Name: V3 无污渍工作流，适用于西式印迹中实用、方便和可靠的总蛋白质加载控制 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-30T20:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 33 s
Description: 了解V3无污渍工作流用于蛋白质印迹分析，使用TGX无污渍凝胶和快速转膜系统实现可靠的总蛋白上样对照。该方法可提高蛋白质定量准确性，避免传统内参蛋白信号饱和问题。

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作者感谢 Wolf-Dieter Stalz 博士、Arnaud Remy 博士、Anton Posch 博士、Patricia Piatti 博士、Tom Davies、Kris Simonyi 和 Jeff Durban 对本手稿提出的宝贵审稿意见和编辑工作。作者还感谢 Allison Schwartz 提供的技术支持。

1. 蛋白质样品制备
（本文描述了从细胞培养物中提取蛋白质的典型步骤）
<ol>
	<li>将 HeLa 细胞培养皿置于冰上，用预冷的 Tris 缓冲盐水（TBS；20 mM Tris-HCl，pH 7.5，150 mM NaCl）洗涤细胞。</li>
	<li>吸除 TBS，然后每 100 mm 培养皿加入 1 ml 预冷的 RIPA 裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 8.0，150 mM NaCl，1% NP-40，0.5% 脱氧胆酸钠，0.1% SDS），并添加磷酸酶和蛋白酶抑制剂。</li>
	<li>用预冷的塑料细胞刮刀将贴壁细胞从培养皿上刮下，轻柔地将细胞悬液转移至预冷的微量离心管中。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，于旋转摇床上持续震荡孵育 30 分钟。</li>
	<li>在 4 °C 预冷的离心机中，以 16,000 x g 离心 20 分钟。</li>
	<li>小心地将离心管从离心机中取出并置于冰上。将上清液转移至另一置于冰上的新离心管中，弃去沉淀。</li>
	<li>取少量裂解液（10–20 μl）用于蛋白定量检测。使用 RC DC 蛋白检测试剂盒测定各样品的蛋白浓度。</li>
	<li>如需长期保存，可将蛋白样品分装后于 -20 °C 保存。反复冻融会导致蛋白降解，应避免。</li>
	<li>取约 20 μg 的各样品，加入等体积的 2x Laemmli 上样缓冲液（4% SDS，10% 2-巯基乙醇，20% 甘油，0.004% 溴酚蓝，125 mM Tris-HCl，pH 6.8）。</li>
	<li>将细胞裂解液与上样缓冲液混合物在 95 °C 加热 5 分钟。</li>
	<li>在微量离心机中以 16,000 x g 离心 1 分钟。</li>
</ol>
2. 使用免染凝胶进行凝胶电泳（约30分钟）
<ol>
	<li>取一块Criterion TGX Any KD 免染预铸胶（中等尺寸胶），移除梳子以及胶盒底部的胶带。</li>
	<li>将胶盒放入Criterion电泳槽中，并向内置的上层缓冲液室加入60 ml电泳缓冲液（25 mM Tris，190 mM 甘氨酸，0.1% SDS，pH 8.3）。用电泳缓冲液冲洗加样孔。</li>
	<li>向下层缓冲液槽的每侧加入400 ml电泳缓冲液，至标记的液面线处。</li>
	<li>上样蛋白样品及相应的蛋白分子量标记物。</li>
	<li>盖上电泳槽盖，将颜色编码的香蕉插头与盖子上的对应插孔对齐。</li>
	<li>以200 V电压电泳约30分钟，或以300 V电压电泳20分钟。</li>
</ol>
3. 使用 Chemidoc MP 系统进行免染凝胶成像以检测蛋白质分离质量（约 5 分钟）
<ol>
	<li>从电泳槽中取出凝胶盒。使用Criterion电泳槽盖子上的凝胶盒开启工具撬开凝胶盒，释放凝胶。</li>
	<li>向ChemiDoc MP成像仪的紫外样品托盘中央加入数毫升水。小心地将凝胶从凝胶盒中取出，并放置于托盘上。</li>
