Name: 用生命染增强荧光成像瘤在Barrett食管诊断 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-11T16:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: 了解生命染料增强荧光成像技术用于Barrett食管诊断的方法。该技术利用外源性局部荧光对比剂高分辨率成像，清晰显示腺体形态并勾画肿瘤病变，为非侵入性检测食管发育不良和腺癌提供有效手段。

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本工作由美国国立卫生研究院国家癌症研究所资助，项目编号为 R01 CA140257-01。

注意： 已获得患者的知情同意。此外，本研究的开展均遵守所有与人类福祉相关的机构、国家和国际指南。
1. 准备计算机
<ol>
	<li>打开笔记本电脑，并将 USB 线连接到 DVI2USB 采集卡。</li>
</ol>
2. 准备监测设备
<ol>
	<li>将DVI电缆连接至显示器，并连接画中画（PinP）功能，以便内窥镜医师能够直接从这些屏幕而非计算机查看视频。</li>
	<li>确保立式显示器已开启，并设置为DVI输入模式。</li>
	<li>将画中画（PinP）连接到奥林巴斯系统背面，然后按下奥林巴斯系统上的输入按钮，以在墙上安装的大型显示器上查看图像。</li>
</ol>
3. 激光二极管驱动器设置
<ol>
	<li>检查并确保激光二极管驱动器处于关闭状态。仅在开始成像前几分钟才可打开。</li>
</ol>
4. 电源插座
<ol>
	<li>将笔记本电脑、处理器、激光二极管驱动器、DVI 分流器和 Epiphan 采集卡插入电源插座。</li>
</ol>
5. 在笔记本电脑桌面上运行 MDE 宽场成像
<ol>
	<li>点击“当前文件夹”。</li>
	<li>输入患者编号和姓名首字母，然后点击“创建患者文件夹”。</li>
</ol>
6. 准备帽和滤器
<ol>
	<li>处理滤膜时，务必佩戴手套并使用无尘纸（Kimwipes），以尽量减少油脂和碎屑转移到滤膜上。纱布或酒精棉片可能留下纤维，干扰成像。</li>
	<li>在桌面上放置几张无尘纸，作为放置滤膜和盖帽的操作平台。该消毒区域应在操作过程中便于内镜医师取用。</li>
	<li>将滤膜和盖帽平放于平台上，并在附近备好无尘纸，以便操作过程中使用。</li>
</ol>
7. 患者准备
<ol>
	<li>在患者进入内镜室前，告知其将使用VFI和荧光素钠染料并获得知情同意。&#160;</li>
	<li>为患者摆放上消化道内镜检查体位。</li>
	<li>使用多光谱数字显微镜（MDM）进行标准白光成像7。</li>
</ol>
8. 插入并喷洒普鲁黄
<ol>
	<li>完成白光成像后，将吖啶黄染料喷洒至目标组织区域。根据巴雷特食管组织的范围，喷洒面积约为1–5 mm即可。在此步骤中喷洒吖啶黄染料，可在进行虚拟显微内镜（VFI）前留出充足时间（至少1分钟），以确保组织充分吸收。吖啶黄是一种荧光对比剂，已纳入美国食品药品监督管理局（FDA）的试验性新药申请（IND 102,217）监管范围，其在施用后可迅速在细胞核内聚集。尽管虚拟显微内镜无法分辨单个细胞的形态，但当激光二极管扫描组织时，反射光可使内镜医师观察到整体的腺体结构形态。</li>
</ol>
9. 打开激光二极管
<ol>
	<li>打开激光二极管。在开始成像前至少提前 2 min&#160;进行此操作。</li>
</ol>
10. 为VFI准备内窥镜
<ol>
	<li>完全撤出内窥镜。</li>
	<li>在操作内窥镜之前，确保助手已戴上两副手套。</li>
	<li>让内窥镜操作者将内窥镜持于助手前方，助手应位于上述Kimwipe操作平台旁。</li>
	<li>使用Kimwipe纸，由助手清洁内窥镜的顶端。注意轻柔擦拭前端表面，并沿内窥镜侧面清洁数厘米，以便后续操作。</li>
	<li>清洁完成后，让助手丢弃外层的一副手套。</li>
	<li>让助手安装滤膜：将滤膜上的短圆柱形突起插入内窥镜上对应的孔中。保持内窥镜处于垂直状态，以利于安装。</li>
	<li>固定好滤膜后，将保护帽套在滤膜上，并向下推至内窥镜顶端。确保保护帽安装牢固，完全推到底，边缘与内窥镜齐平；保护帽的边缘应略微覆盖内窥镜顶端；最后确认滤膜仍处于原位，并与内窥镜顶端齐平。</li>
</ol>
11. 将内窥镜重新插入食管并进行成像
12. 从食管中取出内窥镜
<ol>
	<li>使用擦镜纸小心地取下内窥镜的端帽和滤膜。丢弃端帽，并清洁滤膜以供下一个病例使用。&#160;</li>
</ol>
13. 清洁滤膜
<ol>
	<li>用无尘纸轻轻擦拭滤膜。</li>
	<li>取少量 Cydex 倒入小杯中，将滤膜完全浸入其中，浸泡 12 分钟。每隔几分钟&#160;将滤膜翻转一次。</li>
	<li>用无尘纸轻轻擦拭滤膜。</li>
	<li>将滤膜浸入无菌水中。5 分钟后，使用喷瓶将无菌水轻轻喷洒在滤膜表面。</li>
	<li>将滤膜放置在几张无尘纸上，使其自然晾干。</li>
	<li>待滤膜完全干燥后，将其夹在无尘纸之间，放入储存容器中保存。</li>
</ol>

