Name: MACS纯化光感受器前体细胞的亚视移植到成年小鼠视网膜中 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: 学习使用MACS技术纯化光感受器前体细胞并进行亚视网膜移植的方法。本研究展示如何通过CD73磁珠分选富集细胞，将其移植到成年小鼠视网膜中，利用免疫荧光显微镜分析细胞整合情况，为视网膜再生和视力恢复研究提供重要技术支持。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们感谢 Anand Swaroop 提供 Nrl-GFP 小鼠，感谢 Jochen Haas 提供技术支持，感谢 Sindy Böhme 和 Emely Lessmann 在动物饲养方面的工作。	
	本工作由德国研究基金会（DFG）：FZT 111 - 德累斯顿再生疗法中心、CRTD 种子基金项目、SFB 655 项目、ProRetina e.V. 基金会、德累斯顿 DIGS-BB 研究生项目以及葡萄牙科技基金会（SFRH/BD/60787/2009）资助。

动物使用与护理的伦理声明：
所有动物实验均严格遵循欧盟和德国法律（Tierschutzgesetz）以及ARVO关于在眼科与视觉研究中使用动物的声明。所有动物实验均获得德累斯顿工业大学动物伦理委员会和德累斯顿地方管理局的批准（批准编号：24D-9168.11-1/2008-33）。
1. 细胞解离与细胞分选前的准备
<ol>
	<li>标记三个15 ml离心管，分别标注为：洗涤组（W）、阳性组（+）和阴性组（-）。</li>
</ol>
2. 视网膜解离
<ol>
	<li>使用剪刀将出生4天的小鼠幼崽断头。</li>
	<li>将幼崽头部在70%乙醇中短暂冲洗，随后用PBS洗涤。</li>
	<li>将头部转移至冷HBSS中并摘除眼球（对所有头部重复此步骤）。摘除时打开眼睑，用弯头镊子夹住视神经区域固定眼球，然后小心地将眼球从眼眶中拉出。</li>
	<li>在所有眼球摘除后，分离视网膜：将闭合的剪刀插入视神经处，然后打开剪刀刀片。剥离视网膜色素上皮（RPE）/脉络膜组织。使用弯头镊子去除晶状体和血管。</li>
	<li>将分离出的视网膜转移至含有木瓜蛋白酶溶液（来自木瓜蛋白酶解离试剂盒）的1.5 ml离心管中。</li>
	<li>将视网膜在37 °C水浴或摇床（400 rpm）中孵育30–60分钟。
		<ol>
			<li>在视网膜孵育于木瓜蛋白酶溶液期间，用移液器将1 ml卵黏蛋白溶液加入15 ml离心管中（标记为“1”）。</li>
			<li>向另一15 ml离心管中加入60 µl DNase I（10 mg/ml）+ 60 µl 卵黏蛋白溶液（来自试剂盒）+ 520 µl EBSS（标记为“2”）。</li>
		</ol>
	</li>
	<li>木瓜蛋白酶孵育结束后，将含有部分消化视网膜的木瓜蛋白酶溶液转移至离心管“2”中。</li>
	<li>使用火焰抛光的移液管进行机械解离（上下吹打10次）。</li>
	<li>将单细胞悬液转移至离心管“1”中。通过轻轻将细胞悬液叠加在卵黏蛋白溶液上方，尽量形成两层液体。</li>
	<li>以&#160;300 x g（约&#160;1,300 rpm）离心5分钟。</li>
	<li>弃去上清液，将细胞重悬于500 µl MACS缓冲液中。</li>
</ol>
3. 使用磁性相关细胞分选（MACS）进行细胞分选
<ol>
	<li>加入 X μl 大鼠抗 CD73 抗体至 500 µl 样品中，以达到终浓度为 10 μg/ml。</li>
	<li>冰上孵育 5 分钟。</li>
	<li>用 MACS 缓冲液将 15 ml 反应管补至 10 ml，以 300 × g 的速度离心 5 分钟。</li>
	<li>弃去上清液。</li>
	<li>将沉淀重悬于 480 μl MACS 缓冲液中，并加入 120 μl 羊抗大鼠 IgG 磁珠。</li>
