Name: 使用微流体芯片实时成像和损伤研究的响应果蝇幼虫 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 46 s
Description: 了解利用微流控芯片技术对果蝇幼虫进行非侵入式固定和实时成像的方法。该技术可在不使用有毒麻醉剂的情况下观察神经元轴突运输和神经再生过程，适用于神经科学研究。

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本研究由美国国家科学基金会（资助号 IOS-0842701，授予 C.A.C）和美国国立卫生研究院（R00MH080599，授予 B.Y.；R21 NS062313，授予 N.C；NS069844，授予 C.A.C）资助。我们感谢 James Schutt、Emily Han 和 Leni Truong 提供的技术支持，以及布卢明顿果蝇品系中心提供的果蝇品系。所有芯片均在密歇根大学卢里纳米制造中心制备。

1. 制作PDMS芯片
要从SU-8模具制备PDMS芯片，请执行步骤1.1–1.7。如果已有现成芯片但需要组装后使用，则跳至步骤1.8。
<ol>
	<li>将45 g PDMS基础液与4.5 g固化剂（10:1比例）从PDMS试剂盒中取出，置于小型一次性塑料容器中，使用塑料搅拌棒充分混合。</li>
	<li>将容器放入真空容器中（例如 在干燥器中静置10分钟以去除气泡。</li>
	<li>将SU-8模具置于直径150 mm的塑料培养皿底部，缓慢将PDMS混合物倾倒在模具上。倾倒PDMS时注意避免产生气泡。</li>
	<li>在 650 °C 的烘箱（或培养箱）中固化 PDMS 4 小时。</li>
	<li>从烘箱中取出固化的PDMS/SU-8模具，静置冷却几分钟。</li>
	<li>使用剃刀沿SU-8模具边缘切割固化的PDMS，并将其从SU-8模具上剥离。</li>
	<li>使用剃刀将PDMS平板分割成单个PDMS芯片。</li>
	<li>使用21 G&#160;移液针，刺穿真空接口（如图所示） 图1APDMS芯片的）</li>
	<li>取一支23 G的分配针，从针尖基部扭转数次，使针尖从锁紧接头处断开。</li>
	<li>将23 G针头插入一小段聚乙烯管中，使管子覆盖针头至少一毫米。然后使用刀片将针头上的多余管子切除。这样可在针头一端形成一个塑料环，当其插入真空进气口时可形成密封。</li>
	<li>用于与 倒置的 显微镜（图1B 和 2A-B：将23 G针头插入真空接口孔中。用于配合 直立的 显微镜（图1C 和 2C-D）：使用21 G分配针在PDMS芯片侧面打第二个孔，此孔将从侧面通向第一个孔。然后将带管环的23 G针头插入侧面的孔中。在PDMS芯片顶部贴上一片双面胶带，以密封顶部的孔图1C).</li>
	<li>取一段长约20 cm的聚乙烯管。将管的一端连接到插入真空接口的针头尖端。</li>
	<li>将管路的另一端连接到三通阀的一个端口（参见材料列表中的“三通旋塞阀”）</li>
	<li>将一个20 ml注射器连接至两个剩余端口中的一个，最后一个端口保持向环境开放。</li>
</ol>
2. 使用幼虫芯片进行活体成像
<ol>
	<li>用透明胶带清洁PDMS芯片。将一段胶带贴在芯片底部，确保胶带与整个PDMS表面接触，然后将胶带撕下。</li>
	<li>重复上述步骤2–3次，以确保PDMS芯片表面无颗粒或油渍（来自先前实验的残留物）。由于PDMS芯片可重复使用，彻底清除油渍残留非常重要，因为油渍会影响PDMS与玻璃之间的粘附性，导致密封不充分。</li>
	<li>将早期（即觅食期）3rd 龄幼虫转移至含有水的培养皿&#160;中。（觅食期3rd 龄幼虫位于培养基内部，而非培养管壁侧）。将幼虫浸入水中以去除培养基。</li>
	<li>取一块洁净的玻璃盖玻片，在其中心位置滴加一小滴Halocarbon 700油。</li>
	<li>用镊子轻轻从水中夹取一只洁净的早期3rd 龄幼虫（幼虫长度约为3.5–4 mm）。将幼虫短暂放置在轻质擦拭纸或纸巾上以去除多余水分，然后将其置于油滴上。油滴应足够小，以免覆盖幼虫的气管。让幼虫在油滴上停留10秒。</li>
	<li>将幼虫从油滴中取出，然后将其放置在一块洁净的玻璃盖玻片上。</li>
	<li>将幼虫转移至另一块洁净的玻璃盖玻片。此步骤可去除多余的油。</li>
	<li>注意幼虫的朝向。若需成像神经索和节段神经，应使幼虫腹面朝下贴附于盖玻片，背面朝上；背面特征为两条纵向气管。注意：此为幼虫自然偏好的朝向。</li>
	<li>将PDMS芯片轻轻放置在幼虫上方。幼虫应居中对齐微腔中央，尾部朝向真空口。注意避免幼虫接触腔室边缘，尤其需保护前后端气管末端。注意：建议在体视显微镜下完成此步骤。</li>
	<li>将PDMS芯片压向玻璃盖玻片，以实现良好密封。确保PDMS芯片与盖玻片接触时，幼虫完全被微腔包围。</li>
	<li>打开三通阀，使注射器可通过管路从PDMS微腔中抽气，从而形成真空。</li>
	<li>一手牢固按住PDMS芯片与玻璃盖玻片，另一手拉动注射器活塞，抽出2–2.5 mL空气，直至注射器手柄出现明显阻力，以形成真空。真空可在PDMS芯片、油和盖玻片界面之间形成紧密密封，从而限制幼虫活动。</li>
	<li>关闭三通阀，使PDMS芯片与注射器及外界环境隔离。由此可在微腔内维持相对稳定的真空度，无需持续按压注射器活塞。</li>
	<li>在体视显微镜下检查幼虫，确认整个虫体位于微腔内且无活动，气管清晰可见，PDMS芯片其余部分均与盖玻片接触。注意：正确固定的示例见图2E和2F；图2G和2H展示了部分错误朝向。</li>
	<li>将幼虫芯片（PDMS芯片+玻璃盖玻片）置于显微镜载物台上。操作过程中需小心处理幼虫芯片、管路和注射器，避免PDMS芯片与盖玻片分离。对于直立式显微镜，使用双面胶带将芯片“顶部”固定于显微镜载物台（图1C）。</li>
	<li>使用高倍物镜（建议使用油镜，40–63X&#160;）定位幼虫目标结构并进行成像。某些情况下，可先使用较低倍率确定成像区域，再切换至高倍率。</li>