	<li>启动Image Lab软件，并使用以下设置捕获无染色凝胶图像（图1A）： 
	应用模式：无染色凝胶 
	凝胶激活时间：1分钟 
	成像区域：Criterion凝胶 
	图像曝光时间：根据最强条带自动优化</li>
	<li>从样品托盘中取出凝胶，立即进入转膜步骤。</li>
</ol>
4. 使用 Trans-Blot Turbo 系统进行蛋白质转印（约10分钟）
<ol>
	<li>打开 Trans-Blot Turbo Midi PVDF 转膜试剂盒；将底部层（包含膜）放置在转膜夹的底座上。</li>
	<li>将凝胶置于膜上方，将顶部层放在凝胶上，并滚压去除气泡。</li>
	<li>盖上夹子的盖板，旋转旋钮将其锁紧。</li>
	<li>将夹子插入转膜仪的槽中。</li>
	<li>选择预设的 Turbo 程序，并选择 Criterion 凝胶尺寸（midi），然后按 RUN 开始转膜。典型的运行时间仅为 7 分钟。</li>
	<li>转膜结束后，拆开转膜“三明治”结构，将膜和凝胶一同放入盛有去离子水的容器中。</li>
</ol>
5. 使用 Chemidoc MP 系统进行无染料凝胶和印迹成像以检测蛋白质转移效率和质量（约 5 分钟）
<ol>
	<li>将转膜后的凝胶放置在 ChemiDoc MP 成像仪的样品托盘上。</li>
	<li>启动 Image Lab 软件，并使用以下设置捕获转膜后凝胶的免染成像图像（图 1B）： 
	应用模式：免染凝胶 
	凝胶激活时间：无 
	成像区域：criterion 凝胶 
	图像曝光时间：与转膜前凝胶图像的曝光时间相同</li>
	<li>从样品托盘中取出凝胶，然后使用以下设置对印迹膜进行成像（图 1C）。成像过程中需保持印迹膜湿润，可滴加少量水或 TBST。 
	应用模式：免染印迹膜 
	成像区域：criterion 凝胶 
	图像曝光时间：自动优化至最强烈条带的最佳曝光</li>
	<li>从样品托盘中取出印迹膜，放入含有 TBST（含 0.1% Tween 20 的 TBS）的容器中。</li>
</ol>
6. 抗体孵育
<ol>
	<li>将印迹膜置于含3%牛血清白蛋白（BSA）的TBST溶液中，室温下封闭1小时。</li>
	<li>将印迹膜在含有针对第一种目标蛋白的小鼠一抗和针对第二种目标蛋白的兔一抗的溶液中，4 °C孵育过夜。</li>
	<li>倒出含一抗的溶液，随后在20 ml TBST中振荡洗涤5分钟，重复4次，共洗涤5次。</li>
	<li>在含有Dylight 650标记的 Goat-anti-mouse 抗体和Dylight 549标记的 Goat-anti-rabbit 抗体的二抗溶液中，室温孵育1小时。</li>
	<li>倒出含一抗的溶液，随后在20 ml TBST中振荡洗涤5分钟，重复4次，共洗涤5次。</li>
</ol>
7. 使用 Image Lab 软件进行成像与数据分析——总蛋白归一化（约 5 分钟）
<ol>
	<li>获取印迹的多重荧光图像（图1E通过打开一个新的多通道程序，设置三个荧光通道并运行该程序。 
	通道 1： 
	应用：印迹 Dylight 650 
	成像区域：标准凝胶 
	图像曝光时间：针对最强烈的条带自动优化 
	通道 2： 
	应用：印迹 Dylight 549 
	成像区域：标准凝胶 
	图像曝光时间：针对最强烈的条带自动优化 
	通道 3： 
	应用：免染蛋白印迹 
	成像区域：标准胶；图像曝光时间：针对最强条带自动优化</li>
	<li>从分析工具箱中点击归一化图标，然后点击“是”以检测泳道和条带。</li>
	<li>选择并使用 &#34;泳道与条带工具&#34; 如有需要，可对泳道和条带进行调整。</li>
	<li>选择免染成像作为归一化通道。</li>
	<li>选择分子量分析工具，并通过勾选其下方的复选框指定分子量标准条带。</li>
	<li>要查看归一化体积，请点击工具栏上的分析表格。所有计算将由软件自动完成，包括归一化因子和归一化体积。目标蛋白条带强度值现已根据蛋白上样量的差异进行了校正，从而可在各样本间对目标蛋白进行准确比较。</li>
</ol>

