Name: 鉴定蛋白质 - 蛋白质相互作用的果蝇成人头由串联亲和纯化（TAP） (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-05T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: 学习串联亲和纯化（TAP）方法用于鉴定果蝇大脑中的蛋白质相互作用。该技术通过两轮纯化步骤富集特异性蛋白复合物，并利用质谱分析进行鉴定，为神经科学研究提供可靠的生化分析工具。

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我们感谢EUROSARF向我们提供了酵母TAP表达质粒。同时感谢Ryan Labadens在编辑方面提供的帮助。本工作获得了美国国立卫生研究院神经疾病与中风研究所资助（R01NS070962）的支持，资助对象为C.W.。

1. 构建UAS-TAP标签转基因果蝇
<ol>
	<li>构建pUAST-TAP标签DNA载体。
	<ol>
		<li>根据诱饵蛋白的结构/功能，确定TAP标签应融合至该蛋白的N端或C端。详见讨论部分。</li>
		<li>将目的基因的cDNA编码区亚克隆至pUAST-NTAP或pUAST-CTAP载体的多克隆位点（MCS），分别构建N端或C端标签的UAS-TAP转基因。参见 图1 以获取详细图谱以及可用的限制性酶切位点和阅读框。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>生成UAS-TAP标签转基因果蝇。
	<ol>
		<li>采用P元件介导插入法，按照标准方案制备转基因果蝇11目前有多种注射服务可供商业选择。</li>
		<li>交叉神经元GAL4驱动器（即 BG380-GAL4）与每个独立的转基因品系杂交，并通过蛋白质印迹法（使用过氧化物酶抗过氧化物酶抗体）和/或免疫染色（使用抗TAP抗体）确定各品系的蛋白表达水平。通常建议选择蛋白表达水平接近内源性蛋白的转基因品系 &#160;TAP 实验步骤。详见讨论部分。</li>
		<li>利用基因的失活突变体进行基于GAL4/UAS系统的拯救实验，以验证TAP标签转基因的功能性。选择能够显著挽救突变体表型的转基因用于后续TAP实验。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 准备TAP实验步骤所需的样品
<ol>
	<li>构建一个同时携带神经元GAL4驱动器的果蝇品系（例如 BG380-Gal4）以及选定的TAP标签转基因，以方便果蝇样本的扩增。当上述组合导致存活或生长劣势时，极少情况下需收集GAL4驱动系与UAS-转基因杂交产生的F1代子代。</li>
	<li>收集小规模样品，并优化裂解条件以溶解TAP标签蛋白。
	<ol>
		<li>使用非离子型去污剂 NP-40（0.1–1%）、NaDOC（0.1–1%）和 Triton X-100（0.05–0.5%）组合配制一系列裂解缓冲液。参见 表1 如需更多信息，请参见讨论部分。</li>
		<li>在CO2垫上，使用5号镊子从表达TAP转基因的果蝇中解剖20个成年头部，并收集至1.5 ml离心管中，用于测试每种裂解缓冲液条件。</li>
		<li>向离心管中加入100 μl检测裂解缓冲液，用塑料研磨棒上下抽动研磨头部组织，然后加入另外100 μl检测缓冲液。</li>
		<li>在 4 °C 条件下以 21,500 x g 离心 10 分钟，离心后分离上清液和沉淀。加入 25 μl 2x&#160;SDS上样缓冲液至沉淀中，再加入10 μl 4x&#160;分别向30 μl上清液中加入SDS上样缓冲液。</li>
		<li>将两个样品煮沸5分钟，然后使用SDS-PAGE及随后的PAP抗体Western Blot进行并列分析。通过上清液中TAP-蛋白水平与沉淀中TAP-蛋白水平的比值来确定溶解度&#160;沉淀物。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>大规模制备样品
	<ol>
		<li>扩增并收集成年果蝇。
		<ol>
			<li>扩增神经元-GAL4/UAS-TAP-转基因品系，在培养瓶中培养，并每3天换瓶一次，直至累计使用250瓶用于收集。</li>
			<li>将羽化后1-3天的成年果蝇收集至50 ml锥形管中，立即将管子放入液氮中以深度冷冻果蝇。 &#160;将果蝇存放在 -80 °C 超低温冰箱中。注意果蝇的体积不得超过 50 ml 离心管容量的 2/3。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在粉状干冰上收集果蝇头部（此步骤需在粉状干冰上进行）。
		<ol>
			<li>从-80 °C超低温冰箱中取出预冷的筛子和研钵研杵，置于干冰上，最好放在一个大的冰桶内。叠放两个美国标准试验筛，上层为25号筛，下层为40号筛。</li>
			<li>将冻存的果蝇取出，放入液氮中，保持约10分钟。&#160; 剧烈振荡或摇动试管，使头部、腿部和翅膀从身体上分离。</li>
			<li>将混合物倒入上层筛子中，然后双手握住两个筛子并用力振荡。筛分后，虫体会留在上层筛子上，果蝇头部将被截留在下层筛子上，而足、翅及其他碎屑则落入干冰中。分开两个筛子，小心地将果蝇头部转移至预冷的研钵中。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>匀浆果蝇头部
		<ol>
			<li>在干冰上用研钵和研杵将头部组织研磨成粉末状，然后将粉末转移至预冷的15 ml玻璃Dounce组织研磨器中&#160;置于冰上。</li>
			<li>在将头部样品倒入研磨器前后分别称量其重量，然后计算头部样品的净重。每次TAP实验可使用6–15克果蝇头部，具体用量需根据目标蛋白的表达水平进行调整。向粉末中加入15 ml预冷的匀浆缓冲液（即2.2步骤中优化的裂解缓冲液），先用大间隙研杵上下研磨，直至研杵在研磨器内可顺畅移动。整个操作过程中须始终将玻璃研磨器置于冰上。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>为TAP制备上清液