	<li>成像完成后，将三通阀切换至与外界连通的位置，释放真空。</li>
	<li>将PDMS芯片从盖玻片上取下。幼虫应立即恢复活动能力。</li>
	<li>用镊子将幼虫从微腔中取出，并轻轻放置于葡萄汁琼脂平板上以恢复活力。</li>
</ol>
3. 对幼虫节段神经诱导神经 crush 损伤
<ol>
	<li>按照上述步骤 2.3 分离早期阶段的 3rd 所需基因型的龄期幼虫。如步骤 2.3 所述&#160;将幼虫浸入水中以去除食物。</li>
	<li>使用标准果蝇CO₂麻醉装置2 麻醉站，配备 CO2 将幼虫置于解剖立体显微镜下的垫板上以固定。&#160;幼虫在置于CO后应变得无法移动2 轻拍1-2分钟。</li>
	<li>现在将一只麻醉后的幼虫置于体视显微镜下的葡萄汁琼脂平板上。将幼虫翻转至腹面朝上，以便透过体壁观察腹神经索和节段神经。图3确保幼虫完全不动。</li>
	<li>使用 Dumostar 5 号镊子，通过体壁外骨骼紧紧夹住节段神经 5–10 秒。操作正确时，外骨骼保持完整，体壁未被刺穿。注意：只要不损伤腹神经索、唾液腺和肠道，损伤可在前后体轴的不同位置进行。最有效的损伤位置位于第 3 节段末端附近rd 腹部节段，如图所示 图 3D该部位损伤可累及最多神经，且在不致死动物的情况下最容易复制。</li>
	<li>损伤后，将动物翻转，使其腹侧朝下置于葡萄培养基上。动物应能活动头部并进食。若损伤成功，则幼虫后半部分将出现瘫痪。</li>
	<li>将受伤的动物置于葡萄汁琼脂平板上，在 25 °C 下根据实验目的保持所需时间。对于运动神经元，近端残端在 8–10 小时内开始出芽&#160;损伤14，远端残端在6-8小时内开始退化15对于IV类da感觉神经元，近端残端在4-6小时内开始出芽，远端残端在3-4小时内开始退化&#160;损伤后。注意：使用适当的Gal4驱动子和荧光报告基因，可在幼虫芯片中观察到神经芽生与退变过程（例如，参见 图6).</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在竞争性财务利益。

制备或获取幼虫芯片：
幼虫芯片由一块聚二甲基硅氧烷（PDMS）模块（称为“PDMS芯片”）连接至玻璃盖玻片构成。步骤1中的方案描述了制作和使用幼虫芯片的流程，前提是已有SU-8模具。SU-8模具是通过光刻技术在硅晶圆上图案化一层140 μm厚的SU-8光刻胶而微加工制成的（详细方法见Ghannad-Rezaie&#160;et al.12）。由于SU-8模具的微加工需要使用专用设备，我们建议从微加工平台（例如密歇根大学的LNF平台14）订购，或向代工厂提供随附补充文件提供的芯片设计图以定制生产。&#160;如果需要修改PDMS芯片的设计（例如用于不同大小的幼虫），可使用支持DXF文件的CAD软件（例如AutoCAD）进行调整。此外，也可根据Mondal&#160;et al.27&#160;中的说明在实验室内部自行制作SU-8模具。许多读者可能会发现，在自行制作芯片之前，先获取一个PDMS芯片样品来试用该技术更为方便。样品将在提出请求后免费提供。
使用微流控“幼虫芯片”进行活体成像：
幼虫芯片中的固定方法无需使用麻醉剂，而是通过施加真空压力来限制动物的活动。尽管动物在芯片中固定数小时仍可存活12，但仍建议采用较短的固定时间（5–15 分钟）。这段时间足以对多种感兴趣的细胞事件进行成像，包括细胞内钙离子变化或快速的轴突运输过程。同时，也足以在活体动物中完成所需的操作，例如基于激光的显微手术、光漂白和光转化。
为了在单个动物体内对事件进行长期的纵向研究，可将动物放入芯片中并进行多次成像，每次成像之间安排休息期。成像间期使用葡萄汁琼脂平板作为休息环境最为理想，因其可提供简便的食物来源和适宜湿度。多次成像确实会在一定程度上影响幼虫的存活率，因为每次成像过程均存在对动物造成损伤的风险（参见下文“故障排除”部分第2点）。在两天时间内，动物通常可接受超过&#62;5次的成像，且存活率高于50%。由于实验过程中未对动物实施麻醉，因此在芯片中真空释放后，动物可立即恢复健康状态并自由活动。因此，成像之间无需设置恢复时间，各成像时间点之间的间隔具有灵活性，可根据实验目标进行调整。
问题排查：
幼虫芯片最常见的技术问题及推荐解决方案如下：
(1) 动物活动过多。 活动性过强会干扰成像目标。在幼虫芯片中，最常见的原因有：a）动物体型过小，不适用于该芯片；b）固定步骤中施加的负压不足。本实验方案所述的幼虫芯片专为早期三龄rd 龄幼虫。动物的最佳尺寸为3.5-4 mm（沿前后轴方向）。为确保真空压力足够，需拉动注射器2-2.5 ml，或拉至手柄处感受到阻力为止。判断真空是否有效的指标之一是：可在外围通道中观察到微小气泡缓慢向真空源方向移动。另一指标是：当从顶部提起芯片时，盖玻片应始终随芯片一起移动（此为幼虫定位完成且开启真空后转移腔室的推荐方法）。若管路存在裂纹或管内有油渍，可能导致真空失效。此问题可通过更换23 G分配针头和聚乙烯-50管路（参见步骤1.6-1.14）轻松解决。
（2）动物在芯片成像后死亡。 该操作旨在尽量减少对动物的应激，野生型基因型的动物即使在芯片上固定一小时后，其存活率仍超过&#62;90%12。由于某些基因型可能对芯片带来的应激更为敏感，因此应首先确认野生型动物（例如，Canton S）能够耐受该固定技术。a) 导致死亡最常见的原因是幼虫位置不正确（见图2G-H）。如果表皮、头部或气管部分未完全位于腔室内，则在固定过程中可能受损；体型过大（超过&#62;4 mm）的幼虫在芯片中存活的可能性较低。b) 较少见的致死原因是加载芯片时施加了过大的压力或真空度。当幼虫在芯片中正确放置后，所产生的真空压力通常可被良好耐受；但过高的压力，无论是来自真空本身，还是在初始放置动物阶段施加的压力，均可能导致问题。最佳方式是通过使用正确大小的野生型幼虫进行多次试验，经验性地掌握所需压力的程度。&#160;c) 若过多的卤代烷油覆盖幼虫气管，可能影响其长期存活。油在芯片中具有多种重要作用：有助于形成真空、改善成像时的光学性能，并防止芯片内样本干燥。但应避免使用过量油。过多的油还可能导致油进入管路和注射器，从而破坏真空。建议的操作流程是仅在幼虫腹侧涂覆一层油，然后将其转移至洁净的盖玻片上以去除多余油分，再移至最终用于成像的盖玻片上。d) 成像过程可能导致光毒性。与所有活体成像应用一样，理想的做法是采用短曝光时间和低强度激光，这可通过使用高灵敏度相机或探测器实现。应尽量减少紫外光照射，包括汞灯光源产生的宽谱光。