<ol><li>Aldridge, G. M., Podrebarac, D. M., Greenough, W. T., Weiler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+total+protein+stains+as+loading+controls%3A+an+alternative+to+high-abundance+single-protein+controls+in+semi-quantitative+immunoblotting%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">The use of total protein stains as loading controls: an alternative to high-abundance single-protein controls in semi-quantitative immunoblotting.</a> J. Neurosci. Methods. 172 (2), 250-254 (2008).</li>
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<li>Larkins, N. T., Murphy, R. M., Lamb, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influences+of+temperature%2C+oxidative+stress%2C+and+phosphorylation+on+binding+of+heat+shock+proteins+in+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Influences of temperature, oxidative stress, and phosphorylation on binding of heat shock proteins in skeletal muscle fibers.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 3 (6), (2012).</li>
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</ol>

作者 Anton Posch、Jonathan Kohn、Kenneth Oh、Matt Hammond 和 Ning Liu 是伯乐生命科学公司（Bio-Rad Laboratories, Inc.）的员工。

上述 V3 免染色方案适用于多重荧光 Western 印迹实验，也可用于化学发光检测的 Western 印迹实验。在多重荧光 Western 印迹方案中，免染色印迹图像在两个时间点获取：1）蛋白转膜后立即成像；2）抗体孵育后的多重荧光成像步骤。第一个免染色图像用于计算转膜效率，第二个免染色图像则用作上样量对照。当采用化学发光方法时，无法同时对免染色信号和目标蛋白信号进行多重成像，因为化学发光信号也会出现在免染色通道中。在此情况下，我们建议使用蛋白转膜步骤完成后立即获取的免染色图像作为上样对照和归一化分析的依据。
与使用看家蛋白作为上样对照的传统 Western 印迹实验流程相比，V3 Western 实验流程具有以下独特优势：
首先，V3 工作流程提供了一种更实用、便捷且可靠的上样对照方法，用于验证目的蛋白水平的变化。V3 方案采用总蛋白上样对照，对各样本中检测到的目的蛋白水平进行归一化处理。该方法避免了使用看家蛋白作为上样对照时可能遇到的两个问题：免疫检测信号饱和，以及在特定实验条件下不同样本之间看家蛋白表达水平不一致。因此，不再需要使用针对看家蛋白的抗体进行膜剥离和重新孵育的步骤。借助免染技术，无需再使用考马斯亮蓝（Coomassie）或 Sypro Ruby 等染料对印迹膜进行染色和脱色以测定总蛋白量。仅需几秒钟即可获取印迹图像，使用 Image Lab 软件进行总蛋白归一化分析约需 5 分钟。
其次，V3 工作流程使科研人员能够更好地掌控 Western 实验过程，因为它提高了实验的透明度，并引入了多个质量控制检查点。借助免染技术，研究人员可以在凝胶和印迹膜上直接观察其蛋白质样品。科研人员可以评估蛋白质样品的完整性（是否降解）、分离质量（是否沉淀）、转膜效率及转膜质量（是否均匀转移）。这些检查点有助于研究人员在发现实验过程中存在重大缺陷时及时终止实验，避免在质量不佳的样品和印迹膜上浪费时间。该技术还能帮助科研人员评估膜在脱抗体处理后是否存在显著的蛋白质损失，以及印迹膜是否适合用于检测其他靶标4。
以下是一些使用 V3 western 工作流程时确保良好体验和高质量数据的小贴士。
<ol>
	<li>电泳结束后立即对凝胶进行成像。在本方案的首次成像前，切勿将凝胶浸泡于任何缓冲液中，以免洗脱染料化合物。</li>
	<li>在整个实验流程中使用相同的成像区域获取所有图像。这将允许软件对图像进行叠加，用于数据分析，例如总蛋白归一化。</li>
	<li>在对转膜前和转膜后的凝胶进行成像时，保持曝光时间一致。这将使软件能够定量测定转膜效率。</li>
	<li>在获取印迹图像时，用少量水或TBST保持膜的湿润。这有助于避免目标蛋白检测时可能出现的背景污渍问题。</li>
	<li>进行多重荧光Western印迹时，使用低荧光背景的PVDF膜。</li>
</ol>
需要注意的是，免染料在紫外活化后会不可逆地结合到色氨酸残基上。这种不可逆的修饰可能会影响单克隆抗体对抗原的识别，特别是当表位中含有色氨酸时。多克隆抗体则不太可能受到影响，因为它们可识别抗原上的多个表位。未结合的免染料分子可轻松从凝胶和膜上洗脱，因此不会干扰抗体与抗原的相互作用。
总之，V3 western 流程使 western 印迹过程更快速、更透明、更定量且更可靠。研究人员现在可以轻松地在 western 印迹实验中应用总蛋白上样对照，从而使数据更加可信。V3 免染色流程已被多家实验室采用，其发表的文献表明，期刊接受将免染色数据作为 western 印迹中的上样对照22,17,7,8,5,23,18,15。