	<li>冰上孵育 15 分钟；期间不得振荡、摇动或混合。</li>
	<li>用 MACS 缓冲液将 15 ml 反应管补至 5 ml，以 300 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>在反应管离心过程中：
		<ol>
			<li>将 LS 柱安装至磁力架上。</li>
			<li>将预分离滤器置于 LS 柱顶部。</li>
			<li>用 3 ml MACS 缓冲液润洗预分离滤器和 LS 柱，并将流出的 MACS 缓冲液收集至洗涤（W）管中。</li>
		</ol>
	</li>
	<li>弃去上清液。</li>
	<li>将沉淀重悬于 500 μl MACS 缓冲液中。</li>
	<li>将 500 μl 细胞悬液上样至滤器，随后向滤器中加入 1 ml MACS 缓冲液，并将未结合的细胞（阴性组分）收集至阴性组分（-）反应管中。</li>
	<li>接着，向柱中分三次加入共 3 × 3 ml MACS 缓冲液，以洗去未结合在柱上的细胞。</li>
	<li>当这 9 ml 洗液完全通过 LS 柱后，将柱从磁力架上取下，并安装至阳性组分（+）反应管上方。</li>
	<li>迅速向 LS 柱中加入 5 ml MACS 缓冲液，并将推杆插入 LS 柱中，向下推动直至全部缓冲液通过柱体。</li>
	<li>将含有阳性组分的反应管以 300 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，将沉淀重悬于 500 µl MACS 缓冲液中，并置于 4 °C 保存。</li>
	<li>使用常规细胞计数设备对细胞总数进行计数。</li>
	<li>用 MACS 缓冲液制备阳性分选组分的细胞悬液，浓度为 2 × 105 个细胞/μl，并置于 4 °C 保存。</li>
</ol>
4. 将经MAC分选的光感受器前体细胞移植到小鼠视网膜中
<ol>
	<li>确保准备好以下所有溶液：1 ml 无菌 PBS 或 HBSS，10 µl DNA酶I，1–2 ml 无菌去离子 H2O，以及在 4 °C 下保存的细胞悬液分装样品。</li>
	<li>通过腹腔注射盐酸美托咪啶（0.01 mg/10 g 体重）和氯胺酮（0.75 mg/10 g 体重）对成年小鼠（i.e.&#160;2–4 月龄）进行麻醉。随后皮下注射布托啡诺（0.05 mg/kg 体重）以缓解疼痛。</li>
	<li>滴加一滴去氧肾上腺素 2.5%-托吡卡胺 0.5% 溶液以扩大瞳孔。</li>
	<li>将小鼠固定在小鼠头部固定装置上，并置于体视显微镜下。</li>
	<li>滴加一滴维西迪克凝胶以防止眼球干燥。</li>
	<li>使用无菌 30 G ½ 英寸&#160;针头在巩膜与角膜交界处（即锯齿缘 ora serrata）刺一个小孔。</li>
	<li>使用金刚石笔将普通盖玻片切割成小块（约&#160;5 mm × 5 mm），取其中一块置于角膜上，以便直接观察视网膜。</li>
	<li>用去离子水反复冲洗预灭菌的微量注射器数次。</li>
	<li>用微量注射器吸取 1 µl 细胞悬液，将针头沿结膜和巩膜切线方向穿入，并在视觉控制下将其置于视网膜鼻侧半部。</li>
	<li>轻柔地在视网膜上穿孔，直至进入视网膜下腔，将细胞悬液注入视网膜下腔。</li>
	<li>观察视网膜出现的水泡样脱离，应均匀分布，覆盖约 ¼ 的视网膜区域，且无出血现象。</li>
	<li>缓慢撤出注射器，视网膜上的小孔会自动闭合。</li>
	<li>用去离子水反复冲洗微量注射器数次。</li>
	<li>将小鼠从头部固定装置中取出。</li>
	<li>注射盐酸阿替帕唑以逆转盐酸美托咪啶的作用，使小鼠苏醒。</li>
	<li>将小鼠置于温暖的暗室（约 25 °C）中直至完全恢复意识。</li>
	<li>移植后接下来的 2 天内，应于上午和下午分别皮下注射布托啡诺（0.05 mg/kg 体重）以缓解疼痛。</li>
</ol>