<ol><li>Modiano, N., Gerson, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barrett%27s+Esophagus%3A+Incidence%2C+etiology%2C+pathophysiology%2C+prevention+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Therapeutics+and+Clinical+Risk+Management%22%5BJournal%5D)">Barrett's Esophagus: Incidence, etiology, pathophysiology, prevention and treatment.</a> Therapeutics and Clinical Risk Management. 3, 1035-1145 (2007).</li>
<li>Brown, L. M., Devesa, S. S., Chow, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+of+Adenocarcinoma+of+the+esophagus+among+white+Americans+by+sex%2C+stage%2C+and+age%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">Incidence of Adenocarcinoma of the esophagus among white Americans by sex, stage, and age.</a> Journal of the National Cancer Institute. 100, 1184-1187 (2008).</li>
<li>Siegel, R., Naishadham, D., Ahmedin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+Statistics%2C+2012%5BTitle%5D)+AND+%22A+Cancer+Journal+for+Clinicians%22%5BJournal%5D)">Cancer Statistics, 2012.</a> A Cancer Journal for Clinicians. 62, 10-29 (2012).</li>
<li>Vieth, M., Ell, C., Gossner, L., May, A., Stolte, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological+analysis+of+endoscopic+resection+specimens+from+326+patients+with+Barrett%27s+esophagus+and+early+neoplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Endoscopy%22%5BJournal%5D)">Histological analysis of endoscopic resection specimens from 326 patients with Barrett's esophagus and early neoplasia.</a> Endoscopy. 36, 776-781 (2004).</li>
<li>Pohl, H., Rosch, T., Vieth, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniprobe+confocal+laser+microscopy+for+the+detection+of+invisible+neoplasia+in+patients+with+Barrett%27s+oesophagus%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Miniprobe confocal laser microscopy for the detection of invisible neoplasia in patients with Barrett's oesophagus.</a> Gut. 57, 1648-1653 (2008).</li>
<li>Thekkek, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+video+endoscopy+for+in+vivo+cross-polarized+and+vital-dye+fluorescence+imaging+of+Barrett%27s-associated+neoplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Modular video endoscopy for in vivo cross-polarized and vital-dye fluorescence imaging of Barrett's-associated neoplasia.</a> Journal of Biomedical Optics. 18, 026007(2013).</li>
<li>Roblyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multispectral+optical+imaging+device+for+in+vivo+detection+of+oral+neoplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Multispectral optical imaging device for in vivo detection of oral neoplasia.</a> Journal of Biomedical Optics. 13, 024019(2008).</li>
<li>Egger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biopsy+surveillance+is+still+necessary+in+patients+with+Barrett%27s+oesophagus+despite+new+endoscopic+imaging+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Biopsy surveillance is still necessary in patients with Barrett's oesophagus despite new endoscopic imaging techniques.</a> Gut. 52, 18-23 (2003).</li>
<li>Thekkek, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vital-dye+enhanced+fluorescence+imaging+of+GI+mucosa%3A+metaplasia%2C+neoplasia%2C+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Gastrointestinal+Endoscopy%22%5BJournal%5D)">Vital-dye enhanced fluorescence imaging of GI mucosa: metaplasia, neoplasia, inflammation.</a> Gastrointestinal Endoscopy. 75, 877-887 (2012).</li>
<li>Muldoon, T. J., Anandasabapathy, S., Maru, D., Richards-Kortum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+imaging+in+Barrett%27s+esophagus%3A+a+novel%2C+low-cost+endoscopic+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Gastrointestinal+Endoscopy%22%5BJournal%5D)">High-resolution imaging in Barrett's esophagus: a novel, low-cost endoscopic microscope.</a> Gastrointestinal Endoscopy. 68, 737-744 (2008).</li>
</ol>