		<ol>
			<li>将匀浆转移至高速离心管中，在约 50,000 x g 条件下离心 20 分钟（4 °C）。将上清液转移至新的高速离心管中，再重复离心一次。</li>
			<li>将上清液转移至超速离心管中，进行40&#160;在约250,000 × g条件下离心，进一步澄清上清液。经超速离心后，上清液即可用于后续的串联亲和纯化步骤。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. TAP 纯化
以下部分源自Séraphin实验室的TAP方案12（http://web.as.uky.edu/Biology/faculty/rymond/BIO%20510/Bertran%20Seraphin%27s%20TAP%20page.pdf）
<ol>
	<li>进行IgG微珠亲和纯化
	<ol>
		<li>在样品离心的同时准备IgG Sepharose微珠。在15 ml Falcon管中用10 ml冷的IgG洗涤缓冲液洗涤400 µl IgG微珠，共洗涤3次。每次洗涤时，在摇床上轻轻振荡管子2分钟，然后在1,000 × g下离心2分钟使微珠沉淀。第三次洗涤结束后，移除上清液，仅保留管中的微珠。</li>
		<li>小心地将澄清的上清液（约15 ml）转移至含有IgG微珠的15 ml管中。将微珠与脑组织裂解液混合物在4 ºC下于旋转仪上孵育2小时。</li>
		<li>在冷室中设置一个洁净且空的微型层析柱，总体积约为15 ml。通过将混合物稳定地倒入柱中完成上样；注意避免在柱内截留气泡。让微珠在柱中自然沉降，并通过重力作用使缓冲液缓慢流出。</li>
		<li>当全部脑组织裂解液流经沉降的IgG柱后，用10 ml冷的IgG洗涤缓冲液彻底洗涤柱子，重复洗涤2次。注意：切勿让微珠暴露于空气中干燥。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行TEV酶切
	<ol>
		<li>第三次洗涤后，再用10 ml TEV酶切缓冲液洗涤柱子一次。此步骤用于将捕获了目标复合物的IgG微珠准备至适合TEV酶切的条件。</li>
		<li>当最后一滴TEV缓冲液即将滴出时，立即在柱子底部加盖以阻断流出，向柱中加入含130单位TEV酶的1.3 ml TEV缓冲液，然后严密封闭柱子顶部。确保柱子两端均密封良好。</li>
		<li>将柱子在18 ºC下旋转孵育2小时，使TEV酶在TEV识别位点处切割肽段，释放出蛋白复合物，同时使与IgG Sepharose微珠结合的蛋白A结构域肽段保留在柱上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行钙调蛋白（Calmodulin）微珠亲和纯化
	<ol>
		<li>在IgG微珠与TEV酶孵育的同时准备钙调蛋白微珠。在15 ml Falcon管中用10 ml冷的钙调蛋白结合缓冲液洗涤200 μl钙调蛋白微珠，共洗涤3次。每次洗涤时，在摇床上轻轻振荡2分钟，然后在1,000 × g下离心2分钟使微珠沉淀。第三次洗涤结束后，吸除全部缓冲液，仅保留管中的微珠。</li>
		<li>TEV酶切孵育结束后（步骤3.2.3），将IgG柱放回冷室并垂直放置，静置10分钟使微珠沉降。</li>
		<li>移除柱子顶部和底部的盖子，收集1.3 ml TEV酶切产物至一个15 ml Falcon管中，待缓冲液完全流出。再向柱中加入200 µl TEV缓冲液以冲洗柱内死体积，将流出液收集至同一管中。</li>
		<li>向上述收集的1.5 ml TEV酶切产物中加入4.5 ml钙调蛋白结合缓冲液和4.5 µl 1 M CaCl2。CaCl2的作用是中和TEV缓冲液中的EDTA。将6 ml混合液转移至含有钙调蛋白微珠的管中，在4 ºC下于旋转仪上旋转孵育1小时。</li>
		<li>在冷室中设置另一个洁净且空的微型层析柱，总体积约为10 ml。将钙调蛋白微珠混合物上样至柱中，让其依靠重力自然流出。</li>
		<li>当全部溶液流经沉降的钙调蛋白柱后，用10 ml冷的钙调蛋白结合缓冲液洗涤柱子两次。注意：避免扰动钙调蛋白微珠，洗涤过程中尽量保持微珠表面平整。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从钙调蛋白柱中洗脱目标复合物。 
	洗涤完成后立即使用五份200 µl冷的钙调蛋白洗脱缓冲液对钙调蛋白柱进行洗脱。每份洗脱液，轻轻加入200 µl至柱中，并用标记好的1.5 ml Eppendorf管收集洗脱液。重复此操作4次。</li>
	<li>通过SDS-PAGE分析蛋白复合物
	<ol>
		<li>从五个洗脱组分中各取少量等分试样（约30 µl），加入SDS上样缓冲液。将样品煮沸5分钟，随后在梯度（4–15%）SDS-PAGE凝胶中与蛋白质分子量标准品并排上样电泳。</li>
		<li>待样品在凝胶中完全分离后，停止电泳，并使用基于G-250的高灵敏度胶体考马斯亮蓝染色方法（如“蓝银染色”）对凝胶进行染色13。银染可选但不推荐，因其与后续质谱分析不完全兼容。&#160; 将剩余洗脱液保存于-80 °C冰箱中，用于进一步分析，例如通过质谱鉴定纯化蛋白复合物的分子组成。参见讨论部分。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Rigaut, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration.</a> Nat. Biotechnol. 17, 1030-1032 (1999).</li>