<ol><li>Bartsch, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+cells+integrate+into+the+outer+nuclear+layer+and+differentiate+into+mature+photoreceptors+after+subretinal+transplantation+into+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Retinal cells integrate into the outer nuclear layer and differentiate into mature photoreceptors after subretinal transplantation into adult mice.</a> Exp. Eye Res. 86, 691-700 (2008).</li>
<li>MacLaren, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+repair+by+transplantation+of+photoreceptor+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Retinal repair by transplantation of photoreceptor precursors.</a> Nature. 444, 203-207 (2006).</li>
<li>Eberle, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outer+segment+formation+of+transplanted+photoreceptor+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Outer segment formation of transplanted photoreceptor precursor cells.</a> PLoS One. 7, (2012).</li>
<li>Lakowski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cone+and+rod+photoreceptor+transplantation+in+models+of+the+childhood+retinopathy+Leber+congenital+amaurosis+using+flow-sorted+Crx-positive+donor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Cone and rod photoreceptor transplantation in models of the childhood retinopathy Leber congenital amaurosis using flow-sorted Crx-positive donor cells.</a> Hum. Mol. Genet. 19, 4545-4559 (2010).</li>
<li>Barber, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+the+degenerate+retina+by+photoreceptor+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Repair of the degenerate retina by photoreceptor transplantation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 354-359 (2013).</li>
<li>Pearson, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+vision+after+transplantation+of+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Restoration of vision after transplantation of photoreceptors.</a> Nature. , (2012).</li>
<li>Singh, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+end-stage+retinal+degeneration+and+restoration+of+visual+function+by+photoreceptor+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Reversal of end-stage retinal degeneration and restoration of visual function by photoreceptor transplantation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, (2013).</li>
<li>Eberle, D., Schubert, S., Postel, K., Corbeil, D., Ader, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+integration+of+transplanted+CD73-positive+photoreceptor+precursors+into+adult+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Increased integration of transplanted CD73-positive photoreceptor precursors into adult mouse retina.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 6462-6471 (2011).</li>
<li>Koso, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD73%2C+a+novel+cell+surface+antigen+that+characterizes+retinal+photoreceptor+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">CD73, a novel cell surface antigen that characterizes retinal photoreceptor precursor cells.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50, 5411-5418 (2009).</li>
<li>Lakowski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+transplantation+of+photoreceptor+precursor+cells+selected+via+cell+surface+antigen+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Effective transplantation of photoreceptor precursor cells selected via cell surface antigen expression.</a> Stem Cells. 29, 1391-1404 (2011).</li>
<li>Akimoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+GFP+to+newborn+rods+by+Nrl+promoter+and+temporal+expression+profiling+of+flow-sorted+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Targeting of GFP to newborn rods by Nrl promoter and temporal expression profiling of flow-sorted photoreceptors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3890-3895 (2006).</li>
<li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472, 51-56 (2011).</li>
<li>Nakano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-formation+of+optic+cups+and+storable+stratified+neural+retina+from+human+ESCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs.</a> Cell Stem Cell. 10, 771-785 (2012).</li>
<li>Osakada, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+generation+of+rod+and+cone+photoreceptors+from+mouse%2C+monkey+and+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 26, 215-224 (2008).</li>
<li>Lee, M. Y., Lufkin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+%26%2334%3BThree-step+MACS%26%2334%3B%3A+a+novel+strategy+for+isolating+rare+cell+populations+in+the+absence+of+known+cell+surface+markers+from+complex+animal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Tech%22%5BJournal%5D)">Development of the &#34;Three-step MACS&#34;: a novel strategy for isolating rare cell populations in the absence of known cell surface markers from complex animal tissue.</a> J. Biomol. Tech. 23, 69-77 (2012).</li>
</ol>