无任何披露内容。

在标准内镜监测下，巴雷特食管（BE）中的异型增生常常被遗漏8，因为良性化生与高级别异型增生及腺癌在形态上可能难以区分。作为一种有望帮助胃肠病专家克服当前不可避免的误判的工具，活体染料增强荧光成像通过突出组织的腺体形态，提供了区分不同类型组织的显著特征。此外，由于VFI可提供高达2.5 cm的视野，内镜医师能够更高效、系统地扫查整个远端食管，从而使可疑病变更加明显。
首先，在目标组织上喷洒局部对比剂荧光素。然后，在取出内窥镜后，需将一个495 nm长通滤光片牢固地安装在MDM尖端。 &#160;最后，将内窥镜重新插入至目标组织附近，然后从白光切换至激光二极管，即可观察到绿色荧光 体内 组织腺体结构的影像。
若持续出现荧光信号不理想的情况，可通过使用新鲜的普鲁黄染料、在实际使用前数分钟开启激光二极管并调节其电压来改善结果。此外，为确保患者安全，务必确认保护帽已完全推至滤光片上方，使滤光片与内窥镜顶端齐平。这将防止黏液在滤光片后方积聚，从而提升图像质量。
<p class="jove_...

在过去四十年中，食管腺癌（EAC）的发病率显著上升1,2；然而由于诊断较晚，其五年&#160;生存率不足20%3。目前对EAC癌前病变——巴雷特食管（BE）的标准内镜监测方法，是采用白光内镜结合对病灶节段进行随机四象限活检钳取样。然而，该技术常会遗漏病灶，因为早期肿瘤可能呈平坦、隐匿性改变，在标准白光成像下难以识别4。尽管共聚焦激光显微内镜已成功用于活体显示细胞特征in vivo，但由于视野较小，仍可能漏诊病变5。因此，若能有一种“桥梁”技术，可标记出需进一步进行共聚焦显微内镜检查的区域，将具有重要价值。
因此，一种能够增强对巴雷特食管（BE）中早期肿瘤进行靶向和活检能力的改进型警示成像技术，将有助于在早期可治愈阶段发现食管腺癌（EAC），并可能实现更有效的治疗，从而提高患者生存率。VFI 是一种新型技术，结合高分辨率上皮成像与外源性局部荧光对比剂普鲁黄，用于突出显示远端食管的腺体形态，并界定其中的肿瘤性病变（高级别异型增生和癌症），以期提高体内诊断的准确性6。普鲁黄在涂抹后可迅速富集于细胞核中，经激发后产生的荧光图像空间分辨率达 50 至 100 μm&#160;，视野范围最大可达 2.5 cm&#160;，使内镜医师能够清晰观察腺体结构。该技术使胃肠病学家能够区分典型的巴雷特化生——其特征为连续、均匀分布的腺体及整体均一的形态——与伴有肿瘤性病变的巴雷特食管，后者表现为腺体结构的破坏。本文描述了使用多光谱内镜实施该新技术的操作方案，并提供代表性结果，以展示该设备在呈现从良性化生向高级别异型增生及癌症形态转变过程中的应用价值。