其他问题与未来发展方向：
由于该方法不使用麻醉剂，动物的心脏会持续跳动。这导致一定程度的不可避免的移动，从而在某些位置对成像造成比其他位置更大的影响。&#160;本文中的示例表明，腹神经索、节段神经和体壁可以在不受心跳干扰的情况下被清晰成像。在心跳影响成像的情况下，有时可在分析软件中对这种规律性运动进行校正（例如 ImageJ 的 Image Stabilizer 插件）。当目标物体的运动速度较快（例如快速轴突运输约为 ~1 μm/sec&#160;）或非常缓慢（数分钟至数小时）时，该方法效果较好。然而，当感兴趣的目标以多种速度和方向运动时，校正由心跳引起的运动将变得更加困难。
另一个问题是动物之间或同一动物在芯片上多次成像过程中光学条件存在轻微差异。目标结构在动物体内的深度越大，这种差异就越显著。通常情况下，节段神经和腹神经索在动物体内过深，无法在常规显微镜下清晰成像。然而，幼虫芯片施加的轻微压力可使这些结构被推近至表皮和盖玻片附近。这些结构与盖玻片之间的具体距离在不同实验之间会存在微小变化。而对于靠近表皮的结构（如感觉神经元的细胞体），其变异程度较小。&#160;因此，在进行强度测量时，尤其需要使用大量动物样本和独立重复实验，以消除光学条件变异带来的影响。
尽管此处展示的示例主要关注神经元内的过程，但该方法也可用于成像动物体内任何可置于物镜聚焦深度范围内的结构。这包括角质层、体壁肌肉及其神经肌肉接头（NMJs）。动物腹侧的气管以及消化道的某些部分也可能被成像。动物也可背侧朝向盖玻片，以进行靠近背侧表面结构的短期成像。对动物体内深层结构的成像能力受限于所用显微镜物镜的工作距离。例如，高倍率（如 40X）物镜无法触及诸如成虫盘之类的结构。
本方案中描述的幼虫芯片适用于早期3rd龄幼虫阶段（大小范围为3.5–4 mm）的幼虫。然而，许多有趣的研究问题需要在不同的幼虫阶段进行成像。利用相同原理，可轻松设计出适用于2nd龄幼虫的更小芯片，或适用于晚期3rd龄幼虫的更大芯片。（补充图1包含一个可直接修改的DXF文件，用于制作腔室尺寸不同的硅胶模具）。这种可逆密封的基本原理甚至可应用于其他生物体，如C. elegans或斑马鱼，主要变化在于腔室尺寸。一个有价值的未来方向是设计一种能够同时固定多个动物的芯片，用于筛选实验。&#160;然而，为此，芯片设计需与当前装置有显著不同，因为每个动物在芯片中的定位问题都需要独立解决。
用于研究幼虫外周神经损伤反应的神经挤压实验：
此处所述的幼虫节段神经挤压实验是一种用于对周围轴突造成损伤的简单方法 黑腹果蝇该方法的优点包括：a）使用实验室常见的标准工具即可简便操作 果蝇 实验室（体视显微镜 CO2 b) 可快速对大量动物进行操作，使得损伤后对神经索进行生化分析成为可能14；c) 该损伤引发的分子与细胞反应具有高度可重复性14,15,28 并可用于发现对脊椎动物神经元同样重要的过程29,30.
损伤神经元的另一种方法是聚焦高能激光，例如脉冲紫外激光或飞秒激光，通过激光显微手术切断轴突17,31-33。幼虫芯片是用于定位动物以进行此类显微手术的理想方法。然而，由于不同实验之间存在上述光学系统的微小差异，基于激光的方法在幼虫中较难重复，特别是在幼虫节段神经中。此外，基于激光的轴突损伤需要更多时间来逐一定位每只动物，因此难以在大规模（大量动物）实验中实施。
问题排查：
神经挤压实验中最常见的技术问题是因内脏器官受损导致的死亡。进行挤压操作时，应注意避免夹到腹神经索、唾液腺或肠道。同时应避免刺破体壁。通过将镊子以45°角接近体壁表面，可最大程度避免上述问题（见图3）。
镊子的质量对夹闭效果及术后存活率有显著影响。我们推荐使用 Dumostar 5 号镊子。为保持其锋利度，必须小心操作，避免用于其他用途，并在镊子变钝或弯曲后及时更换。
动物的体型也可能影响挤压的效果。体型较小的动物（长度小于3 mm）在受伤后存活的可能性要低得多。而对于较大的动物（游走期3rd龄幼虫），更难准确定位神经，且容易损伤较大的唾液腺和肠道；此外，在化蛹前可用于研究损伤反应的时间也更短。神经挤压操作最适合在早期3rd龄幼虫（沿前后轴长度约为3–4.5 mm）中进行。
动物所食用的培养基可能会影响其角质层的强度以及受压后的存活率。建议使用标准的酵母-葡萄糖配方培养基来培养动物。
有效掌握压碎操作的最佳方法是在大量动物个体上进行练习，初期应以压碎后24小时动物存活（而非化蛹）为主要目标。初学者通常存活率较低（例如 10%），但一旦掌握该技术，存活率可达到约90%。
其他问题与未来方向：
压伤实验为研究损伤部位近端轴突的出芽以及远端轴突和突触的退变提供了一种强有力的方法。尽管不同神经元类型的退变速率存在差异，但在同一种神经元类型中具有高度可重复性，这证明了该损伤实验的可重复性。
相比之下，近端轴突中观察到的“再生性”出芽反应更难以研究。节段神经中的所有轴突都会在损伤部位附近启动广泛的出芽（例如参见图6和图3）。然而，不同神经元之间的出芽程度存在差异，且难以量化。&#160;当使用脉冲紫外染料激光对节段神经中的单个运动神经元造成更局限的损伤时，也可观察到类似程度和变异性的出芽现象。我们认为，出芽方向缺乏特异性是由于节段神经中缺乏引导信号所致。相比之下，靠近胞体处被激光损伤的感觉神经元轴突会沿原有轴突的方向进行新的轴突生长34。动物该区域的轴突可能暴露于更特异的位置信息中，从而为再生轴突提供导向。节段神经内部的环境与轴突在胚胎发育过程中最初所经历的引导环境很可能相差甚远，因此预期其不具备指导再生轴突生长的信息。