作者声明&#160;不存在相互竞争的经济利益。

光感受器前体细胞的视网膜下移植是一种可靠的方法，可实现大量这类光敏细胞整合到宿主视网膜中1,2这可能为未来视网膜变性疾病的细胞治疗奠定基础6. 目前从出生后第4天（PN 4）视网膜分离的供体细胞群体为多种细胞类型的混合物，其中仅有光感受器前体细胞在经脉络膜下注射后能够整合入视网膜。通过基于CD73的MACS分选技术，可提高供体细胞悬液中光感受器细胞的比例至 &#8776; 90%，与未分选细胞群体相比，可在野生型宿主视网膜中实现约3倍更高的整合效率8与流式细胞术相比，MACS 的优势在于分选过程快速，且相对容易符合 GMP 标准。鉴于近期在可移植感光细胞纯化方面的进展，这一技术尤其值得关注 体外 由多能干细胞生成感光细胞12-14分化后的多能干细胞培养物包含多种细胞类型，因此特定分选步骤的建立是其未来应用于细胞移植治疗的必要前提。

根据MACS纯化操作流程，有几个要点需要注意，以确保整个流程顺利进行而无重大干扰。待分选的视网膜数量越多，其消化所需时间越长。消化完成后，在分选过程中必须避免细胞发生聚集，这种情况尤其容易在加入二抗之前以及二抗孵育期...

视觉是人类最重要的感官之一。视觉功能受损和失明是工业化国家致残的主要原因之一。导致视力障碍或失明的主要原因是视网膜变性，其特征是感光细胞的丧失，如在黄斑变性、视网膜色素变性、锥-杆细胞营养不良及其他疾病中所观察到的那样。迄今为止，尚无有效疗法能够恢复已丧失的视力。2006年和2008年，两个不同的实验室分别独立报道了将视杆感光前体细胞成功移植到成年野生型小鼠视网膜中的研究结果1,2。这使得将感光前体细胞移植到已变性的视网膜中以替代退化的感光细胞并恢复视力成为可能。事实上，最近的研究已证明，这些移植的感光前体细胞表现出成熟野生型感光细胞的形态学特征，例如发育良好的外节段3、与内源性双极细胞紧密相邻的突触终末，以及位于外核层的圆形细胞体2-4，同时还具备整合入宿主神经环路并发挥功能的能力5-7。&#160;该策略的主要原则之一是使用出生后第4天（PN 4，PN0定义为出生日）的小鼠视网膜，从而获得用于移植的多种细胞类型的混合物。基于未来治疗应用的背景&#160;，这种混合物必须进一步纯化以获得感光前体细胞。CD73已被描述为视网膜中幼年感光细胞特异性的首个细胞表面标志物8-10。本文中，我们展示了一种基于该细胞表面标志物并结合磁珠偶联细胞分选（MACS）技术的感光前体细胞纯化方法。相较于荧光激活细胞分选技术，MACS可能具有分选速度快以及更易于满足GMP条件的优势。我们证明，在将纯化后的细胞群移植至成年野生型视网膜的视网膜下腔时，可实现约90%的富集度，并使整合率提高达3倍。因此，基于MACS的感光前体细胞富集与视网膜下腔移植，是开发针对视网膜变性疾病的再生治疗策略中可靠且具有前景的技术。

