MACS纯化光感受器前体细胞的亚视移植到成年小鼠视网膜中
2014年2月22日
细胞移植是治疗视网膜退化的一种策略，其特征是光感受器丧失。在这里，我们描述了一种丰富可移植光感受器及其亚视移植到成年小鼠的方法。
以下实验的总体目标是将富集的感光细胞前体细胞移植到受体小鼠视网膜中。这是通过首先分离年轻供体动物的视网膜眼来实现的。在第二步中，通过基于 CD 73 的磁性相关细胞分选从视网膜细胞群中分离出生后感光细胞前体细胞。
接下来，将光感受器前体移植到受体动物的视网膜下间隙，以促进它们整合到受体视网膜中。最终，可以通过免疫荧光显微镜分析移植的光感受器前体细胞的整合潜力和行为。这种方法可以帮助回答视网膜再生领域的关键问题，例如移植的光感受器整合到宿主神经回路中以恢复视力的能力如何。
这项技术的影响超出了视网膜退行性疾病的治疗。一旦 max 安装和富集感光器前体可以很容易地适应 GMP 条件，这种方法的视觉演示就至关重要 由于移植步骤很难学习，因此针头在视网膜下空间的微妙处理和放置对于确保最大成功和可重复性至关重要 分离视网膜。首先用 70% 乙醇短暂冲洗产后第 4 天幼崽的头部，然后进行 A PBS 洗涤。
然后将头部转移到冷 HBSS 中，为每只眼睛的眼睛成核。首先，睁开眼睑。然后使用一对弯曲的镊子。
抓住视神经区域的器官，小心地将眼睛从眼眶中拉出。接下来要隔离视网膜，将一把闭合剪刀的尖端插入视神经并打开刀片。剥去视网膜色素、上皮、脉络膜，用弯曲的镊子去除晶状体和淹没血管。
将分离的视网膜在含有木瓜蛋白酶溶液的 1.5 毫升反应管中，在摇床中以 400 RPM 和 37 摄氏度孵育 30 至 60 分钟。当视网膜孵育时，将 1 毫升 OVO moid 溶液分配到 15 毫升反应管中，标记 1，然后分配到 2 毫升反应管中，标记 2,60 微升 DNA，1 60 微升 OVO MOID 溶液和 520 微升 EBSS。孵育后，将含有部分消化的视网膜的木瓜蛋白酶溶液转移到反应管 2 中，然后用火抛光移液管将视网膜迭代 10 次。
将单细胞悬液轻轻铺在反应管 1 中的 OVO MOID 溶液上，并在 300 Gs 和室温下离心细胞溶液 5 分钟。然后弃去上清液，将细胞重悬于 500 μL max 缓冲液中。要按最大值排序，首先将细胞置于每毫升 10 μg 大鼠抗 CD 73 抗体的冰上孵育。
5 分钟后，在 10 mL 最大缓冲液中洗涤细胞。然后将沉淀重悬于 480 μL 最大缓冲液中，并在冰上孵育细胞在 120 μL go anti RET IgG 微珠中，不要搅动、摇晃或混合。15 分钟后，在洗涤过程中用 5 mL max 缓冲液洗涤细胞，将 LS 柱放在 max 磁力架上，并在柱顶部放置预分离过滤器。
接下来，用 3 mL 最大缓冲液水合过滤器和色谱柱。将缓冲液收集在标有 W 的 15 毫升试管中进行洗涤。当细胞完成旋转后，将沉淀重新悬浮在 500 μL 的最大缓冲液中，然后将细胞卸载到过滤器中。
在细胞顶部添加 1 mL max 缓冲液，然后将阴性馏分收集在 15 mL 反应管中，标记为阴性。接下来，向色谱柱中加入 3 ml max 缓冲液 3 次以洗涤。现在从磁力架上取下色谱柱。
将其安装在标有 plus for positive 的 15 ml 反应管上。并快速将 5 mL 最大缓冲液加载到色谱柱中。将所有缓冲液浸入色谱柱中，然后在旋转正馏分后，将沉淀重新悬浮在 500 μL 的最大缓冲液中。
将细胞置于 4 摄氏度并计数。然后在最大缓冲液中将浓度调整为每微升 10 至第五个细胞的两倍，将细胞保持在 4 摄氏度以移植分离的感光器前体细胞在瞳孔扩张时用一滴苯基左通风热带细胞扩张镇静成年小鼠的瞳孔。使用金刚石笔将盖玻片切成大约 5 x 5 毫米的小块。
将鼠标置于立体显微镜下，将动物束缚在小鼠头架中，然后在每只眼睛上滴一滴 ICIC 凝胶以防止干燥。现在用一根 30 号半英寸的针头在巩膜和角膜之间的边界打一个小孔。然后将 5 x 5 毫米的盖玻片之一放在角膜顶部，以便直接观察视网膜。
接下来，用无菌去离子水冲洗预灭菌的微升注射器数次，然后将一种分选的细胞悬液加载到注射器中。将针头对角线穿过结膜和巩膜，将其放置在视网膜的鼻半部。然后轻轻地穿过视网膜打一个孔到视网膜下间隙并注射细胞。
确认视网膜的大疱性均匀脱离，应覆盖大约四分之一的视网膜空间，无任何出血。然后轻轻取出注射器，并用离子水再冲洗几次。最后，将鼠标从限制器中释放出来。
用盐酸aamaz 油注射动物以逆转麻醉的作用，并使其在 25 摄氏度的黑暗室中恢复，以评估杆状光感受器整合到小鼠视网膜中的能力。使用了小鼠报告基因系，其中 GFP 由神经视网膜丢失拉链或 NRL 启动子驱动，如这些直方图所示。初始视网膜细胞悬液含有 30.4%GFP 阳性杆状光感受器。
在基于 CD 73 的 CD 73 阳性部分之后，在 CD 73 阴性部分的 CD 73 阳性部分观察到高达 86.9% 的 GFP 阳性感光器前体细胞的最大分选和富集。只有 9.9% 的细胞对 GFP 呈阳性。还观察到基于 CD 73 的 max 后 N-R-L-G-F-P 阳性细胞的富集。
在体外接种后，供体细胞保留在大疱性脱离宿主视网膜定义的注射部位，并整合到宿主视网膜的外核层中，获得成熟光感受器的形态。一旦掌握磁性相关细胞分选，如果正确，可在两小时内进行。做。该程序也适用于干细胞衍生的光感受器甚至其他视网膜干细胞的富集。
鉴于特异性抗体的可用性来回答有关视网膜细胞嬗变修复或挽救的其他问题。看完这个视频，你应该对如何移植有了很好的了解。Photo max 富集了受体小鼠的视网膜下空间的感光器前体细胞。
查看完整文字稿并访问数千部科学视频
概述
本研究提出了一种将富集的光感受器前体细胞移植到受体小鼠视网膜中的方法。该方法旨在促进这些细胞与宿主视网膜的整合，从而可能有助于视力恢复。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 视网膜再生
- 细胞移植
背景
- 视网膜退化通常导致光感受器丧失。
- 细胞移植是一种有前景的治疗策略。
- 了解移植细胞的整合对视力恢复至关重要。
- 免疫荧光显微镜可分析移植后的细胞行为。
研究目的
- 从供体视网膜中分离和富集光感受器前体细胞。
- 将这些细胞移植到受体小鼠的视网膜下腔。
- 评估移植细胞在宿主视网膜中的整合潜力。
使用的方法
- 从年轻的供体动物中分离视网膜。
- 基于CD 73的磁性相关细胞分选用于细胞富集。
- 光感受器前体细胞的视网膜下移植。
- 免疫荧光显微镜用于分析整合。
主要结果
- 成功分离光感受器前体细胞。
- 有效地将其移植到受体视网膜中。
- 通过显微镜观察到移植细胞的整合。
- 展示了恢复视力的潜力。
结论
- 富集的光感受器前体细胞移植是可行的。
- 整合到宿主视网膜电路中是可能的。
- 这种方法可能推动视网膜再生研究的进展。
常见问题
Executive Industry Relevance