Western blot 是一种非常有用的技术9，但该技术存在两个主要挑战：过程耗时且劳动强度大，以及数据质量的控制问题。传统实验流程大约需要两天时间，涉及多个步骤，包括样品制备、凝胶制备、蛋白质电泳与转膜、膜的封闭、抗体孵育、成像，以及经常需要进行的 stripping、重新探针杂交，最后是数据分析。在整个过程中，缺乏可靠且灵活的过程控制工具。因此，每个步骤都可能引入误差，而这些误差有可能导致数据假象的产生；因此，上样对照在 Western blot 实验中至关重要，用于识别并校正这些误差。上样对照通常是通过检测每个样品中参考蛋白的蛋白水平，以确认其是否均等表达。人们常使用看家蛋白，如 β-actin、β-tubulin、GAPDH，作为上样对照。
Western blot 数据的质量依赖于可靠的上样对照。但在使用看家蛋白作为上样对照时存在两个合理关切：1）针对看家蛋白条带的抗体免疫检测信号常出现饱和，因而无法区分样品之间的上样量差异30；2）在某些实验条件下，如siRNA处理、细胞死亡、细胞分化等，样本中的持家蛋白表达水平可能发生变化，&#160;等等。11,28,3,6,10,21由于这些担忧，科学期刊现在要求 &#34;为了进行定量比较，应使用适当的试剂、对照以及具有线性信号范围的成像方法&#34; （《自然》指南）。同样，《临床研究杂志》的编辑们也要求使用更可靠的上样对照24因此，需要对管家蛋白进行验证，以确认其可作为上样对照。首先，必须确保其检测值处于免疫检测方法的线性动态范围之内。14,29其次，必须确保其在所有样本中的表达具有一致性。26,31,25,19,20.
一种替代可靠的上样对照方法是利用印迹膜上的总蛋白测量。一些研究人员已使用总蛋白染色剂（如考马斯亮蓝、Flamingo Pink、Sypro Ruby、氨基黑、Ponceau S 以及无染料技术）对印迹膜进行染色，以测定每条泳道中的总蛋白信号作为上样对照16,20,13,27,1,4,12。总蛋白上样对照可避免管家蛋白相关的问题。首先，它能真实反映每个样本所上样的蛋白量；其次，总蛋白染色在蛋白质印迹分析常用的上样范围（10–50 μg 复杂细胞裂解液蛋白）内具有优异的线性动态范围，能够准确区分各样本之间的上样差异12。
免染技术是一种新型的总蛋白染色方法，该方法将一种独特的化合物混入丙烯酰胺凝胶溶液中，并均匀分布于制备好的凝胶内。电泳完成后，将凝胶暴露于紫外光下至少1分钟，使染色化合物与蛋白质中的色氨酸残基发生反应。蛋白质在紫外光激发下产生强烈的荧光信号，可在支持免染功能的成像系统（如ChemiDoc MP系统）中进行可视化和定量分析。然而，该免染化合物本身不吸收紫外光，因此凝胶图像背景信号较低。色氨酸残基的这一修饰是不可逆的，因此蛋白质不仅可在凝胶中显影，而且在蛋白质转膜后的任意时间点也可在印迹膜上进行检测。
V3 蛋白质印迹工作流程中应用了免染技术（图1），以解决传统工作流程中的主要问题，尤其是使用看家蛋白作为上样对照所引发的担忧。采用该工作流程，研究人员可以：1）在约20-30分钟内完成凝胶电泳；2）在电泳结束后5分钟内检查样品完整性和蛋白质分离质量；3）在3-10分钟内完成蛋白质转膜；4）定量评估转膜效率；以及5）最重要的是，利用总蛋白上样对照来验证目标蛋白水平的变化。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>4-20% Criterion TGX Stain-Free 预制胶</td><td>Bio-Rad</td><td>&lt;strong&gt;567-8093&lt;/strong&gt;</td><td>根据实验的具体需求选择合适的凝胶尺寸和浓度</td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo Midi PVDF 转膜试剂盒</td><td>Bio-Rad</td><td>&lt;strong&gt;170-4157&lt;/strong&gt;</td><td>选择PVDF或硝酸纤维素膜，并确保膜的尺寸与凝胶尺寸匹配</td></tr><tr><td>Clarity Western ECL 化学发光底物，500 ml</td><td>Bio-Rad</td><td>170-5061</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;仪器设备&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Criterion 电泳槽</td><td>Bio-Rad</td><td>165-6100</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo 转膜系统（基础套装）</td><td>Bio-Rad</td><td>170-4155</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc MP 成像系统</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8280</td><td></td></tr></tbody></table>