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<li>Puig, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tandem+affinity+purification+%28TAP%29+method%3A+a+general+procedure+of+protein+complex+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification.</a> Methods. 24, 218-229 (2001).</li>
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<li>Wu, C., Daniels, R. W., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DFsn+collaborates+with+Highwire+to+down-regulate+the+Wallenda%2FDLK+kinase+and+restrain+synaptic+terminal+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">DFsn collaborates with Highwire to down-regulate the Wallenda/DLK kinase and restrain synaptic terminal growth.</a> Neural Dev. 2, 16(2007).</li>
<li>Tian, X., Li, J., Valakh, V., DiAntonio, A., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Rae1+controls+the+abundance+of+the+ubiquitin+ligase+Highwire+in+post-mitotic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Drosophila Rae1 controls the abundance of the ubiquitin ligase Highwire in post-mitotic neurons.</a> Nat. Neurosci. 14, 1267-1275 (2011).</li>
<li>Burckstummer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+tandem+affinity+purification+procedure+for+interaction+proteomics+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">An efficient tandem affinity purification procedure for interaction proteomics in mammalian cells.</a> Nat. Methods. 3, 1013-1019 (2006).</li>
<li>Kyriakakis, P., Tipping, M., Abed, L., Veraksa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+affinity+purification+in+Drosophila%3A+the+advantages+of+the+GS-TAP+system%5BTitle%5D)+AND+%22Fly%22%5BJournal%5D)">Tandem affinity purification in Drosophila: the advantages of the GS-TAP system.</a> Fly. 2, 229-235 (2008).</li>
<li>Bailey, D., Urena, L., Thorne, L., Goodfellow, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+protein+interacting+partners+using+tandem+affinity+purification%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Identification of protein interacting partners using tandem affinity purification.</a> J. Vis. Exp. (60), e3643(2012).</li>
<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+model+for+Angelman+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A Drosophila model for Angelman syndrome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 12399-12404 (2008).</li>
<li>Liao, L., McClatchy, D. B., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shotgun+proteomics+in+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Shotgun proteomics in neuroscience.</a> Neuron. 63, 12-26 (2009).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