使用节段性神经 crush 实验研究再生的另一个局限性在于，受损的感觉神经元和运动神经元轴突仍需延伸相当的距离（0.25–1 mm）才能到达其靶标，且时间窗口有限（&#60;3天）后，动物开始化蛹。最近一项研究发现，通过基因操控促胸腺激素受体，可使该3rd 龄幼虫期35这种操作将显著延长研究神经元损伤后恢复与退变过程的时间窗口，从3天延长至9天。这段时间可能足以观察到一些新事件，例如受损轴突与其突触后靶标的重新连接，尤其是在损伤部位靠近突触末端时。

果蝇， 黑腹果蝇，已被用作模式生物超过100年，且在揭示从无脊椎动物到人类保守的基本信号传导和发育通路方面发挥了关键作用。活体成像是一种研究细胞机制的重要方法，而其简单的身体结构和透明的角质层使得 果蝇 幼虫是活体成像的理想系统，尤其因为已有大量遗传工具可用于在特定细胞类型中表达荧光标记蛋白。
活体成像技术面临的一个重要挑战是如何以非侵入性的方式将动物固定并定位，以便进行显微观察。传统的固定方法包括解剖1,2或使用氯仿，但这些方法都会导致动物死亡。麻醉剂乙醚4和异氟烷5-8也曾被用于动物固定。尽管麻醉剂具有多种优势，但它们会抑制神经活动以及重要的生理功能（包括心跳）9-11，因此可能影响所研究的生物学过程，并对动物造成应激反应。此外，使用乙醚和异氟烷还存在对操作人员的安全隐患。
我们开发了一种无药物的方法，用于在单层 PDMS 微流控装置中固定Drosophila幼虫，该装置我们称之为“幼虫芯片”12。&#160;本实验方案将介绍如何获取或制备幼虫芯片，以及如何将其用于早期3rd龄幼虫的活体成像。该芯片包含一个贴合紧密的微型腔室，通过注射器施加真空，可利用轻柔的机械力将幼虫固定。该固定方法使腹侧结构（如神经索、节段神经和体壁肌肉）紧贴玻璃盖玻片，从而能够利用高数值孔径（高倍率）物镜对这些结构进行高分辨率成像。
与其它传统技术相比，幼虫芯片具有以下优势：（i）使用幼虫芯片可替代化学试剂，从而实现 在&#160;体内 对未麻醉动物进行成像。（ii）幼虫从芯片释放后可立即恢复（相比之下，异氟烷处理后需要2小时恢复期）8,13）。这使得成像可在较宽的时间尺度上进行，从毫秒到分钟，再到小时乃至数天。（iii）使用具有透气性的PDMS材料，可使氧气/空气持续从环境中扩散至幼虫体内。（iv）该芯片使用简便且安全，（v）可重复使用，并能以极低的成本进行制造。
除了使用幼虫芯片的说明外，本方案还将提供多个应用实例，以研究3龄幼虫中神经元活动事件rd 龄幼虫。包括轴突运输的活体成像、损伤后的钙反应，以及光转换蛋白在长距离和长时间尺度上的转运时程研究。
该芯片的另一个应用是研究神经元对轴突损伤的反应。为此，本文在第三部分描述了一种额外的操作步骤，即通过节段性神经挤压损伤外周神经中的轴突。这种简单的检测方法可在标准解剖体视显微镜下快速且可重复地进行，从而能够同时处理大量动物样本。通过幼虫芯片进行活体成像，可研究细胞对损伤的反应。

<table><tbody><tr><td>0.5 mm 聚乙烯管</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-170-11B</td><td>聚乙烯管，内径 = 0.023 英寸，外径 = 0.038 英寸</td></tr><tr><td>1 mm 聚氨酯管</td><td>Fisher Scientific</td><td>BB521-63</td><td>聚氨酯管，内径 = 0.063 英寸&amp;nbsp;，外径 = 0.125 英寸</td></tr><tr><td>接头式接头（barb to barb connector）</td><td>Bio Rad</td><td>732-8300</td><td>0.8 mm 接头式接头</td></tr><tr><td>三通旋塞阀</td><td>Bio Rad</td><td>732-8104</td><td>用于注射器的螺旋阀</td></tr><tr><td>注射器（20 ml）</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-817-33</td><td>可螺旋连接的 20 ml 注射器，用于&amp;nbsp;产生真空</td></tr><tr><td>分配针头，23 G（0.4 mm 内径，0.6 mm 外径）</td><td>McMaster-Carr</td><td>75165A684</td><td>用于出口连接的针头</td></tr><tr><td>分配针头，21 G（0.6 mm 内径，&amp;nbsp;0.8 mm 外径）</td><td>McMaster-Carr</td><td>75165A679</td><td>用于出口连接的针头</td></tr><tr><td>卤碳油</td><td>Sigma</td><td>H8898</td><td>卤碳油 700</td></tr><tr><td>Dumostar Number 5 镊子</td><td>Roboz</td><td>RS-498</td><td>用于神经压伤</td></tr><tr><td>PDMS 套件（基础剂和固化剂）</td><td>Ellsworth</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td><td>Dow Corning Sylgard 184 硅胶封装材料 0.5 kg 套件，透明</td></tr><tr><td>玻璃盖玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-C</td><td>24 mm × 40 mm（厚度根据显微镜物镜推荐选择）</td></tr><tr><td>一次性塑料杯（9 盎司）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>塑料咖啡搅拌棒</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>剃须刀片</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>葡萄汁琼脂平板</td><td></td><td></td><td>配方见 &lt;a href=&quot;http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/4/pdb.rec10925">http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/4/pdb.rec10925&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

