用于蛋白质印迹中实用、便捷且可靠的总蛋白上样对照的 V3 免染工作流程

BioRad V three 工作流程为研究人员提供了更可靠的定量结果以及对 Western 印迹过程的更高置信度。该流程首先使用 TGX 免染色凝胶分离并可视化蛋白质样品。分离后，蛋白质通过 Blot Turbo 快速转膜系统转移至膜上，从而可验证转膜的质量与效率。

在确认转膜后，使用封闭液封闭膜，并用针对目标蛋白的一抗和二抗进行孵育。最后，利用免染总蛋白检测作为上样对照，对目标蛋白水平进行归一化处理。V3 工作流程为蛋白质印迹实验带来了便捷性与透明度，使研究人员从分离、转膜到定量的每一步都更加可靠可信。

与传统的蛋白质印迹技术相比，V three Western 实验流程的主要优势在于，免染技术为靶蛋白信号的归一化提供了实用、便捷且可靠的总蛋白上样对照。该方法有助于解答与蛋白质印迹技术中上样对照方法可靠性相关的关键问题，特别是涉及内参蛋白信号过饱和以及在不同实验条件下内参蛋白表达水平差异的问题。我们发现，在免染凝胶中激活的蛋白质也可直接在印迹膜上可视化，无需进一步染色，因此可作为传统总蛋白染色以及内参蛋白上样对照的替代方案。

在接下来的几分钟内，我们将演示使用多重荧光技术完成完整的 V three 工作流程。在根据文本方案制备蛋白质样品后，该相同程序也可用于化学发光检测。使用 Criterion TGX Stain-Free Any kD 预制胶时，从凝胶盒底部取下梳子和底部封条。

将胶盒放入电泳装置中，并在两个电泳槽中加入电泳缓冲液。上样蛋白标准品和样品，然后在300伏电压下电泳运行20分钟。

电泳完成后，使用 Criterion Cell 盖子上的胶片夹开启工具打开夹具。然后在 Chemi Dock MP 成像仪的紫外透射仪上加入几毫升水。小心地将凝胶从夹具中取出，并放置在紫外透射仪上。启动 Image Lab 软件，使用默认的一分钟活化时间设置一个新的单通道染色免标记凝胶程序，选择合适的凝胶类型，并选择默认的自动优化以获得强条带。

然后点击运行程序。图像采集完成后，立即观察分离情况和样品质量，并立即进入转膜步骤。

进行蛋白质转膜时，打开一个转膜缓冲液预浸润的Turbo MIDI PVDF转膜套装。将底部叠层置于 cassette 底座中央。从成像仪中取出凝胶。

将凝胶对齐放置在膜的上方。轻轻使用印迹滚轮去除凝胶与膜之间的气泡。接着，将上层叠层对齐放置在凝胶上方。

去除所有气泡后，将盒盖盖在底座上。用力下压盖子，顺时针旋转旋钮以锁定，然后将盒体插入两个印迹槽中的任意一个。从主界面选择 turbo 程序。

选择两个小型凝胶或一个小型凝胶，然后按下相应槽位的运行按钮。七分钟后转移将完成。从槽位中取出卡盒。

打开夹具并拆解转印夹心结构。将转膜后的凝胶放置于 Chemi dock MP 成像仪的紫外透射仪上，并立即将膜放入去离子水中。为免染凝胶设置一个新的单通道程序，无需激活时间。

选择合适的凝胶类型，并手动将曝光时间设置为转膜前凝胶的曝光时间，然后点击运行程序。图像采集完成后，通过比较转膜前后凝胶中样品条带的强度来验证转膜效率。

移除样品托盘中的凝胶，因其已不再需要，予以丢弃。为确认结果，将样品转移至印迹膜。将膜放置在样品托盘上，并建立一个新的单通道程序。

对于免染蛋白印迹，请选择合适的凝胶类型，并对强条带采用默认的自动优化设置，然后点击运行程序。

图像采集完成后，验证条带是否已转移至膜上。将印迹膜从紫外透射仪上取下，放入封闭缓冲液中，用于后续的蛋白质印迹实验。将膜在室温下孵育一小时后，于次日加入小鼠和兔的一抗，在4摄氏度下孵育过夜。

倒出抗体溶液，用 50 毫升 TBST 室温洗膜 5 分钟。将膜与荧光标记的抗小鼠和抗兔二抗在室温下孵育 1 小时。然后用 TBST 洗膜 5 次，每次 5 分钟。

为了成像印迹，将其放置在 Chemi doc MP 成像仪的透射紫外光源上，在 Image Lab 软件中操作。建立一个新的多通道检测程序。通过在印迹应用中选择 dite six 50 来配置通道一，并对强条带使用默认的自动优化功能。

重复上述步骤，分别为 DITE 5 49 和免染蛋白印迹配置第二和第三通道。选择合适的凝胶类型，然后点击运行程序。通过选择免染蛋白印迹图像的泳道及条带，来定义泳道。

然后使用自动泳道识别功能以实现精确量化。通过将滚动圆盘大小调整为70，确保每条样品泳道的背景轮廓相似。通过扫描所有泳道轮廓，确认背景均匀性，从而在dite six 50和5 49两个通道中定义条带。

使用条带查找工具，采用默认灵敏度设置来检测条带。要指定归一化通道，请返回分析工具箱。点击归一化，选择免染印迹，并确保已选中总泳道蛋白。

要指定分子量标准条带，请返回分析工具箱，点击分子量（MW）分析工具，并勾选相应泳道下方的复选框。最后，要查看归一化后的蛋白质条带强度，请点击工具栏中的分析表格。软件将自动生成一个包含体积强度、归一化因子和归一化体积的表格。

应使用归一化体积进行数据分析和报告。该表格可导出。为进一步分析，我们展示了完整的V三印迹（Western blotting）工作流程。

现在我们将向您展示一个真实实验的代表性结果。使用 V 三种 Western 印迹实验流程分析了对照组和经辐射处理的淋巴母细胞培养物的裂解液。无染色总蛋白信号以蓝色显示。

目标蛋白M CM seven以红色显示，经验证的内参蛋白上样对照GA DH以绿色显示。通过使用本视频中所述的实验条件评估其线性，已验证GA DH是合适的上样对照。每个泳道的免染总蛋白信号使用Image Lab软件进行测定。

使用总蛋白和GA DH信号对MCM7的信号强度进行归一化。通过这两种方法归一化的MCM7蛋白条带体积显示，与对照样本相比，在准确归一化前，辐照样本中的表达水平降低了25%。看家蛋白需要经过验证，以确认其在线性范围内，并且在各样本间的表达水平保持一致，否则无法用于归一化。

内参蛋白上样对照并不能保证准确的归一化。相比之下，总蛋白归一化无需额外验证。因此，在进行该实验流程时，V three 工作流程所获得的免染总蛋白信号提供了一种更实用、便捷且可靠的上样对照方法。

请记住，免染技术可通过紫外线诱导对可利用的色氨酸残基进行共价修饰，从而实现对蛋白质样品的荧光可视化。仅在极少数情况下，这种修饰会显著影响后续应用，如免疫检测或质谱分析。观看本视频后，您应能够充分理解如何执行 V three Western 实验流程以及免染总蛋白归一化方法。

尽管我们以多重荧光 Western 印迹法展示了该工作流程，但无染色技术也可用于化学发光 Western 印迹中的总蛋白归一化。