用于蛋白质印迹中实用、便捷且可靠的总蛋白上样对照的 v3 免染工作流程

V3 Stain-free Workflow for a Practical, Convenient, and Reliable Total Protein Loading Control in Western Blotting

Western blot 是一种非常有用且被广泛采用的实验室技术，但其操作具有挑战性。该实验流程通常被描述为一个 &#34;黑箱&#34; 因为实验者在完成多个步骤之前，无法确定实验是否成功。此外，由于缺乏贯穿整个Western印迹过程的有效质量控制工具，Western印迹数据的质量有时会受到质疑。本文介绍了V3 Western工作流程，该流程应用免染色技术，以解决传统Western印迹实验方案中的主要问题。该工作流程使研究人员能够：1）在约20–30分钟内完成凝胶电泳；2）在电泳结束后5分钟内观察样品分离的质量；3）在3–10分钟内完成蛋白质转膜；4）定量验证转膜效率；最重要的是，5）利用总蛋白上样量对照来验证目标蛋白表达水平的变化。这一新方法无需对内参蛋白（如β-actin、β-tubulin、GAPDH）进行膜剥离和重新杂交。 等等。 V3 免染工作流程使 Western 印迹过程更快速、透明且更具定量性&#160;且可靠。

1. 使用免染色凝胶成像评估样品完整性、蛋白质分离质量和转膜效率。
将 HeLa 细胞的蛋白提取物在 18 孔 Criterion AnyKD TGX 免染凝胶上以 300 V 电压分离 20 分钟。蛋白样品在不同上样量下各重复上样 3 次（第 1–3 泳道，40 μg；第 4–6 泳道，30 μg；第 7–9 泳道，20 μg；第 10–12 泳道，10 μg）。凝胶经紫外光活化 1 分钟。图 2A 显示蛋白分离完成后立即获取的凝胶图像。通过该凝胶图像可直观评估蛋白样品的完整性（e.g. 是否降解）以及分离质量（e.g. 是否发生蛋白沉淀）。随后，蛋白在 Trans-Blot Turbo 装置中转移 7 分钟至硝酸纤维素膜。图 2B 显示转移后凝胶的免染图像。两张图像的曝光时间相同（6.8 秒）。选择第 3 和第 12 泳道用于测定转移效率。使用 Image Lab 软件中的体积工具，在两张凝胶图像上分别绘制矩形框（蓝色）覆盖第 3 和第 12 泳道。基于这些框内体积值的计算结果表明，两个泳道的转移效率均为 80%（图 2C）。本实验中选用 AnyKD TGX 凝胶用于研究小至中等大小的目标蛋白，该体系未针对大分子蛋白的转移进行优化。若需优化大蛋白的转移效率，应使用较低浓度的凝胶（e.g. 4–20%）和/或调整转移时间，以促进大分子蛋白的有效转移。2. 在 Western blot 定量分析目标蛋白微小变化时，免染总蛋白上样对照是一种可靠的内参对照替代方案，可取代传统的管家蛋白上样对照。
MCM-7 是一种DNA复制许可因子，其在淋巴母细胞系（LCL）中经辐射处理后水平会下降20-50%。本实验中，将四组对照和辐射处理的淋巴母细胞系（LCL）培养物的裂解液（每样30 μg）在12孔Criterion AnyKD TGX免染凝胶上进行分离。凝胶经紫外光照射激活1分钟，随后通过Trans-Blot Turbo系统转移至PVDF膜进行免疫印迹。内参蛋白GAPDH（绿色）使用兔源抗体（Cell Signaling Technology, USA, 1:2,500）和Dylight 549标记的山羊抗兔抗体（Rockland, USA, 1:20,000）进行检测；目标蛋白MCM-7（红色）使用小鼠源抗体（Abcam, USA, 1:1,000）和Dylight 649标记的山羊抗小鼠抗体（Rockland, 1:10,000）进行检测。