<table><tbody><tr><td>滤光片*</td><td>Schott North America, Inc., Duryea, Pennsylvania</td><td>不适用</td><td>495-nm 长通滤光片</td></tr><tr><td> Halo Cap &amp;ndash; 中等*</td><td>Barrx Medical</td><td>CP-002A</td><td></td></tr><tr><td>处理器*</td><td>Pentax</td><td>EPK-i</td><td></td></tr><tr><td>多光谱数字显微镜**</td><td>不适用</td><td>不适用</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>KimTech Science</td><td>S-8115</td></tr><tr><td>Cidex</td><td>Advanced Sterilization Products&amp;nbsp;</td><td>CIDEX OPA 溶液</td><td></td></tr><tr><td>丙胺酸半硫酸盐（0.01% w/v）</td><td></td><td></td><td>FDA（研究性新药申请号 102,217）</td></tr><tr><td>激光二极管*</td><td>Nichia Corporation</td><td>不适用</td><td>455-nm</td></tr><tr><td>图像采集*</td><td>Labview</td><td>不适用</td><td></td></tr><tr><td>喷雾导管</td><td>Olympus</td><td>不适用</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">*详见参考文献6中的设备详细信息。**详见参考文献7中的设备详细信息</td></tr></tbody></table>

使用活体染料增强荧光成像诊断巴雷特食管中的肿瘤性病变

Diagnosis of Neoplasia in Barrett&#8217;s Esophagus using Vital-dye Enhanced Fluorescence Imaging

将巴雷特食管（Barrett’s Esophagus, BE）中的良性化生与异型增生进行鉴别诊断的能力 体内 由于两种组织在白光成像下均可能呈现平坦且难以区分的特征，因此仍存在诊断困难。因此，一种能够突出显示腺体结构的成像方式将有助于在远端食管中区分肿瘤性病变与良性上皮。VFI 是一种新型技术，采用外源性局部荧光对比剂来区分高级别异型增生及癌与良性上皮。具体而言，荧光图像可提供 50 至 100 μm 的空间分辨率。&#160;视野范围可达 2.5 cm，&#160;使内镜医师能够观察腺体形态。激发后，典型的巴雷特化生表现为连续、均匀分布的腺体结构及整体均一的形态；相比之下，肿瘤性组织则表现为腺体结构拥挤，腺体框架完全消失。本文概述了该技术所用设备，并详细列出了操作步骤。尽管虚拟荧光内镜（VFI）可为胃肠病医师提供可疑组织的腺体架构信息，但该成像方式无法分辨细胞水平的异型增生。因此，通过该成像方式在形态学上无法区分巴雷特化生与低级别异型增生的巴雷特食管（BE）。该成像系统以降低分辨率为代价换取更大的视野范围，至少可作为“红色警示”成像工具，用于定位和活检可疑病灶；若其诊断准确性得到验证，VFI有望成为远端食管肿瘤性病变（定义为高级别异型增生或癌症）诊断的标准成像技术。

图1B 显示典型的无异型增生的巴雷特食管，其周围被正常的鳞状上皮组织包绕。从位于周边、由蓝色箭头指示的较平坦的鳞状组织开始，可见一片均质的暗淡荧光区域，无腺体结构。绿色箭头指示一条环绕鳞状组织的环形绿色线条，此轮廓是内镜帽造成的伪影。转向位于中央的巴雷特组织，腺体结构表现为围绕较暗管腔的绿色荧光。尽管部分腺体呈拉长状，但相邻腺体之间几乎没有扭曲，腺体宽度相似，边缘清晰可辨。最后，腺体与管腔间距均匀，无成簇或拥挤现象。
图2B 显示伴有低级别异型增生的巴雷特食管。需要注意的是，尽管存在低级别异型增生，但通过该成像方式的形态学标准无法观察到这一变化。因此，基于形态学特征，该组织仍被归类为良性。黄色椭圆内的腺体和管腔结构均一，提示仅为化生性改变；而蓝色椭圆则显示一个腺体大面积融合的区域，即腺体厚度增加，而较深的管腔变细且几乎消失。然而，这些排列密集且略有扭曲的腺体仍具有清晰、分明的边界，并趋于均一化。此外，腺体边缘光滑，无结构湮灭现象，因此组织仍属良性。红色箭头指示的是失焦组织，在视频中可轻易识别；最后，黑色箭头显示的是...