串联亲和纯化（TAP）方法提供了一种双重纯化流程，可通过两个独立的亲和纯化步骤实现蛋白质复合物的分离与富集。TAP标签的设计并不局限于本方案中所展示的形式，只要相应调整缓冲条件，其他蛋白质结合结构域和基序也可适用。其他TAP标签的一个良好示例是GS-TAP标签，该标签由G蛋白和链霉亲和素结合基序组合而成，由Giulio Superti-Furga研究团队设计，旨在从培养的哺乳动物细胞系中纯化蛋白质复合物18. GS-TAP 随后被改进用于研究蛋白质-蛋白质相互作用 黑腹果蝇 S2 细胞和胚胎19. Bailey最近在JoVE上发表的一篇文章&#160;等 展示了如何使用细胞培养裂解液进行GS-TAP实验步骤20在此，我们介绍了TAP标签的应用 果蝇 用于大规模蛋白质组筛选的神经组织（成年果蝇头部）。该方案可潜在适用于其他允许大规模样本收集的组织，例如胚胎。在步骤2.3.2.3中收集于上层筛网的成年虫体也可用于TAP实验，但可能具有较大挑战性。必须修改并优化裂解缓冲液，以最大程度抑制消化道中大量存在的蛋白酶，同时显著缩短...

定义介导特定生物学过程的分子通路或分子网络是生物医学研究的最终目标之一。果蝇遗传学家长期以来主要依赖正向遗传学方法，尤其是修饰基因筛选（包括增强子和抑制子筛选），来鉴定与目标基因协同作用、平行作用或位于其上下游的因子。然而，正向遗传学筛选往往难以鉴定出必需基因——这些基因发生突变时会导致早期发育阶段致死；也难以发现具有功能冗余和补偿机制的基因——其功能缺失仅引起细微表型，难以被准确识别。克服这一难题的一种策略是筛选蛋白质间的直接相互作用。十余年来，一系列生物化学方法不断发展，包括酵母双杂交、噬菌体展示、化学交联、免疫共沉淀（Co-IP）、串联亲和纯化（TAP）， 等等.&#160;已用于研究蛋白质-蛋白质相互作用。这些方法在灵敏度和特异性方面各有其优势与局限性。&#160; 其中，TAP 方法能够在接近生理条件下检测物理相互作用， &#160;保持特异性和一致性2&#160;并具备扩展至高通量分析的能力3,4.
TAP 方法最初由 Rigaut 及其同事在酵母中开发1。该方法中，目标蛋白与 TAP 标签融合表达。TAP 标签包含两个独立的亲和结合结构域：一个可结合 IgG 的蛋白 A 结构域和一个钙调蛋白结合结构域。这两个结构域之间由烟草蚀刻病毒（TEV）蛋白酶切割位点分隔。这种组合可实现两轮独立的亲和纯化，从而充分减少非特异性结合并富集特异性结合蛋白1。因此，TAP 方法是一种非常强大的用于鉴定特定蛋白在体（in vivo）相互作用的技术，尽管外源蛋白的过表达可能导致其与正常情况下不形成复合物的蛋白发生结合。自该方法建立以来，已广泛应用于多种其他系统，包括基于细胞培养的系统5,6以及其他在体（in vivo）模型系统6–9。本文中，我们描述了 TAP 方法在果蝇（Drosophila）中的应用。我们首先构建了 pUAST-NTAP 和 pUAST-CTAP 载体，以便将 TAP 标签与目标基因的 N 端或 C 端融合克隆。随后，在神经元特异性 GAL4 驱动子10的控制下，于神经系统中表达 UAS-TAP 标签的转基因。接下来，收集大量成年果蝇头部，这些组织富含神经细胞，且在冷冻后可根据大小差异方便地与其他身体部分分离。将成年果蝇头部进行匀浆，并通过连续离心澄清，所得上清液用于下述 TAP 纯化流程。