<table><tbody><tr><td>木瓜蛋白酶解离系统</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LK003150</td><td>方法中未使用所提供的DNase I</td></tr><tr><td>纯化大鼠抗小鼠CD73，克隆株TY/23</td><td>BD Pharmingen</td><td>550738</td><td>储存浓度为0.5 mg/ml</td></tr><tr><td>羊抗大鼠IgG MicroBeads</td><td>Miltenyi</td><td>130-048-501</td><td>总体积为2 ml</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-015</td><td>用于计数细胞总数</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>D5025-150KU</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025050</td><td>用于视网膜组织的解离</td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>Sigma</td><td>Fluka93595</td><td>用于计数细胞总数</td></tr><tr><td>Vidisic</td><td>Dr. Mann Pharma / Andreae-Noris Zahn AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Domitor</td><td>Pfizer</td><td>76579</td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮10%</td><td>Ratiopharm</td><td>7538843</td><td></td></tr><tr><td>Antisedan</td><td>Pfizer</td><td>76590</td><td></td></tr><tr><td>去氧肾上腺素2.5%-托吡卡胺0.5%</td><td>德累斯顿大学医院药房</td><td></td><td></td></tr><tr><td>预分离滤器</td><td>Miltenyi</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>LS柱</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>QuadroMACS分离器</td><td>Miltenyi</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>火焰抛光玻璃巴斯德吸管</td><td>Brand</td><td>74777 20</td><td>吸管&amp;rsquo;s尖端需进行火焰抛光并高压灭菌。</td></tr><tr><td>MACS 15 ml试管架</td><td>Miltenyi</td><td>130-091-052</td><td></td></tr><tr><td>细胞计数板</td><td>Carl Roth</td><td>T728.1</td><td></td></tr><tr><td>无菌15 ml离心管</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>Leica M651 MSD</td><td>Leica</td><td>M651 MSD</td><td>可替代Olympus SZX10使用</td></tr><tr><td>Olympus SZX10</td><td>Olympus</td><td>SZX10</td><td>可替代Leica M651 MSD使用</td></tr><tr><td>Olympus倒置体视显微镜CKX41</td><td>Olympus</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific MSC-Advance细胞培养罩</td><td>Thermo Scientific</td><td>51025411</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml反应管</td><td>Sarstedt</td><td>727706400</td><td></td></tr><tr><td>2 ml反应管</td><td>Sarstedt</td><td>72695</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf离心机5702</td><td>VWR (Eppendorf)</td><td>521-0733</td><td></td></tr><tr><td>小鼠头部固定器</td><td>myNeurolab</td><td>471030</td><td></td></tr><tr><td>BD Microlance 3 30 G 1/2 in</td><td>BD Pharmingen</td><td>304000</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton微量注射器 5 &amp;micro;l, 75RN</td><td>Hamilton</td><td>065-7634-01</td><td>不带针头提供</td></tr><tr><td>Hamilton RN特制针头 34 G</td><td>Hamilton</td><td>065-207434</td><td>钝头，长度12 mm</td></tr><tr><td>Vannas-T&amp;uuml;bingen弹簧剪 - 5 mm直刃</td><td>Fine Science Tools</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7镊子 - 钛合金生物镊</td><td>Fine Science Tools</td><td>11272-40</td><td></td></tr><tr><td>金刚石笔</td><td>Tools-tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mm x 15 mm盖玻片</td><td>Sparks</td><td>MIC3366</td><td></td></tr></tbody></table>

成年小鼠视网膜下移植macs纯化的光感受器前体细胞

Subretinal Transplantation of MACS Purified Photoreceptor Precursor Cells into the Adult Mouse Retina

由于视网膜感光细胞丧失导致的视力障碍和失明 即 光感受器退化是工业化国家致残的主要原因。通过细胞移植替代退化的光感受器，可能是未来临床应用中的一种治疗选择。事实上，近期的临床前研究表明，从出生后第4天小鼠视网膜中分离出的未成熟光感受器，在经视网膜下移植后具有整合入成年小鼠视网膜的潜力。供体细胞可发育出成熟的光感受器形态，包括内节和外节结构、位于外核层的圆形胞体，以及与内源性双极细胞紧密相邻的突触终末。近期多项报告进一步证实，供体光感受器能够功能性地整合入宿主小鼠的神经环路中。为了实现此类细胞替代疗法在未来的临床应用，必须制备出高纯度的目标细胞悬液，并将其准确植入眼部的适当位置，以实现有效整合。为富集光感受器前体细胞，应基于特定的细胞表面抗原进行分选，以避免对供体细胞进行遗传报告基因修饰。本文展示了利用磁珠相关细胞分选技术（MACS），基于细胞表面标志物CD73，对来自光感受器特异性报告基因小鼠的新生视网膜中可移植的视杆光感受器前体细胞进行富集。通过抗CD73抗体孵育，随后加入偶联微珠的二抗，可利用MACS将视杆光感受器前体细胞富集至约90%。与流式细胞术相比，MACS的优势在于更易于符合GMP标准，且可在相对较短时间内分选大量细胞。将富集后的细胞悬液注射至成年野生型小鼠的视网膜下腔，其细胞整合率较未分选细胞悬液提高了3倍。