使用微流控芯片进行活体成像及损伤反应研究 果蝇 幼虫

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

活体成像技术是研究细胞生物学过程的重要手段，但在活体动物中实施这一技术具有挑战性。由于线虫幼虫的角质层具有半透明特性， 果蝇 幼虫使其成为活体成像研究的理想模式生物。然而，活体成像技术面临的一个重要挑战是如何以非侵入性方式将动物固定并准确定位于显微镜下。本方案介绍了一种简单且易于操作的方法，用于固定和成像 果蝇 幼虫置于一种我们称之为“幼虫芯片”的聚二甲基硅氧烷（PDMS）微流控装置上。该幼虫芯片由一个紧密贴合的PDMS微腔室组成，其附着于一片薄的玻璃盖玻片。通过注射器施加真空，可使幼虫固定，并将腹侧结构（如腹神经索、节段神经和体壁肌肉）紧贴于盖玻片下方。这使得能够进行高分辨率成像，且重要的是，无需使用麻醉剂或化学试剂，从而便于研究多种生理过程。由于幼虫在固定后可迅速恢复，因此可反复进行多次成像。这使得能够在数小时至数天的时间范围内开展纵向研究。本方案逐步描述了芯片的制备方法以及如何利用该芯片对3龄幼虫神经活动进行活体成像rd 龄幼虫。这些事件包括轴突中细胞器的快速运输、损伤引起的钙反应，以及对光转换蛋白在长距离和长时间尺度上的运输进行延时研究。该芯片的另一个应用是研究轴突损伤后的再生与变性反应，因此本实验方案的第二部分描述了一种新的、简单的方法，通过节段性神经 crush 损伤外周神经中的轴突。

幼虫芯片由单层PDMS块（即PDMS芯片）构成，其设计结构如示意图所示 图1。（另请参见补充的DXF文件，用于设计您自己的模具）。幼虫微室、真空端口和周边通道（图1A是 140 μm PDMS 芯片上的凹陷。将芯片置于早期阶段的 3rd 龄幼虫，置于滴有油的盖玻片上方静止图1B 和 1C）。盖玻片与PDMS芯片之间的油-玻璃界面在施加轻微真空后可形成密封，该密封将幼虫固定在腔室内，且由于早期阶段的3rd 三龄幼虫的体宽略大于微室腔体，当封闭微室时会对幼虫产生一定的物理挤压，从而有效固定并限制其运动。在此固定状态下，某些腹侧结构（如腹神经索和体节）会被推近至盖玻片，有利于成像。因为在固定状态下，这些结构可位于40X和63X物镜的工作距离范围内。释放真空后，幼虫可轻松从微室中取出，便于后续开展其他实验。这种纯机械固定方法可在连续固定长达1小时后，仍保持约90%的幼虫存活率12.
真空由一个简单的 20 ml 注射器产生，因此整个装置易于从体视显微镜转移到共聚焦或落射荧光显微镜。体视显微镜用于在样品室中进行位置调整，而活体成像则在共聚焦或落射荧光显微镜下进行。注射器通过聚乙烯管和 23 G 注射针头（已移除锁紧接头）连接至真空接口，具体操作如步骤 1.6–1.14 所述。对于倒置显微镜，管路和注射器通过芯片顶部连接 （图 1B，2A，和 2B）。对于正置显微镜，则通过芯片侧面的接口连接 （图 1C，2C，和 2D）。倒置显微镜的配置使用起来相对更简便。拉动注射器以产生轻柔的负压（约 10 psi），使油-玻璃-PDMS 界面结合，从而在盖玻片与 PDMS 装置之间形成严密密封，将幼虫固定并限制在样品室内。
将幼虫放入微室（方案中的步骤 2.7-2.10）对于有效固定和存活至关重要（图 2E-H）。如果动物体型过大而不适合微室（图 2G），或其头部或气管卡在微室边缘与盖玻片之间（图 1H），则其在操作过程中存活的可能性将大大降低。
以下是利用幼虫芯片研究神经元中各种细胞反应的若干示例（图4-7、视频S1和视频S2）。
快速轴突运输的成像：利用幼虫芯片对单个外周轴突内由驱动蛋白介导的突触小泡运输进行成像（图4和视频S1）。通过转盘共聚焦显微镜采集的视频，可方便地研究这些小泡的顺向运输（约1.0 μm/sec）和逆向运输（约0.8 μm/sec）过程。
激光显微手术中动物体位的摆放： 使用脉冲紫外染料激光切断了一根感觉神经元树突图5 和 视频 S2。 有关该方法在显微手术中应用的方案可参见其他文献16,17高效的固定技术可实现对受损神经元在快速时间尺度上的变化进行监测，例如细胞内钙离子浓度的变化（通过基因编码的钙指示剂检测）。2+ 指示剂 GCamp3.018），以进行检测和测量（图5).
研究损伤后的再生与退行性反应：如果在成像间隔期间允许动物休息，幼虫芯片可用于研究在较长时间尺度上发生的细胞事件。例如，可在幼虫芯片中对发生在约15小时时间尺度上的轴突损伤后“再生性”和退行性反应进行成像（图6）。在此示例中，通过节段神经挤压法（图3）损伤了章鱼胺能运动神经元的轴突，该操作详见方案第3部分。损伤后可在不同时间点对近端轴突残端（发生新生出芽）以及远端轴突（形成串珠样结构，并通过瓦勒氏变性过程逐渐断裂）进行成像和研究。
追踪光转换蛋白 随时间变化的荧光蛋白 体内 光可转换荧光蛋白的发展使其荧光在紫外光照射下发生不可逆改变，从而能够特异性地标记细胞内特定亚群的蛋白质，并随时间追踪这些标记蛋白的命运19,20该技术最常在细胞培养中进行，然而利用幼虫芯片，可以在特定细胞内追踪基因编码的光转化蛋白 体内. 例如，我们展示了在Ⅳ类da感觉神经元中表达的Denda2-α-tubulin融合蛋白可在胞体中进行光转化（图7A 和 7B）。随后可随时间追踪光转化蛋白的运输：两天内，我们可在感觉神经元的轴突末梢检测到大量光转化蛋白，这些末梢距离胞体原始位置约1 mm。图7A 和 7C).