<table><tbody><tr><td>美国标准试验筛 No. 25</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-881-18</td><td></td></tr><tr><td>美国标准试验筛 No. 40</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-881-21</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Kontes Dounce 组织研磨器 15 ml</td><td>Kimble Chase</td><td>885300-0015</td><td></td></tr><tr><td>IgG sepharose 微珠</td><td>Pharmacia</td><td>17-0969-01</td><td></td></tr><tr><td>Econo-column 0.7 cm x 20 cm</td><td>Bio-Rad</td><td>737-4721</td><td></td></tr><tr><td>Econo-column 0.5 cm x 15 cm</td><td>Bio-Rad</td><td>737-4716</td><td></td></tr><tr><td>钙调蛋白微珠</td><td>Stratagene</td><td>214303</td><td></td></tr><tr><td>Coors 研钵和研杵</td><td>CoorsTek</td><td>60311</td><td></td></tr><tr><td>AcTEV 蛋白酶</td><td>Invitrogen</td><td>12575-015</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合液</td><td>Roche</td><td>11836153001</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Sigma</td><td>P8340</td><td></td></tr></tbody></table>

鉴定蛋白质-蛋白质相互作用 果蝇 通过串联亲和纯化（tap）法纯化成年果蝇头部蛋白复合物

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

使用遗传筛选进行 黑腹果蝇 （果蝇）在推动生物科学进步方面已促成多项里程碑式发现。然而，旨在扩展遗传学分析所获知识的生化筛选方法，直到最近才被探索。本文描述了一种从成年果蝇头部纯化与任意目标蛋白相互作用的蛋白复合物的方法。该方法利用了 果蝇 利用GAL4/UAS系统在果蝇神经元中表达与串联亲和纯化（TAP）标签融合的诱饵蛋白 体内，然后采用类似于最初在酵母中建立的TAP方法进行两轮纯化1 用于纯化相互作用的蛋白质复合物。该流程结束后，可获得包含多种蛋白质复合物的混合物，其分子组成可通过质谱分析确定。候选蛋白质的验证将受益于果蝇中基因功能缺失研究的资源丰富性和操作便利性。类似的方法也可应用于其他果蝇组织。我们相信，在果蝇模型系统中结合遗传操作与蛋白质组学方法，将在神经生物学领域及其他基础科学问题的研究中展现出巨大潜力。

在此，我们展示了在果蝇大脑中鉴定与Highwire相互作用蛋白的研究工作。Highwire（Hiw）及其在脊椎动物和无脊椎动物中的同源蛋白均为大型泛素连接酶，可调控神经系统的发育与修复14它们共享多个高度保守的功能结构域，但其分子作用机制尚不完全明确。在蠕虫、果蝇和小鼠中开展的研究建立了目前的工作模型，即Hiw作为一种E3泛素连接酶和支架蛋白发挥作用，通过与不同的辅助因子相互作用并靶向不同的泛素底物，促进多亚基泛素化复合物的形成，从而调控具有时间和细胞类型特异性的神经元功能。为了鉴定与Hiw相关的泛素化复合物，我们首先构建了一个N端标记的UAS-TAP-Hiw转基因，该转基因在挽救突变表型方面完全具备功能 hiw 突变表型15约10克仅表达TAP或表达TAP-Hiw转基因蛋白的成年果蝇头部被收集，并平行进行上述TAP操作。两次纯化所得的最终洗脱液经SDS-PAGE分离后进行银染分析。质谱鉴定出仅在TAP-Hiw样本中存在的一组蛋白，包括 果蝇 FSN（DFsn，一种F-box蛋白）和Rae1（图2）。随后的遗传学和生化分析表...