Efficient enrichment and transplantation of photoreceptor precursor cells addresses a critical bottleneck in regenerative ophthalmology, enabling precise evaluation of cell integration and functional restoration in preclinical models. The use of MACS for cell sorting based on CD73 surface markers supports scalable, GMP-adaptable workflows, directly impacting translational readiness for cell-based therapies. This approach enhances predictive confidence in cell replacement strategies and informs risk-adjusted portfolio decisions for retinal disease programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of photoreceptor integration capacity in adult retinal tissue.
- Supports biological de-risking by isolating functional precursor populations.
- Facilitates mechanistic studies of cell-host neural circuitry integration.
- Provides quantitative benchmarks for target cell enrichment and delivery.
Screening & Assay Development
- Establishes validated cell populations for downstream transplantation assays.
- Improves reproducibility and standardization of cell-based integration studies.
- Enables quantitative assessment of integration rates post-transplantation.
- Supports scalable preparation of cell suspensions for high-throughput screening.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models of retinal degeneration for translational continuity.
- Enables preclinical evaluation of cell therapy integration and maturation.
- Supports risk-adjusted advancement of cell-based therapeutic candidates.
- Provides a platform for testing stem cell-derived photoreceptor populations.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early discovery and preclinical validation by enabling robust enrichment, transplantation, and integration analysis of photoreceptor precursors in adult mouse models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on cell integration and neural circuit restoration.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts of integration efficiency.
- Analytics: Provides immunofluorescence-based measurements for comparative analysis.
- Translational Research: Facilitates continuity from in vitro enrichment to in vivo functional assessment.
- Enterprise Reuse: Adaptable for other retinal cell types and scalable for broader regenerative applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in cell integration and functional restoration.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of cell sorting and transplantation.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions for cell therapy programs targeting retinal diseases.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of regenerative medicine assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in retinal dissection, cell sorting, and microsurgical transplantation.
- Demands access to MACS instrumentation and immunofluorescence analytics.
- Necessitates rigorous cross-team standardization for reproducibility.
- Adaptable to stem cell-derived or alternative retinal precursor populations.
- Dependent on availability of validated surface markers and antibodies.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:33
Retina Dissociation
3:21
Cell Sorting Using Magnetic Associated Cell Sorting (MACS)
5:07
Transplantation of MAC-sorted Photoreceptor Precursor Cells Into the Mouse Retina
6:39
Results: Donor GFP+ Rod Photoreceptor Integration Into the Host Retina
7:42
Conclusion