为了评估视杆光感受器整合到小鼠视网膜中的能力，使用了一种小鼠报告基因品系，其中绿色荧光蛋白（GFP）由神经视网膜亮氨酸拉链蛋白（Nrl, Nrl-GFP）启动子驱动11。Nrl 是视杆光感受器最早期的标志物，从胚胎12.5天（E12.5）开始表达，并持续至成年期，因此可实现对供体视杆光感受器细胞的特异性标记。
取出生4天的Nrl-GFP幼鼠，断头处死并摘除眼球。随后按照上述方法分离并解离视网膜组织。将所得的单细胞悬液利用基于CD73的磁珠分选法（MACS）进行分选（图1 和 图2）。完成MACS分选后，我们分析了该步骤所达到的细胞富集效果。
如图所示 图3A初始细胞悬液（Input）中含有30.4%的GFP阳性细胞， 即. 视杆光感受器。通过基于CD73的磁珠分选后，流式细胞术检测显示CD73阳性组分（CD73+）中富集率最高达86.9%。在CD73阴性组分（CD73-）中，仅有9.9%...

细胞移植是一种针对以感光细胞丧失为特征的视网膜退行性疾病的治疗策略。本文介绍一种富集可移植感光细胞并将其移植至成年小鼠视网膜下腔的方法。

成年小鼠视网膜下移植MACS纯化的光感受器前体细胞

由于视网膜中感光细胞（即光感受器）的丧失导致的视力障碍和失明是造成残疾的主要原因……

以下实验的总体目标是将富集的光感受器前体细胞移植到受体小鼠的视网膜中。该过程首先从年轻的供体动物眼中分离视网膜；第二步，利用基于CD73的磁性相关细胞分选技术，从视网膜细胞群体中分离出生后光感受器前体细胞。接下来，将感光细胞前体移植到受体动物的视网膜下腔，以促进其整合到受体视网膜中。最终，可通过免疫荧光显微镜分析移植的感光细胞前体细胞的整合潜能及其行为。该方法有助于回答视网膜再生领域中的关键问题，例如移植的感光细胞在多大程度上能够整合至宿主的神经环路中以恢复视力。该技术的意义不仅限于视网膜变性疾病的治疗。一旦通过 max 实现光感受器前体细胞的分离与富集，并可轻松适应 GMP 条件，该方法的可视化演示就显得至关重要，因为移植步骤难以掌握，而将针头精细地操作并置入视网膜下腔对于确保最高成功率和可重复性尤为关键。为分离视网膜，首先将出生后第四天幼鼠的头部用 70% 乙醇快速冲洗，随后用 PBS 洗涤。然后将头部转移至冰冷的HBSS中，为每只眼睛进行核化。首先，打开眼睑，然后使用一对弯头镊子。在视神经部位抓住眼球，小心地将眼睛从眼眶中取出。接下来分离视网膜时，将一对闭合的剪刀尖端插入视神经处，然后打开刀片。剥离视网膜色素上皮和脉络膜，并使用弯头镊子移除晶状体和玻璃体血管。将分离的视网膜置于含有木瓜蛋白酶溶液的1.5毫升反应管中，在37摄氏度、400 RPM条件下于摇床中孵育30至60分钟。在视网膜孵育的同时，将1毫升OVO moid溶液加入一个15毫升反应管中，标记为“一”，然后将60微升DNAs、60微升OVO MOID溶液和520微升EBSS加入另一个标记为“二”的2毫升反应管中。孵育结束后，将含有部分消化视网膜的木瓜蛋白酶溶液转移至反应管二中，再用火焰抛光的移液管反复吹打视网膜10次。将单细胞悬液轻柔地铺在反应管一中的OVO MOID溶液上方，在室温下以300 × g离心5分钟。弃去上清液，将细胞重悬于500 µL Max缓冲液中。