活体染料增强荧光成像（VFI）是一种新型的 体内 一种将高分辨率上皮成像与外源性局部荧光对比相结合的技术，用于突出显示远端食管的腺体形态，并界定高级别上皮内瘤变及癌变。

在体内区分巴雷特食管（Barrett's Esophagus, BE）中的良性化生与肿瘤性病变仍然困难，因为两种组织类型均可呈扁平状……

活体染料增强的荧光成像。VFI 包括利用外源性局部荧光对比剂进行高分辨率上皮成像，以突出显示远端食管的腺体形态并界定异型增生。在设置过程中，将数字视频接口电缆连接在显示器与 DVI 分路器之间。要将显示器设置为 DVI 模式，请按压屏幕下方的输入按钮，直至显示 DVI。激光二极管位于银色金属盒内，电源开关在盒子内部。外部有一个用于调节电压的旋钮，用于开启激光二极管，将手柄拉向电压旋钮即可。在进行研究的 VFI 部分之前，将出现黄灯，以指示激光二极管已开启。为助手准备一个无菌区域，以便其在该区域固定内窥镜末端的滤光片和帽。铺开两张重叠的 Kim 擦拭巾。可将滤器放置在此平台上方。同时，准备好盖帽以备使用。在患者进入内镜检查室之前，必须获得其知情同意。请注意，本研究中每位患者均已签署知情同意书，且本研究的实施均遵守所有与人类福祉相关的机构、国家和国际指南。完成标准白光成像后，将原黄素染料喷洒于目标组织表面。通常仅需喷洒一至五毫升原黄素，具体用量视喷洒过程中情况而定。完成白光检查并取出内窥镜后，打开激光器。使用无尘纸巾清洁镜端，以充分清除碎屑和黏液，沿内窥镜镜端四周清洁数厘米。清洁后，应脱去外层手套，并与无尘纸巾一同丢弃，以防止滤光片污染。此时，由内窥镜操作者保持镜端垂直，助手即可安装滤光片。注意，助手应使用滤光片上的圆柱形凸起，将其对准并插入内窥镜尖端的插孔中，以固定滤光片。助手将帽盖滑过滤光片，并将其向下推至内窥镜尖端。确保帽盖已牢固固定，并完全推到底，边缘与内窥镜表面齐平。操作完成后，帽缘应略微延伸至内窥镜末端之外。最后，确保滤光片仍处于原位，并与内窥镜末端齐平。将激光二极管照射至组织时，应观察到绿色荧光，并将视野覆盖于目标组织区域。本视频展示了典型的无异型增生的巴雷特食管，其边缘被正常的鳞状上皮所包围。在静态图像中，注意位置偏周边、由蓝色箭头指示的较为平坦的鳞状组织。该区域呈现均匀的暗淡荧光，无腺体结构。相比之下，在向中心部位的巴雷特组织移动时，可见腺体结构表现为绿色荧光围绕较暗的管腔。尽管部分腺体呈拉长状，但由于腺体宽度相似且边界清晰，相邻腺体之间几乎没有变形。此外，管腔内的腺体分布均匀，无成簇或拥挤现象。最后，绿色箭头指示的是围绕鳞状组织的一圈环形绿色线条。此轮廓是内窥镜镜头帽造成的伪影。第二段视频展示了位于中心部位的腺癌。在静态图像中，该肿块更为明显。首先请注意，红色椭圆内的癌组织及其腺体结构的完全破坏，且无管腔存在。通过与蓝色椭圆所指示的组织进行比较，可更清楚地观察到这种结构破坏，后者在左侧仍保留部分腺体框架。灰色矩形框出的是鳞状上皮，当内窥镜在视频中完整移动经过该区域时，可更清晰地观察到这一结构。鳞状组织是荧光暗淡的平坦均质区域，无腺体结构。去除帽盖和滤膜时，使用无尘纸并用力将帽盖拔下。帽盖可丢弃，但滤膜必须清洗。为清洁滤膜，取一个杯子，加入足量

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