图3A 显示了在四个对照组和经辐射处理的LCL样本中检测到的总蛋白（蓝色）、MCM-7（红色）和GAPDH（绿色）的多重荧光图像。图3B 为同一印迹的无染色图像，显示各样本（30 μg）中的总蛋白条带模式。Image Lab软件选定了样本泳道（蓝色框），用于测量每条泳道中MCM-7、GAPDH和总蛋白的信号体积。MCM-7水平的归一化处理分别以无染色法测定的总蛋白量或GAPDH为参照。对归一化后的MCM-7蛋白水平进行统计分析，其平均蛋白条带体积及标准差（n=4）如图表所示（图3C）。两种归一化方法均显示，经辐射处理后MCM-7蛋白水平略有下降（约25%）。以总蛋白归一化所得数据的标准差小于以GAPDH作为上样对照时的数据。
<img alt="电泳工作流程示意图；TGX凝胶成像、蛋白转膜、抗体孵育、数据结果。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50948/50948fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50948/50948fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. V3 Western工作流程。 V3工作流程在左侧列中分为4个步骤展示。每个步骤中列出了所使用的主要仪器和试剂，并标明了各步骤的预计耗时。右侧列显示在V3工作流程中至少可生成4幅图像。每类数据的用途均有说明。传统的Western blot技术难以轻松获得转膜前凝胶、转膜后凝胶以及印迹膜的免染图像（A, B, C）；这些图像和数据为实验过程提供了重要的信息和质量控制节点，有助于提高科研人员对Western blot工作流程的掌控力和实验可重复性。目标蛋白信号可在化学发光印迹图像（D）上捕获，前提是检测时使用了HRP标记的二抗；或者在荧光印迹图像（E）上捕获，前提是进行了多重荧光Western blot检测，以在同一张印迹膜上同时检测多个目标蛋白。
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50948/50948fig1highres.jpg" target="_blank">点击此处查看高清图像。</a>
<img alt="转膜前和转膜后免染胶图像；蛋白质转膜效率；定量数据。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50948/50948fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50948/50948fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. V3 Western 实验流程中转膜前和转膜后凝胶的免染图像，用于评估样品完整性、分离质量和转膜效率。（A）转膜前凝胶的免染图像。（B）转膜后凝胶的免染图像。（C）蛋白质转膜效率测定结果。
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50948/50948fig2highres.jpg" target="_blank">点击此处查看高清图像。</a>
<img alt="荧光Western印迹图，免染印迹，MCM-7蛋白水平分析，辐射效应。" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50948/50948fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50948/50948fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. 比较免染总蛋白检测与GAPDH免疫检测作为上样对照，用于校正目的蛋白水平。（A）荧光Western印迹图像。（B）免染印迹图像。（C）经归一化的MCM-7蛋白水平。 
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50948/50948fig3highres.jpg" target="_blank">点击此处查看高清大图。</a>