所有描述的示例（图4-7 和 视频S1 和 S2）均使用转盘共聚焦成像系统进行成像，该系统由Nipkow CSU10扫描仪和C9100-50 EMCCD相机组成，安装在配备63倍（1.5 NA）油镜物镜的Axio Observer显微镜上，并使用Volocity采集软件进行控制。
<img alt="Static setup diagrams for PDMS chip microscopy; includes inverted, upright configurations." fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50998/50998fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50998/50998fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
图1. 使用幼虫芯片的示意图。 
（A） 幼虫芯片由聚二甲基硅氧烷（PDMS）芯片（以浅蓝色表示）粘附于玻璃盖玻片上构成。该芯片包含 140 µm 较粗的微流控通道（以白色标示）。中央微室设计为可紧密容纳早期阶段的3rd 龄期 果蝇 幼虫（以浅绿色卡通表示）。用于设计模具的精确尺寸的DXF文件作为补充数据提供。比例尺 = 1.5 mm。 （B-C） 将幼虫装入幼虫芯片的示意图侧视图。幼虫腹面朝下置于盖玻片上，其身体位于芯片的腔室内 140 µm 深微室。将一个20 ml注射器连接至真空进气口，用于产生轻柔的负压。在负压作用下，氟化碳油-PDMS-玻璃界面形成紧密密封，从而将幼虫固定在微室内。通过释放注射器中的压力即可轻松解除密封，动物随即恢复活动能力。对于直立式显微镜（B），通过聚乙烯-50管从芯片顶部连接注射器真空。对于倒置显微镜（C），这些连接是从芯片的侧面进行的，而芯片的“顶部”则通过双面胶带固定在显微镜载物台上。
<img alt="微流控芯片装置；样品正确与错误取向；显微镜结果对比。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50998/50998fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50998/50998fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 
图2. PDMS芯片图像及幼虫的正确放置位置。 
(A-D)。 显示适用于倒置和正置显微镜的PDMS芯片照片。已将23 G分液针头插入真空端口，可通过管路连接至真空源（注射器）。比例尺 = 1.5 mm。(E-H)。 固定后的果蝇（Drosophila）幼虫的明场图像。E 和 F 显示正确固定的个体示例。F 中较小的个体更适合进行长时间尺度（>12 小时）的多次成像。G 显示个体过大，H 显示个体过小且放置位置不正确。比例尺 = 1.5 mm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50998/50998fig2highres.jpg" target="_blank">点击此处查看高清图像。</a>
<img alt="Injury response in insect ventral nerve cord; includes diagrams and fluorescence microscopy." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50998/50998fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50998/50998fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
图3. 节段性神经的神经 crush 损伤 果蝇 幼虫 
（A） 神经挤压实验示意图。位于3内的节段神经rd 用5号镊子夹压幼虫腹侧表皮，使其三龄幼虫破裂。 （B） 神经压伤后20小时解剖动物的幼虫神经系统视图。使用抗-HRP抗体（红色）对神经元膜进行免疫染色，可清晰显示脑叶、腹神经索以及包含运动神经元和感觉神经元轴突的长节间神经。通过m12-Gal4驱动子驱动UAS-mCD8-GFP表达，标记出部分特定的运动神经元（绿色）。这些神经元的胞体和树突位于腹神经索内，其轴突则经由节间神经投射至体壁肌肉。（该驱动子还在每个幼虫半体节的肌肉12中驱动GFP表达，两侧共同形成沿前后轴排列的条带状结构）。压伤损伤区域以蓝色虚线标出。比例尺 = 70 µm. (C) 损伤后20小时的轴突损伤局部特写。左图：近端轴突已发生出芽并出现新生长。右图：远端轴突发生片段化，由于华勒变性及碎片清除，GFP信号几乎消失。比例尺 = 10 µm. (D) 早期3次神经 crush 的图像rd 龄幼虫。红色箭头指向腹神经索。挤压位置位于第3体节的下部，具体如方案文本（方案3）所述。图D中的图像最初发表于 细胞生物学杂志 191, 211-223, doi: 10.1083 (2010). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50998/50998fig3highres.jpg" target="_blank">单击此处查看大图。</a>
<img alt="神经元运输分析；显微镜图像，条形图显示速度和颗粒密度。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50998/50998fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50998/50998fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
图 4. 肽能突触小泡轴突运输的延时成像。利用 eve-RRa-Gal4 驱动子22，在特定运动神经元中表达绿色荧光蛋白标记的大鼠心房利钠肽 ANF，即 UAS-ANF-GFP21。对节段神经进行活体成像，可观察到 ANF-GFP 标记的肽能小泡在轴突中的快速运输。另见 视频 S1。（A） 来自活体延时成像的运动神经元轴突的单帧图像。绿色、红色和蓝色箭头分别表示顺向运输、静止和逆向运输的小泡示例。比例尺 = 5 µm。（A'） 使用 ImageJ 将视频中的各个时间帧合并。（B） 通过延时成像生成 ANF-GFP 运输的线扫图（kymograph），该图基于成像时间跨度为一分钟的一系列单帧图像，并使用 ImageJ 的“Multiple Kymograph”插件生成23。（C） 节段速度的定量分析，该速度由线扫图中分段轨迹的斜率计算得出。绿色柱表示顺向节段速度（n = 543），蓝色柱表示逆向节段速度（n = 548），数据来自 10 个线扫图。（D） 颗粒密度的定量分析。颗粒密度通过每 100 µm 轴突长度内顺向运输（绿色柱）、静止（红色柱）和逆向运输（蓝色柱）颗粒的数量进行测量，数据来自 10 个线扫图。本图数据此前也发表于 Ghannad-Rezaie 等, PLoS One 7(1), e29869, doi:10.1371/journal.pone.0029869 (2012)。
