。应选择适当的稀释范围，使曲线呈S形，以实现最佳的曲线拟合。IC50 值是一种相对效力度量，最好被描述为表观 KI 值，因为它取决于测定中所用酶的浓度。该值可用于比较和排序若干化合物的效力（若已进行测试）。同时，在加入每个组分后对孔板进行充分混匀至关重要，以获得随时间平滑线性增加的荧光信号，这是准确测定初始反应速率所必需的。该图显示了一个混合不充分的代表性实验，产物生成速率随时间不呈线性。掌握该技术后，可在不到两小时内完成多达八种化合物的实验，从而避免数据解读的干扰。本实验完成后，可使用非荧光性肽类底物进行其他检测，以确认化合物是否抑制肉毒杆菌神经毒素轻链及其体细胞活性。观看本视频后，您应能充分理解如何测定肉毒杆菌神经毒素轻链抑制剂的相对效价。该实验方案共分为三个步骤：第一步，制备化合物稀释系列。其次，加入重组轻链酶；第三，加入荧光底物，并在荧光酶标仪上进行后续检测。

a-high-throughput-compatible-fret-based-platform-for-identification

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