V3 工作流程是一种使用免染胶进行的蛋白质印迹实验。免染技术可使研究人员直观评估蛋白质分离质量，验证转膜效率，更重要的是，可通过总蛋白定量作为可靠的上样对照，来验证目的蛋白的变化。

用于蛋白质印迹中实用、便捷且可靠的总蛋白上样对照的 V3 免染工作流程

Western blot 是一种非常有用且被广泛采用的实验技术，但其操作具有挑战性。该实验流程常被描述为“黑...

BioRad V three 工作流程为研究人员提供了更可靠的定量结果以及对 Western 印迹过程的更高置信度。该流程首先使用 TGX 免染胶来分离并可视化蛋白质样品。分离后，利用 Blot Turbo 快速转膜系统将蛋白质转移至膜上，从而可对转膜的质量和效率进行验证。在确认转膜后，使用封闭液封闭膜，并用针对目标蛋白的一抗和二抗进行孵育。最后，采用免染总蛋白定量法作为上样对照，对目标蛋白水平进行归一化处理。V3 工作流程为蛋白质印迹实验的各个环节带来了便捷性与透明度，使研究人员从分离、转膜到定量的每一步都更具信心。与传统的蛋白质印迹技术相比，V three Western 工作流程的主要优势在于，无染料染色技术为靶蛋白信号的归一化提供了实用、便捷且可靠的总蛋白上样对照。该方法有助于解答与蛋白质印迹技术中上样对照方法可靠性相关的关键问题，特别是涉及内参蛋白信号的过度饱和以及在不同实验条件下内参蛋白表达水平差异的问题。我们发现，在无染料凝胶中激活的蛋白质也可直接在成像仪上无需进一步染色即可可视化，因此可作为传统总蛋白染色以及内参蛋白上样对照的替代方案。在接下来的几分钟内，我们将演示使用多重荧光技术完成完整的 V three 工作流程。在根据文本方案制备蛋白样品后，该相同步骤也可用于化学发光检测。使用 Criterion TGX Stain-Free Any kD 预制胶时，从凝胶 cassette 底部移除梳子和封口胶带。将胶板放入电泳装置中，并在两侧储液槽中加入电泳缓冲液。上样蛋白标准品和待测样品，然后在300伏电压下电泳运行20分钟。电泳完成后，使用 Criterion Cell 盖子上的凝胶夹板开启工具打开夹板。然后向 Chemi Dock MP 成像仪的紫外透射仪表面加入几毫升水。小心地将凝胶从夹板中取出，并放置在紫外透射仪上。启动 Image Lab 软件，设置一个新的单通道染料免染凝胶检测程序，使用默认的一分钟凝胶活化时间，选择合适的凝胶类型，并启用默认的自动优化功能以获得清晰的条带。然后点击运行程序。图像采集完成后，立即观察分离情况和样本质量，并立即进入转膜步骤。为进行蛋白质转移，打开一个转印阻断剂 turbo MIDI PVDF 转印试剂盒。将底部叠层置于 cassette 底座的中央。从成像仪中取出凝胶。将凝胶对齐放置在膜的上方。轻轻使用转膜滚轮去除凝胶与膜之间的气泡。接着，将上层滤纸叠层对齐放置在凝胶上方。除去所有气泡后，将盒盖盖在底座上。用力下压盒盖，顺时针旋转旋钮锁定，然后将盒体插入两个 blotter 槽位中的任意一个。从主屏幕中选择 turbo 程序。选择两个小型凝胶或一个小型凝胶，然后按下相应槽位的运行按钮。七分钟后转移将完成。从槽位中取出玻片盒。打开盒式装置并拆解印迹夹心结构。将转膜后的凝胶置于 Chemi dock MP 成像仪的紫外透射仪上，并立即将膜放入去离子水中。为无激活时间的免染色凝胶设置一个新的单通道程序。选择合适的凝胶类型，并手动将曝光时间设置为转膜前凝胶的曝光时间，然后点击运行程序。图像采集完成后，通过比较转膜前后凝胶中样品条带的强度来验证转膜效率。