单乳液或双乳液法结合维生素E-TPGS制备PLGA纳米颗粒

本实验的总体目标是制备尺寸可调的聚合物纳米颗粒。首先将聚合物溶解于有机溶剂中，并加入药物或荧光包埋物；第二步是将聚合物溶液与含有乳化剂的水相进行乳化，随后在更大的水相体积中使颗粒固化，同时溶剂逐渐挥发。

接下来，将颗粒通过离心收集并洗涤，随后进行冻干以长期保存。最后一步是利用扫描电子显微镜（SEM）成像对纳米颗粒的尺寸和表面形貌进行表征。最终，通过SEM证明，通过调节乳化剂浓度可以控制纳米颗粒的尺寸。

该技术的应用前景可拓展至多种人类疾病的治疗，因为可对颗粒进行定制，以包封并递送多种治疗剂，实现持续作用。在靶组织中。该方法的可视化演示至关重要。

乳化步骤难以掌握，因为乳化形成过程中的细微差异可能对纳米颗粒的性质产生显著影响。开始制备纳米颗粒时，将约100毫克聚乳酸-羟基乙酸共聚物（又称PLGA）放入一支13 × 100毫米的试管中。然后使用玻璃刻度移液管向样品中加入1毫升乙酸乙酯，用铝箔封住试管口，再用封口膜将铝箔牢固密封。

务必用封口膜紧密包裹小瓶的顶部边缘和铝箔的底部边缘，以防止溶剂蒸发。在试管上标记溶剂的液面位置，静置过夜使聚合物充分溶解。次日，若发生溶剂蒸发，需补充适量溶剂。

在靠近超声仪的通风橱内准备好以下仪器和材料。将两支带有橡胶吸头的小型玻璃巴斯德移液管置于涡旋振荡器上，并准备磁力搅拌器。此外，在超声仪下方的支架上放置一个盛满冰水的大烧杯。

接下来，将45毫升0.3%（质量/体积）的维生素E-TPGS加入200毫升玻璃烧杯中，然后将搅拌速度设定为360 RPM。再将2毫升0.3%（质量/体积）的维生素E-TPGS加入一支13 × 100毫米的玻璃试管中。为了混入疏水性试剂，将包封材料直接加入聚合物溶液中，注意避免接触试管壁，并涡旋振荡试管，直至包封材料均匀分散。

对于亲水性物质，将包封剂与聚合物溶液进行乳化。将最多50微升的缓冲液中药物加入聚合物溶液表面。在冰上对混合物进行超声处理约10秒，直至溶液变为不透明且均匀。

接下来，将装有维生素E-T-P-G-S的试管垂直握住，在高速下涡旋振荡。将玻璃移液管尖端保持在涡旋试管液面以上一到两厘米处，缓慢地将聚合物溶液逐滴加入涡旋液表面。注意，在全部聚合物溶液添加完毕后，移液管尖端不得接触试管内壁。

继续涡旋该溶液。现在乳化15秒。立即将乳化的聚合物转移至超声仪中。

将试管保持浸没在冰水中，对乳液进行三次、每次十秒的超声处理。在超声过程中上下移动探头以确保均匀处理，并避免探头接触试管壁或底部。每次十秒超声处理之间暂停五到十秒，使溶液冷却后再继续操作。

然后将一到两毫升的0.3%维生素E-T-P-G-S从搅拌溶液中加入乳化液中。这将稀释乳化的聚合物，使其更易于倾倒，将乳化液倒入搅拌溶液中。用搅拌溶液冲洗试管中残留的任何溶液。

搅拌三小时使纳米颗粒固化。若包封材料对光敏感，需用铝箔包裹烧杯，但保持杯口敞开，以促进溶剂挥发。收集纳米颗粒时，先将样品均分为两份，分别加入标称体积为30毫升的橡树岭离心管中，并确保两管质量相差不超过0.1克。随后，在固定角度转子中以17,000 ×g离心15分钟。

RC f. 延长离心时间将有助于收集到更高比例的小尺寸纳米颗粒。弃去上清液时需小心，避免扰动纳米颗粒沉淀。

加入5毫升蒸馏水，使用水浴、振荡器和涡旋振荡器将纳米颗粒完全悬浮。将两个离心管中的内容物合并至一个离心管中，并加入20毫升蒸馏水，总体积为30毫升。然后重复离心和洗涤步骤两次，共洗涤三次。

最后一次沉淀物重悬后的液体体积应为四到五毫升。将端粒酶自由的纳米颗粒留出一小部分用于扫描电镜成像，并将其余部分冷冻。加入质量比为1:2的TLO与聚合物作为冷冻保护剂，以实现PLGA纳米颗粒均匀且完全的重悬悬浮。

这将防止形成可能损伤颗粒表面并诱导聚集的冰晶。将纳米颗粒转移至已预称重的5毫升离心管中，然后在-80°C下冷冻至少30分钟。接着，打开管盖，并用橡皮筋将实验室用纱布固定在管口上覆盖管口。

操作需迅速，以防内容物融化；若已融化，需在放入冻干机前重新冷冻。将5 mL样品置于冻干机中冻干72小时。随后盖上盖子，并用封口膜密封试管，于-80 °C保存冻干颗粒。

成像当天，将一条双面导电碳胶带贴在扫描电镜样品台（SEM stub）上。用永久性记号笔在样品台的金属部分标记，以便后续参考。使用金属刮刀取少量冻干的纳米颗粒，并轻轻将其均匀分散在胶带表面。

用实验室纸巾轻刷载片表面，或使用压缩空气去除松散的纳米颗粒。使用5至15毫米的工作距离、5至12千伏的电子束强度以及1至3的束斑尺寸观察颗粒；更高的束流强度可能导致样品局部受热，从而改变颗粒的表面形貌。微粒在100倍放大倍数下可见，而纳米颗粒在3000倍下可被分辨。

放大聚焦于球体顶部，以定位可轻松通过扫描电镜（SEM）观察的颗粒；每批样品至少采集三张图像，以获得具有代表性的颗粒尺寸和形貌信息。采用该方法制备的颗粒由单次乳化过程形成，呈现为独立的、未融合的球形颗粒，表面形貌光滑，且在整个样品中分布有较宽范围的粒径。此处所示微粒的平均直径为730纳米。

此处展示的是通过单一乳化剂制备的、包载疏水性药物坎平的纳米颗粒。这些颗粒尺寸更小，平均直径为340纳米。乳化剂浓度越高，所得颗粒越小，其平均直径从2000纳米降至200纳米。

随着乳化剂浓度从0.01%增加到0.3%，此处所示的SEM图像反映了这一变化。然而，当维生素E-T-P-G-S的浓度过高时，例如使用1%维生素E-T-P-G-S时，未形成独立的颗粒，整个结构中均可见严重的融合现象和片状结构。确实如此。一旦掌握了通过乳化法制备PLG纳米颗粒的方法，便可进一步采用其他方法，如表面修饰，以设计能够与特定细胞类型或体内特定区域相互作用的纳米颗粒。

观看本视频后，您应能充分理解如何通过乳化法制备具有可重复性和可调控粒径的微粒。