<img alt="神经元损伤反应，ΔF/F₀ 钙成像，时间推移；荧光强度图，实验结果。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50998/50998fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50998/50998fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 5"> 
图 5. 利用幼虫芯片进行激光显微手术和钙成像。 
使用脉冲紫外染料激光的高能激光脉冲切断了IV类感觉神经元的一条树突。该显微手术方法的详细操作步骤可参见其他文献16。幼虫芯片可有效固定样本，从而通过活体成像研究细胞内钙水平的快速变化。在本示例中，利用 ppk-Gal4 驱动子在IV类树突状（C4da）感觉神经元中表达了基因编码的钙指示剂 GCaMP3.0。（A） GCaMP3.0 荧光强度的时间推移图像根据颜色强度标尺进行伪彩着色，以显示随时间变化的强度差异。各帧图像取自在转盘共聚焦显微镜上以每秒5帧速率拍摄的时间推移视频（视频 S2）。（B） 激光显微手术后钙动态变化的定量分析。将单个神经元胞体中 GCaMP3.0 荧光强度的标准化倍数变化（ΔF/F₀）随时间作图（n = 7，灰色线条）。平均 ΔF/F₀ 值以橙色表示。GCaMP3.0 荧光强度的峰值出现在损伤后 1–2 秒之间。原始 GCaMP3.0 荧光强度已扣除背景信号。本图数据此前已发表于 Ghannad-Rezaie et al., (2012) PLoS One 7(1):e29869. doi: 10.1371/journal.pone.002986912。
<img alt="15 小时内显示近端和远端区域神经退化的延时显微镜图像。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50998/50998fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50998/50998fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 6"> 
图 6. 利用幼虫芯片成像轴突出芽与退化过程。 在神经 crush 损伤后不同时间点，章胺能运动神经元近端残端（左）和远端残端（右）的代表性共聚焦图像。图像采集位置与 图 3C 所示位置相似。这些神经元通过 Tdc2-Gal4 驱动子驱动 UAS-mCD8-RFP 转基因表达进行标记24,25。这些神经元的胞体位于腹神经索24。在单个节段神经中可观察到三条独立的轴突，彼此之间可清晰分辨。该情况非常适合研究单个细胞事件，例如退化轴突的断裂过程——这些神经元的轴突退化在 15 小时内即完成。图像使用幼虫芯片在转盘共聚焦显微镜下以 63 倍放大倍数对活体动物进行采集。左侧图示（近端残端）比例尺 = 10 µm，右侧图示（远端残端）比例尺 = 20 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50998/50998fig6highres.jpg" target="_blank">点击此处查看高清图像。</a>
<img alt="神经元转化过程；示意图与荧光显微镜图像；突触终末研究。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50998/50998fig7highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50998/50998fig7.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 7"> 
图 7. 利用幼虫芯片在活体动物中长时间、长距离追踪光转化荧光蛋白。 
本示例中，使用 ppk-Gal4 驱动子26，在 IV 类树突状分支（C4da）感觉神经元中表达一种光可转化荧光蛋白 Dendra219 与 α-微管蛋白融合的融合蛋白，该蛋白由 UAS-Dendra2-α-tubulin 转基因表达。 (A) 光转化实验示意图。C4da 神经元的胞体位于外周，其轴突经由节段神经延伸至腹神经索形成突触终末。对动物后半部分的部分胞体中的 Dendra2-α-tubulin 进行紫外光照射（使用汞灯配合标准 DAPI 滤光片，照射 6 秒）以实现光转化（左图示意图）。经过一段时间后，可在腹神经索的突触终末处检测到已光转化的 Dendra2-α-tubulin，表明微管蛋白已被长距离运输（约 1–2 mm）。比例尺 = 1 mm。(B) IV 类感觉神经元胞体中 Dendra2-α-tubulin 在光转化前后的图像示例。比例尺 = 5 µm。(C) 在胞体光转化后 0 小时或 48 小时时，IV 类感觉神经元突触终末的图像示例。随着时间推移，光转化后的 Dendra2-α-tubulin 特异性地出现在突触终末，表明该蛋白从胞体运输至轴突末端。所有时间点的光转化和成像均在幼虫芯片中完成。比例尺 = 15 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50998/50998fig7highres.jpg" target="_blank">点击此处查看高清图像。</a>
<a href="/files/ftp_upload/50998/MovieS1.mov" target="_blank">视频 S1.</a> C4da 神经元的激光显微手术与钙成像。 使用脉冲紫外激光切断一条初级树突分支。激光切断后，GCaMP 信号强度迅速升高，信号起始于损伤部位并传播至胞体。通过 C4da 特异性的 ppk-Gal4 驱动子26表达 UAS-GCaMP3.018。视频采用伪彩显示 GCaMP3.0 的相对信号强度。时间序列成像使用转盘共聚焦显微镜以每秒 5 帧的速度进行。
<a href="/files/ftp_upload/50998/MovieS2.mov" target="_blank">视频 S2.</a> 运动神经元中 ANF-GFP 的快速轴突运输。 
利用 eve-RRa-Gal4 驱动子22在特定运动神经元中表达与 GFP 标记的大鼠心房利钠肽 ANF，即 UAS-ANF-GFP21。使用转盘共聚焦显微镜，在幼虫芯片上以每帧 300 毫秒的时间分辨率对这些肽能囊泡在幼虫节段神经中的运输过程进行成像。