为通过Max进行分选，首先将细胞在冰上用10 µg/mL的大鼠抗CD73抗体孵育。孵育5分钟后，用10毫升max缓冲液洗涤细胞。然后将细胞沉淀重悬于480微升max缓冲液中，并在冰上加入120微升go anti RET IgG磁珠进行孵育，孵育过程中不得晃动、振荡或混合。15分钟后，在5毫升max缓冲液中洗涤细胞；洗涤过程中，将LS柱置于max磁铁上，并在柱顶端放置预分离滤器。接下来，用三毫升的 max 缓冲液水化滤膜和层析柱，将缓冲液收集到标记为 W（洗涤用）的 15 毫升离心管中。当细胞完成离心后，将沉淀重悬于 500 微升的 max 缓冲液中，并将细胞悬液加入滤膜中。在细胞上加入1毫升max缓冲液，然后将阴性组分收集到标记为“阴性”的15毫升反应管中。接着，每次加入3毫升max缓冲液，重复三次，以洗涤柱子。现在将柱子从磁力架上取下。将其安装在已标记为“阳性”的15毫升反应管上方。迅速将5毫升max缓冲液加入柱中。将全部缓冲液通过柱子，然后在离心收集阳性组分后，用500微升max缓冲液重悬沉淀。将细胞置于 4°C 环境中并进行计数。然后用 Max 缓冲液将细胞浓度调整至每微升含 2 × 10⁵ 个细胞，在 4°C 条件下保存，用于移植分离的视锥前体细胞。在成年小鼠麻醉状态下，滴加一滴苯肾上腺素（phenyl left vent tropic chaid）以扩张瞳孔；在瞳孔扩张的同时，使用钻石笔将盖玻片切割成约 5 × 5 毫米的片状。将小鼠置于体视显微镜下，用小鼠头部固定器固定动物，然后在每只眼睛上滴加一滴ICIC凝胶以防止干燥。接着使用30号半英寸针头在巩膜与角膜交界处刺一个小孔。然后将一块5毫米×5毫米的盖玻片置于角膜上方，以便直接观察视网膜。接下来，用无菌去离子水反复冲洗一支预先灭菌的微升注射器数次，然后吸入一种分选后的细胞悬液。将针头斜向穿过结膜和巩膜，插入视网膜的鼻侧部分。然后轻柔地刺穿视网膜进入视网膜下腔，并注入细胞。确认视网膜出现水疱样均匀脱离，范围应覆盖约四分之一的视网膜区域，且无出血现象。随后轻柔撤出注射器，并用离子水反复冲洗数次。最后，将小鼠从固定器中取出。注射盐酸aamaz油以逆转麻醉作用，并将动物置于黑暗的25°C培养箱中使其恢复，从而评估视杆光感受器整合入小鼠视网膜的能力。实验中使用了一种小鼠报告基因品系，其中GFP由神经视网膜缺失型亮氨酸拉链（NRL）启动子驱动，如这些直方图所示。初始视网膜细胞悬液中含有30.4%的GFP阳性视杆光感受器。在基于CD73的分选后，CD73阳性组分中GFP阳性光感受器前体细胞的富集率达到86.9%；而在CD73阴性组分中，仅有9.9%的细胞为GFP阳性。基于CD73的分选同样实现了N-R-L-G-F-P阳性细胞的富集。体外接种后，供体细胞保留在注射部位，该部位由水疱样脱离的宿主视网膜界定，并整合至宿主视网膜的外核层，获得成熟光感受器细胞的形态。一旦完成主磁性相关细胞分选，若操作正确，可在两小时内完成。该方法也可适用于干细胞来源的光感受器细胞或其他视网膜干细胞的富集。鉴于已有特异性抗体可用于进一步研究细胞转分化在视网膜修复或功能挽救中的作用。在观看本视频后，您应能够充分掌握如何将光感受器前体细胞富集物移植至受体小鼠的视网膜下腔。

