小鼠主动脉窦动脉粥样硬化病变的定量分析与表征

本实验的总体目标是对心肌梗死（MI）主动脉窦中的动脉粥样硬化病变进行表征和定量分析。首先通过解剖取出的心脏，分离心尖部分并定位主动脉窦。随后，将处理后的心尖组织制备成石蜡包埋块。

然后对主动脉窦进行切片并固定在载玻片上。最后对组织切片进行染色。最终可通过组织化学和免疫组织化学分析获得结果，显示动脉粥样硬化病变的不同大小和组成。

本实验操作将由我实验室的研究生 Daniel Venga penal 演示。麦克马斯特大学动物研究伦理委员会已预先批准本文所述所有操作步骤。在对 LDLR 双重阴性小鼠实施麻醉、采血并实施安乐死后，按照文本方案固定组织并分离心脏：使用手术刀在心脏上做一横向切口，切口方向垂直于升主动脉。将心脏的心尖部或顶部组织放入包埋盒中，并浸入福尔马林（Formin）溶液中。

然后将包埋盒放入组织处理机中，过夜处理。根据文本方案中所述的程序，将石蜡在62摄氏度下熔化过夜，用于组织学包埋模具。将每份处理后的组织放入深型组织学包埋模具中，确保心脏的界面接触模具底部，然后倒入熔化的石蜡，完全充满模具。

使用带有标签的塑料包埋盒覆盖模具。将模具在冰上或冷表面冷却后，将组织块从模具中分离，以切取主动脉切片。将组织块置于切片机的样品夹中，使其能够从内侧向心脏顶部方向进行切片。

将切片机调整至10微米，对心脏进行切片。将切片收集到玻片上，在光学显微镜下观察以确定位置和方向。窦部应呈现为三个具有附属瓣叶的双叶瓣膜基部。

当主动脉窦的一个或两个瓣膜显现时，根据需要调整包埋块的角度。到达瓣膜后，将切片机调整至切片厚度为四到五微米。将前10张切片分别贴附于每张载玻片的顶部位置，随后每10张切片为一组，依次贴附于下一张载玻片的相应位置。

在载玻片上。继续收集切片，直至观察不到动脉粥样硬化病变为止。为染色切片以观察病变，将载玻片放入空气干燥器中干燥八分钟，然后用苏木精和伊红染色。

然后使用二甲苯洗涤切片四次，每次三分钟以脱蜡。将切片在100%乙醇中洗涤三次，每次三分钟。接着用70%乙醇和50%乙醇洗涤。

每次三分钟，重复三次。用蒸馏水冲洗载玻片，然后将其浸入MA的血红素中15分钟。

洗涤并运行。用自来水冲洗5分钟，然后用蒸馏水洗涤5分钟，在伊红Y中浸染1至5分钟。

用蒸馏水洗涤三次，每次五分钟。50%乙醇洗涤两次，每次两分钟。然后用70%乙醇洗涤三次，每次两分钟，最后用100%乙醇洗涤。

每次两分钟，共三次。然后用二甲苯洗涤，每次两分钟，共四次。使用基于二甲苯的封片介质封片，并在光学显微镜下采集图像。

使用成像软件识别并定量分析病变，这些病变可在距主动脉窦特定距离处进行评估，间隔为40至50微米，具体取决于切片厚度；有关免疫组织化学和免疫荧光染色的详细步骤，请参阅文本方案。5周龄的LDLR阳性小鼠分别饲喂标准饮食或高脂饮食10周，随后将其心脏固定、分离并按图示进行切片。

当小鼠饲喂标准普通饲料时，动脉粥样硬化的进展非常有限，在8周龄15周时可能无法检测到。高脂饮食在此模型中显著加速动脉粥样硬化的发展，并诱导形成含有慢性无细胞核心和纤维帽的大型晚期病变。动脉粥样硬化病变可通过针对特定细胞类型和影响病变发展阶段的因素进行染色，进一步表征。

单核细胞浸润至内膜是动脉粥样硬化早期事件之一。单核细胞分化为巨噬细胞，吞噬细胞碎片和脂质。这些摄取大量脂质的巨噬细胞被称为泡沫细胞，在动脉壁内形成脂质条纹，如图所示。

通过使用针对特定巨噬细胞标志物（如 F4/80 和 MAC-3）的抗体进行染色，可在病变发展的各个阶段检测到巨噬细胞泡沫细胞。血管平滑肌细胞（vSMCs）局限于健康动脉的中膜层。在进展期病变的发展过程中，vSMCs 被诱导迁移并增殖至内膜。

如本图所示，血管平滑肌细胞（V SMCs）可在其发育后通过α-肌动蛋白抗体染色进行鉴定。该技术为心血管疾病领域的研究人员探索动脉粥样硬化病变在啮齿类动物中的发育与进展奠定了基础。