补充图1（DXF文件） 
用于硅模具制作的DXF文件。该文件专为4英寸硅片上的负性光刻胶掩模（SU-8用暗场掩模）设计。第二行包含5个模具，用于制作本方案中使用的幼虫芯片。每个芯片（第二行）均含有一个约5.4 mm × 1.5 mm的腔室，专为容纳早期3龄幼虫而设计。rd 龄幼虫。第一行（第1行）包含一个较大的腔室（约5.4 mm × 2 mm），而第三行（第3行）包含一个较小的腔室（约4.4 mm × 1.5 mm）。可分别用于体型较大和较小的幼虫。比例尺 = 2 mm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50998/Figure_S1_DXF_file.eps" target="_blank">单击此处下载该图。</a>

黑腹果蝇 幼虫因其半透明的角质层和强大的遗传学工具，成为活体成像的理想模型系统。本方案描述了如何利用一种单层聚二甲基硅氧烷（PDMS）装置，即“幼虫芯片”，对3龄幼虫神经元中的细胞过程进行活体成像rd 龄期 果蝇 幼虫

活体成像是研究细胞生物学过程的重要技术，但在活体动物中进行该技术具有挑战性。半透明的角质层……

以下实验的总体目标是利用改良的微流控芯片，以非侵入性方式固定果蝇幼虫，从而实现活体成像。将三龄幼虫放入芯片中，并加入一些油以帮助密封幼虫。接着，将芯片置于幼虫上方，使其身体恰好位于腔室内。将芯片连接至注射器，以便施加真空。幼虫的运动受到限制，动物腹侧的结构被推近至盖玻片。利用共聚焦显微镜可轻松成像，例如感觉神经元轴突末端的细节，以及诱导神经损伤后节段神经的再生情况。其他用于固定活体成像、大量氯仿乙醚或异氟烷麻醉剂中 josepha 的方法。该技术的主要优势在于避免了此类毒素的使用，从而防止其干扰动物的生理状态。由于无需使用毒素，带来的额外好处是幼虫更安全，便于操作。牢固的固定效果使得研究人员能够对快速事件进行成像，例如快速的轴突运输以及细胞内钙离子浓度的变化。单个幼虫可在芯片中被固定并多次成像，从而实现长时间的活体观察。可对持续长达72小时的生物学过程进行成像。开始前，请先获取一个PDMS芯片样品以尝试本实验方案。使用21号分注针，可参照文字方案阅读如何从SU八孔模具制备A-P-D-M-S芯片。在PDMS芯片的真空端口处打孔，以用于倒置显微镜。将23号针头从其基部取下，通过几次扭转移除锁紧接头。然后将针尖插入一小段聚乙烯管中，确保管子覆盖针尖至少一毫米。使用剃刀片切去多余的管子，留下一个可形成密封的塑料环。将23号针头插入真空端口的孔中。对于直立式显微镜，使用21号点样针在PDMS芯片侧面再刺一个孔。此孔将从侧面提供对第一个孔的通路。然后将23号针头尖端和导管环插入侧面孔中。在PDMS芯片顶部孔的上方贴上一片双面胶带以密封顶孔。将一段20厘米长的聚乙烯导管一端连接到插入芯片真空口的针头尖端，另一端连接至三通阀的一个端口。然后将一个20毫升的注射器连接到阀门剩余两个端口中的一个，使最后一个端口保持开放。用透明胶带清洁PDMS芯片。将一段胶带贴在芯片底部。确保胶带接触整个PDMS表面，然后撕下胶带。重复此清洁方法三次。由于PDMS芯片可重复使用，彻底清除油渍残留非常重要，因为油渍可能影响PDMS与玻璃之间的粘附性，进而影响早期觅食行为的转移。将三龄幼虫从培养基转移到含有水的培养皿中。幼虫长度必须在3.5至4毫米之间，以确保能够正确适配芯片。用清水清洗幼虫，去除培养基。接下来，在玻璃盖玻片中央滴加一滴Halo Carbon 700油，用镊子轻轻夹取一只已清洗过的幼虫，短暂地将其放在轻质擦拭纸上吸干，然后转移到油滴中静置10秒。油滴应足够小，以确保幼虫的气管未被油覆盖。然后将幼虫短暂地转移到干净的玻璃盖玻片上，再移至另一张盖玻片，以进一步去除少量油。注意幼虫的方位，以便成像神经索和节段神经。腹面应朝下，易于识别的气管应朝上。现在将PDMS芯片轻轻放置在幼虫上方。将幼虫对齐至微腔室的中心位置，使其后端朝向真空口，且幼虫不接触腔室边缘。对齐后，将PDMS芯片紧压在玻璃盖玻片上，以形成良好的密封。然后仔细检查幼虫是否完全封闭在微腔室内。现在将三通阀切换至注射器。牢固握住PDMS组件，并拉动注射器活塞，抽出2至2.5毫米的空气，直至感到阻力为止。从而形成真空。然后关闭阀门。为确保真空维持良好，需仔细检查幼虫。应将幼虫身体固定在微室内部，并确保气管可见。PDMS芯片的其余部分应与盖玻片接触。此类朝向不正确。现在对幼虫进行成像。若使用直立显微镜，用双面胶带将芯片的上侧固定在载物台上。成像完成后，释放真空。然后将PDMS芯片从盖玻片上取下。应立即使用镊子使幼虫活动。将幼虫放回葡萄汁琼脂平板中以恢复。将单个麻醉的幼虫放置于葡萄汁琼脂平板上。在体视显微镜下，将动物腹面朝上放置。为了观察腹神经索和节段神经，请确保幼虫完全不动。定位神经索和唾液腺。注意不要损伤这些结构。找到第三腹节的末端，此处损伤会损害最多的神经，且在不杀死动物的情况下最容易重现。也可使用五号双星镊子在更靠后的节段进行损伤操作。通过角质层紧紧夹住节段神经5到10秒。操作正确时，角质层保持完整，体壁不会被刺穿。掌握该操作需要在将动物腹侧朝下放置于大培养皿后进行练习。动物应能够移动头部并进食。如果损伤成功，则幼虫的后半部分将出现瘫痪。利用幼虫芯片对单个外周轴突内由驱动蛋白介导的突触小泡运输过程进行成像。这些小泡的顺行运动速度约为每秒1.0微米，逆行运动速度为每秒0.8微米。采用固定技术，利用脉冲紫外染料激光进行激光显微手术。借助基因编码的指示剂，可观察特定神经元中的钙离子水平。在感觉神经元之后，G camp 3.0检测到钙离子尖峰。树突被横断。在成像过程之间让动物休息，可以随时间观察细胞事件。在挤压运动神经元的轴突后，近端轴突残端出现了新的出芽。与此同时，远端轴突通过华勒变性过程形成串珠状结构并发生断裂。利用幼虫芯片进行追踪，还可实现体内荧光蛋白的光转化。在IV类感觉神经元中表达的DRA-α微管蛋白融合蛋白，可在胞体部位进行光转化。在两天内，大量光转化蛋白被转运至感觉神经元的轴突末梢，距离细胞体的原始位置约一毫米。观看本视频后，您应能充分掌握如何利用幼虫芯片对果蝇幼虫进行活体成像，以及如何实施神经 crush 损伤实验。一旦熟练掌握这些技术，仅需几分钟即可将幼虫放置到显微镜下进行观察。神经挤压操作同样迅速，因此这些方法可用于大规模实验，例如遗传学研究。该芯片可用于成像果蝇幼虫腹侧的结构。这些组织包括但不限于肌肉、神经肌肉接头突触、感觉神经元、外周神经以及腹神经索。该方法也可用于幼虫心脏、唾液腺和气管的活体成像。本视频中使用的幼虫芯片适用于体长在3.5至4毫米之间的动物。对于成像需求更小或更大的动物，可轻松制作具有更小或更大腔室的芯片。有关制作PDMS芯片的补充设计文件和说明，请参见相关材料。制作PDMS芯片的详细步骤已包含在书面实验方案中。如果您与我们联系，我们可以寄给您一个样品芯片。

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