Drosophila 因其强大的遗传操作能力而闻名，但并不以适合深入的生化分析著称。本文介绍一种基于TAP的方法，用于从果蝇大脑中鉴定任何目标蛋白的相互作用伙伴。该方法有望为研究开辟新的途径。

鉴定蛋白质-蛋白质相互作用 果蝇 通过串联亲和纯化（TAP）法纯化成年果蝇头部蛋白复合物

利用黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）开展的遗传筛选在推动生物科学进步方面取得了 numerous 里程碑式发现。

本实验的总体目标是从果蝇成虫大脑中纯化出与目标基因在体内相互作用的蛋白质。首先需要构建表达TAP标签诱饵蛋白的转基因果蝇，并收集这些果蝇的成虫头部。第二步是从果蝇头部裂解液中制备上清液，用于后续的TAP纯化流程，然后依次进行免疫球蛋白G亲和纯化、TEV蛋白酶切割以及钙调蛋白亲和纯化。将点样步骤最后一步收集的五个进化产物，连同全脑裂解液和蛋白复合物一起，在TEV酶切后通过SDS-PAGE分离，并经银染显色观察。最终，第二次洗脱产物通常用于质谱分析以鉴定蛋白质。与现有的 TAL 杂交和核心 IP 实验等方法相比，该技术的主要优势在于，TAP 检测到的蛋白质-蛋白质相互作用是在接近生理条件下发生的，有助于保持这些相互作用的特异性。通过两轮纯化步骤，可富集特异性结合的蛋白复合物，并降低假阳性率。本实验操作将由我实验室的一名博士后 bway 演示。开始此操作前，需在培养瓶中扩增神经元GAL四UAS tap转基因品系，每三天换一次培养瓶，直至共使用250个培养瓶用于收集。将1至3日龄的成年果蝇收集至50毫升锥形管中，并立即将锥形管放入液氮中，使果蝇迅速深度冷冻。随后将果蝇存放在-80摄氏度冰箱中保存。从零下80摄氏度冰箱中取出两个预先冷却的美国标准试验筛和一套研钵与研杵，放入装有粉末状干冰的大冰桶中。然后将25号筛置于40号筛上方，在冰桶中叠放。从冰箱中取出冷冻的果蝇后，将其放入液氮中约10分钟。完成后，用力振荡离心管，使果蝇的头部、腿部和翅膀与身体分离。接着，将混合物倒入上方筛子中，双手握住两个筛子并用力振荡。完成后，将两个筛子分开，小心地将底部筛子中的果蝇头部转移到置于冰桶内干冰上的预冷研钵中，用研杵将头部研磨成粉末状，然后将粉末转移至预先冷却并预先称重的15毫升玻璃组织研磨器中。然后称量装有头部样品的研磨器重量，计算出冰上玻璃研磨器中头部样品的净重。向粉末中加入15毫升预先制备的冰预冷的匀浆缓冲液，使用大间隙研杵上下推动，直至研杵能轻松在研磨器内移动。随后，将匀浆液转移至高速离心管中，在4°C条件下以约50,000 × g离心20分钟。操作完成后，将上清液转移至新的高速离心管中。重复离心后，将上清液转移至超速离心管中，在4°C条件下以约250,000 ×g离心40分钟。在样品离心的同时，为进一步澄清上清液，将400 µL的免疫球蛋白G Sphero磁珠转移至15 mL Falcon管中。加入10毫升冷的免疫球蛋白G洗涤缓冲液后，轻轻摇动试管两分钟。完成后，以1000 × g离心两分钟使磁珠沉淀。重复此步骤两次后，移除缓冲液，离心后仅保留试管中的磁珠。小心地将约15毫升澄清的上清液转移至含有免疫球蛋白G珠的离心管中。将珠子与脑组织裂解液混合物在4°C下于旋转仪上孵育2小时。在冷室中，准备一个洁净且空的15毫升微柱。通过将免疫球蛋白G珠混合物稳定地倒入柱中完成上样。当

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鉴定蛋白质 - 蛋白质相互作用的<em&gt;果蝇</em&gt;成人头由串联亲和纯化（TAP）

本文介绍了一种用于鉴定酿酒酵母（Saccharomyces...