subretinal-transplantation-macs-purified-photoreceptor-precursor

Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

MACS纯化光感受器前体细胞的亚视移植到成年小鼠视网膜中

本文以多媒体形式展示了一种被学术界广泛认可的在大鼠和小鼠中进行视网膜下腔注射RPE细胞悬液的实验方案。该方法可用于评估移植的RPE细胞在视网膜变性动物模型中的挽救潜力、安全性以及存活能力。...

在啮齿类动物中进行视网膜下注射以递送悬浮的视网膜色素上皮细胞

视网膜色素上皮（RPE）替代策略和基于基因的治疗已被考虑用于多种视网膜变性疾病。在临床转化过程中，需要使用大型眼动物模型来研究适用于患者的手术技术。本文介绍了一种用于视网膜下手术的兔模型，该模型专为RPE移植设计，具有多功能性和成本效益。...

兔眼视网膜下手术的逐步操作方案

视网膜下注射已广泛应用于年龄相关性黄斑变性干细胞替代治疗的临床前研究。在本可视化文章中，我们描述了一种经巩膜途径向大鼠眼内递送细胞的、风险更低、可重复且精确改良的视网膜下注射技术。...

开发一种优化的大鼠眼经巩膜视网膜下人视网膜色素上皮细胞移植方案

视网膜色素上皮细胞可作为干性年龄相关性黄斑变性晚期的细胞替代疗法。本方案描述了地理样萎缩的大眼模型的建立，以及将人胚胎干细胞来源的视网膜色素上皮细胞移植至该疾病模型的视网膜下腔的过程。...

地理萎缩大眼模型中人胚胎干细胞来源的视网膜色素上皮细胞的视网膜下移植

关键词：人胚胎干细胞，视网膜色素上皮细胞，地理萎缩，视网膜下移植，大眼模型

本文介绍了一种将人多能干细胞（hPSC）来源的视网膜组织移植到大型动物模型视网膜下腔的外科手术技术。...

在猫科大型动物模型中进行人胚胎干细胞来源视网膜组织的视网膜下移植

非人灵长类动物（NHP）由于其在解剖结构和遗传上的相似性，是研究人类视网膜细胞治疗的理想模型。本文描述了一种在NHP眼球中进行黄斑下视网膜色素上皮细胞移植的方法，以及预防与黄斑操作相关的术中并发症的策略。...

退行性视网膜疾病非人灵长类动物模型中的视网膜色素上皮移植

本方案介绍了一种经瞳孔视觉引导的经巩膜入路，可安全、精确地向患有或不患有视网膜变性的受体小鼠递送视网膜下细胞移植物，且手术并发症发生率较低。...

视网膜变性小鼠模型中经瞳孔引导的经巩膜下视网膜下移植术

我们描述了一种详细的方案，用于制备经冷冻保存后的hESC来源的视光感受器前体细胞，并将其移植到rd10小鼠的视网膜下腔。...

视网膜下移植人胚胎干细胞来源的光感受器前体细胞至 rd10 小鼠

一种小鼠模型 在子宫内 移植

该手术技术演示了将基因治疗载体和干细胞注射到小鼠眼球视网膜下腔的方法。...

围产期小鼠眼内视网膜下注射基因治疗载体与干细胞

学习使用MACS技术纯化光感受器前体细胞并进行亚视网膜移植的方法。本研究展示如何通过CD73磁珠分选富集细胞，将其移植到成年小鼠视网膜中，利用免疫荧光显微镜分析细胞整合情况，为视网膜再生和视力恢复研究提供重要技术支持。

成年小鼠视网膜下移植MACS纯化的光感受器前体细胞

探索更多视频