使用微流体芯片实时成像和损伤研究的响应果蝇幼虫

以下实验的总体目标是使用改良的微流体室无创固定果蝇幼虫以进行实时成像。星形幼虫的第三个被放置在芯片中，并带有一些油以帮助密封幼虫。接下来，将芯片放在幼虫的顶部，使其身体适合腔室。

芯片连接到注射器，以便可以施加真空。幼虫的运动受到限制，动物腹侧的结构被推到靠近盖玻片的地方。使用共聚焦显微镜，很容易对结构进行成像，例如感觉神经元轴突末梢的细节，以及诱导神经损伤后节段神经的再生。

固定 josepha 以进行实时成像的其他方法、巨大的氯仿醚或 ISO 麻醉剂。这种技术的主要优点是它避免了干扰动物生理机能的巨大毒素。没有毒素的额外好处是 GB 幼虫安全且可以一起工作 强大的固定化允许对快速事件进行成像，例如更快的轴突运输和细胞内钙的变化。

单个幼虫可以固定在芯片中并多次成像。这允许时间寿命。对长达 72 小时内发生的过程进行成像首先获取样本 PDMS 芯片以试用此方案。

有关如何使用 21 号点胶针从 SU 8 模具制作 A-P-D-M-S 芯片的说明可以在文本协议中阅读。在倒置显微镜的 PDMS 芯片的真空端口上戳一个孔。从底座上取下一根 23 号针，扭动几下锁定轮毂。

然后将针尖插入一小块聚乙烯管中，使管子至少覆盖针头一毫米。使用剃须刀片剪掉多余的管路。这留下了一个可以密封的塑料环。

将 23 号针尖插入真空端口的孔中。对于正置显微镜，用 21 号分配针在 PDMS 芯片的侧面戳第二个孔。这个洞将提供从侧面进入第一个洞的通道。

然后将 23 号针尖和管环插入侧孔。在 PDMS 芯片的顶部贴上一块双面胶带，以密封顶部孔。在插入芯片真空端口的针尖和三通阀的一个端口之间连接一根 20 厘米长的聚乙烯管。

然后将 20 毫升注射器连接到阀门的其余两个端口之一，使最后一个端口保持打开状态。用透明胶带清洁 PDMS 芯片。将一条胶带贴在芯片底部。

确保胶带接触整个 PDMS 表面，然后撕下胶带。重复此清洁方法三次。由于 PDMS 芯片是可重复使用的，因此去除油残留物非常重要，因为它会影响 PDM 与玻璃的粘附力 Transfer 早期觅食。

第三龄幼虫从食物中转移到装有水的培养皿中。它的长度必须在 3.5 到 4 毫米之间，才能正确安装芯片。给幼虫洗澡以去除培养基。

接下来，使用镊子在玻璃盖玻片的中心滴一小滴 halo carbon 700 油，轻轻地拾取洗净的幼虫。将其短暂地放在轻质抹布上以毛巾擦掉，然后将其移至油中 10 秒钟。液滴应足够小，以便幼虫的气管没有涂层。

然后将幼虫短暂地放在干净的玻璃盖玻片上，并将其移动到另一个盖玻片上。从而去除更多的油。注意幼虫的方向，对神经索和节段神经进行成像。

腹侧应向下。容易识别的气管插管应向上。现在轻轻地将 PDMS 芯片放在幼虫的顶部。

将幼虫与微室的中心对齐。由于幼虫的后部朝向真空端口，因此不应接触腔室的边缘。对齐后，将 PDMS 芯片推向玻璃盖玻片，以实现良好的密封。

然后仔细检查幼虫是否完全封闭在微室中。现在将三通阀切换到注射器。牢牢握住 PDMS 组件并拉动注射器柱塞以抽出 2 到 2.5 毫米的空气，直到感觉到阻力。

从而创造了一个真空。然后关闭阀门。为了小心地保持真空，请仔细检查幼虫。

它的身体应该固定在微腔内，气管应该是可见的。PDMS 芯片的其余部分应与盖玻片接触。此类方向不正确。现在对幼虫进行成像。

如果使用正置显微镜，请用双面胶带将芯片的顶部固定在载物台上。成像完成后，释放真空。然后从盖玻片上拆下 PDMS 芯片。

幼虫应立即使用镊子活动。将幼虫放回葡萄汁琼脂平板中进行回收。将单个麻醉的幼虫放在葡萄汁琼脂板上。

在立体显微镜下，将动物腹侧向上转动。要可视化腹侧神经索和节段神经，请确保幼虫完全不动。找到神经索和唾液腺。

重要的是不要损坏这些结构。找到第三个腹段的末端。这里的伤害对神经的损害最大，并且最容易在不杀死动物的情况下繁殖。

双星 5 号镊子在更后部进行损伤。通过角质层紧紧捏住节段性神经 5 到 10 秒。如果作正确，角质层保持完整，体壁不会被刺穿。

在受伤后将动物腹侧朝下放在大板上后，将进行精通。它应该能够移动头部并吃东西。如果受伤成功，那么幼虫的后半部分将瘫痪。

幼虫芯片用于对驱动蛋白介导的突触小泡在单个外周轴突内的转运进行成像。这些囊泡的肠道级运动以每秒约 1.0 微米的速度测量。逆跳运动的采样速度为每秒 0.8 微米。

技术用于使用脉冲紫外染料激光的激光显微外科手术。由于基因编码的指标，在特定神经元中观察到钙水平。G camp 3.0 在感觉神经元后检测到钙尖峰。

树突被横断。允许动物在成像会话之间休息，可以观察细胞事件随时间的变化。在粉碎 emeric 运动神经元的轴突后，近端轴突残端经历了新的发芽。

同时，远端轴突形成静脉曲张，并在 wallerian 变性过程中变得碎片化。在体内使用幼虫芯片跟踪光转换的荧光蛋白也是可能的。在 4 类感觉神经元中表达的 DRA 双 α 微管蛋白融合蛋白在细胞体中被光转化。

在两天内，大量光转化蛋白被重新定位到距离细胞体内原始位置约一毫米的感觉神经元的轴突末梢。观看此视频后，您应该对如何利用幼虫芯片对果蝇幼虫进行实时成像以及如何进行神经挤压伤有很好的了解。一旦掌握了这些技术，就可以在短短几分钟内将幼虫定位在显微镜上。

神经被压碎也同样快。因此，这些程序可用于大规模实验，例如遗传学位。该芯片可用于对果蝇幼虫腹侧的结构进行成像。

这些包括但不限于肌肉、神经肌肉接头突触、感觉神经元、周围神经和腹侧神经索。该程序还可用于对幼虫心脏、唾液腺和气管进行实时成像。本视频中使用的幼虫芯片尺寸为 3.5 至 4 毫米长的动物。

对于更小或更大的成像，可以很容易地制作具有较小或较大腔室的动物芯片。请参阅制作 PDMS 芯片的补充设计文件和说明。制作 PDMS 芯片的说明包含在书面协议中。

如果您联系我们，我们可以向您发送样品芯片。