酿酒酵母中利用定量蛋白质组学鉴定蛋白质复合物

串联亲和纯化是一种用于鉴定蛋白质结合伴侣的可靠方法。作为概念验证，该方法已应用于研究较为深入的翻译起始因子...

使用串联亲和纯化鉴定蛋白质相互作用伙伴

结合质谱技术的标签蛋白亲和纯化（APMS）是一种强大的方法，可用于系统性绘制蛋白质相互作用网络，并研究生物过程的分子机制基础。本文中，我们描述了一种为大肠杆菌（Escherichia...

蛋白质复合物的鉴定 大肠杆菌 使用连续肽亲和纯化与串联质谱联用技术

本视频展示了串联亲和纯化技术——一种用于从真核细胞中纯化蛋白质复合物以研究蛋白质-蛋白质相互作用的方法。该复合物包含两种带有不同表位标签的蛋白质。通过依次使用两种对不同标签具有亲和力的树脂纯化该复合物后，若在洗脱液中同时检测到这两种蛋白质，则可证实二者之间存在相互作用。...

串联亲和纯化实验用于研究蛋白质-蛋白质相互作用

本视频展示了利用邻近连接实验（Proximity Ligation Assay,...

蛋白质-蛋白质相互作用的检测 果蝇 使用邻近连接实验检测幼虫

多组分蛋白质复合物在细胞功能与发育过程中发挥着关键作用。本文介绍一种用于分离天然蛋白质复合物的方法 黑腹果蝇 胚胎发育后 体内 交联后纯化交联复合物，用于后续的结构-功能分析。<br...

一种用于从 Drosophila 胚胎中分离蛋白质复合物的 in vivo 交联方法

利用高密度功能性蛋白质微阵列检测蛋白质-蛋白质相互作用

MyoD 是一种成肌转录因子，具有强大的能力可诱导多种完全分化的非肌肉细胞系发生成肌转分化。参与该转分化过程的表观遗传学机制在很大程度上尚不清楚。本文介绍了一种双重亲和纯化方法，随后进行质谱分析，以全面表征 MyoD...

利用串联亲和纯化联合质谱技术鉴定MyoD相互作用组

串联亲和纯化（TAP）方法已广泛用于从细胞提取物（主要是真核细胞）中分离天然复合物，以进行蛋白质组学研究。本文介绍了一种经过优化的TAP方法实验方案，适用于为结构研究纯化天然复合物。...

使用串联亲和标签法纯化用于结构研究的天然复合物

本文介绍一种新颖、稳健且高效的串联亲和纯化（TAP）方法，用于从真核细胞中表达、分离和表征蛋白质复合物。该方案可用于对特定复合物进行生物化学表征，以及鉴定调控其功能的新型相互作用蛋白和翻译后修饰。...

从真核细胞中对蛋白质复合物进行串联亲和纯化

本实验方案的目的是提供一种简单且低成本的方法，用于中等规模（0.5–1...

中等规模制备 果蝇 用于蛋白质组学实验的胚胎提取物

学习串联亲和纯化（TAP）方法用于鉴定果蝇大脑中的蛋白质相互作用。该技术通过两轮纯化步骤富集特异性蛋白复合物，并利用质谱分析进行鉴定，为神经科学研究提供可靠的生化分析工具。

鉴定蛋白质-蛋白质相互作用果蝇通过串联亲和纯化（TAP）法纯化成年果蝇头部蛋白复合物

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鉴定蛋白质-蛋白质相互作用 果蝇 通过串联亲和纯化（TAP）法纯化成年果蝇头部蛋白复合物

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