移除不再需要的样品托盘中的凝胶并弃去。为确认结果，将样品转移至印迹膜。将膜放置在样品托盘上，并建立一个新的单通道程序。对于免染蛋白印迹，请选择合适的凝胶类型，并选择默认的自动优化以获得强条带，然后点击运行方案。图像采集完成后，验证条带是否已转移至膜上。将印迹膜从紫外透射仪上取下，放入封闭缓冲液中，用于后续的蛋白质印迹实验。将膜在室温下孵育一小时后，于次日加入小鼠和兔的一抗，在4°C下孵育过夜。倒出抗体溶液，用 50 毫升 TBST 室温下洗涤印迹膜 5 分钟。将印迹膜与荧光标记的抗小鼠和抗兔二抗在室温下孵育 1 小时。然后用 TBST 洗涤印迹膜 5 次，每次 5 分钟。为成像印迹，将其放置于 Chemi doc MP 成像仪的紫外透射仪上，并在 Image Lab 软件中设置一个新的多通道程序。通过在印迹应用中选择 dite six 50 来配置第一通道，并对强条带使用默认的自动优化功能。重复上述步骤，分别为 DITE 5 49 和无染色印迹配置通道二和通道三。选择合适的凝胶类型，然后点击运行方案。为定义泳道，请选择无染色印迹图像的泳道及条带。然后使用自动条带识别功能以实现准确定量。通过将滚动圆盘大小调整为70，确保每个样品泳道的背景轮廓相似。通过扫描所有泳道轮廓，确认背景均匀性，从而在二甲基六氯50和549通道中定义条带。使用条带查找工具，采用默认灵敏度设置来检测条带。要指定归一化通道，请返回分析工具箱。点击归一化，选择免染印迹，并确保已选中总蛋白上样量归一化选项。要指定分子量标准条带，请返回分析工具箱，点击分子量（MW）分析工具，并勾选相应条带下方的复选框。最后，要查看归一化后的蛋白质条带强度，请点击工具栏中的分析表格。软件将自动生成一个包含体积强度、归一化因子和归一化体积的表格。应使用归一化后的体积进行数据分析和报告。该表格可导出。为进一步分析，我们展示了完整的 V 三重 Western 印迹实验流程。现在我们将向您展示一个真实实验的代表性结果。使用 V three 蛋白质印迹流程分析了对照组和经辐射处理的淋巴母细胞培养物的裂解液。无染料总蛋白信号以蓝色显示。目标蛋白 M CM seven 显示为红色，经验证的内参蛋白加载对照 GA DH 显示为绿色。通过使用本视频中所述实验条件评估其线性，已验证 GA DH 是一种合适的加载对照。每个泳道的无染色总蛋白信号通过 Image Lab 软件进行测定。使用总蛋白和GA DH信号对MCM7的信号强度进行了归一化处理。通过两种方法归一化后的MCM7蛋白条带体积显示，与对照样本相比，经辐照样本中MCM7的表达水平降低了25%，但此结果尚未经过准确的归一化验证。看家蛋白的使用需通过验证，以确认其在各样本中的表达水平一致，且处于线性检测范围内。内参蛋白上样对照并不能保证准确的归一化。相比之下，总蛋白归一化则无需额外验证。因此，在进行该实验流程时，V three 工作流程所获得的免染总蛋白信号提供了一种更实用、便捷且可靠的上样对照方法。请记住，免染技术可通过紫外线诱导对可及的色氨酸残基进行共价修饰，从而实现蛋白质样品的荧光可视化。仅在极少数情况下，这种修饰会显著影响后续应用，如免疫检测或质谱分析。观看本视频后，您应充分了解如何执行 V3 Western 实验流程以及免染总蛋白归一化方法。尽管我们以多重荧光 Western 印迹法展示了该工作流程，但无染料技术也可用于化学发光 Western 印迹中的总蛋白归一化。

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