Name: 由维生素 E-TPGS 单乳液或液形成的 PLGA 纳米颗粒 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-27T14:15:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: 学习使用维生素E-TPGS乳化剂制备PLGA纳米颗粒的方法，通过调节乳化剂浓度控制粒径在220纳米至1.98微米之间。该技术可应用于药物递送系统的开发与研究。

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1. 纳米颗粒制备
所有涉及溶剂或溶解/乳化聚合物的操作步骤均应在化学通风橱中进行。
<ol>
	<li>称取 100 mg（±5 mg）聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA），置于一支 13 mm × 100 mm 的试管中。</li>
	<li>使用玻璃刻度移液管将 1 ml 溶剂（乙酸乙酯（EtAc）或二氯甲烷（DCM））转移至样品中。</li>
	<li>用一小片铝箔覆盖试管口，并用封口膜将铝箔牢固密封，确保封口膜紧密包裹在试管顶部边缘以及铝箔的底部边缘。</li>
	<li>在试管外壁标记溶剂液面位置。让聚合物过夜溶解，若次日发生溶剂挥发，则补充适量溶剂。 
	注意：如需要，也可在制备纳米颗粒当天溶解聚合物。按步骤 1.1–1.3 操作后，高速涡旋直至聚合物完全溶解（约 10 分钟）。</li>
	<li>在通风橱内准备操作区域，将以下设备/材料放置在超声仪附近：涡旋振荡器、两个带橡胶吸头的小型玻璃巴斯德移液管，以及磁力搅拌器。在超声仪下方的支架上放置一个盛有冰水的大烧杯。</li>
	<li>在装有磁力搅拌子的 200 ml 玻璃烧杯中加入 45 ml&#160;0.3% w/v 维生素 E-TPGS 溶液，并将搅拌速度设定为 360 rpm。</li>
	<li>在一支 13 mm × 100 mm 玻璃试管中加入 2 ml&#160;0.3% w/v 维生素 E-TPGS 溶液。</li>
	<li>加入药物： 
	对于疏水性物质：将包封物直接加入聚合物溶液中（注意避免接触试管壁），涡旋试管直至包封物均匀分散。 
	对于亲水性物质：在进行下一步前需先将包封物与聚合物溶液乳化。将最多 50 μl&#160;水或缓冲液中的药物加至聚合物溶液表面。短暂超声处理以使药物与聚合物乳化（通常为 10 秒，或根据需要达到均匀不透明溶液为止）。此超声步骤应在冰上进行。</li>
	<li>将装有聚合物/包封物的敞口试管置于涡旋振荡器附近。手持装有维生素 E-TPGS 的试管保持垂直并高速涡旋，同时使用玻璃巴斯德移液管将聚合物/包封物溶液逐滴加入。注意避免接触试管壁，应将聚合物溶液直接滴加至涡旋乳化剂的液面中心。当全部 1 ml&#160;聚合物溶液加入维生素 E-TPGS 后，继续涡旋混合液（现为乳剂）额外 15 秒。</li>
	<li>立即将乳化后的聚合物转移至超声仪中。保持试管浸没于冰水中，以三段式脉冲方式进行超声处理，每段 10&#160;秒（700 W 超声仪设置为 40% 振幅，探头尖端尺寸为 1/8 in&#160;）。上下移动乳剂以确保超声均匀，注意避免探头接触试管壁或底部。每次 10 秒超声后暂停，使溶液冷却后再继续下一次超声。</li>
	<li>使用玻璃巴斯德移液管从正在搅拌的溶液中取出 1–2 ml&#160;0.3% 维生素 E-TPGS 溶液加入乳剂中，以稀释乳化后的聚合物，使其更易倾倒。将乳剂全部倒入正在搅拌的溶液中。重复此步骤，以冲洗试管中残留的溶液并转移至搅拌液中。</li>
	<li>持续搅拌三小时，使纳米颗粒固化。若包封物对光敏感，可用铝箔包裹烧杯（顶部留空），以促进溶剂挥发并避光。</li>
</ol>
2. 纳米颗粒收集
<ol>
	<li>将硬化后的纳米颗粒分装至两个橡树岭离心管（30 ml）中&#160;标称体积）并称重至0.1 g。</li>
	<li>在固定角转子中以17,000 x g离心纳米颗粒15分钟&#160;g. 延长离心时间将导致收集到更小粒径纳米颗粒的比例增加。</li>
	<li>弃去上清液，注意不要扰动纳米颗粒沉淀（可倾倒或用移液器吸除）。加入 15 ml&#160;二氢（dihydro, diH）2O，并使用水浴超声仪和/或涡旋振荡器彻底重悬纳米颗粒。</li>
	<li>将两个离心管中的内容合并至一个离心管中，并重复步骤 2.1–2.3 两次，共计在 30 ml 溶液中洗涤三次&#160;二氢化物2每次操作时，最后一次沉淀重悬的液体体积应为4-5 ml。 
	此时可加入海藻糖：聚合物质量比为1:2作为冷冻保护剂（可取少量不含海藻糖的纳米颗粒样品用于扫描电镜成像）。冷冻过程中形成的冰晶可能损伤颗粒表面并引起聚集，而添加海藻糖已被证明可改善PLGA纳米颗粒的均匀性和完全再分散性13.</li>
	<li>将纳米颗粒转移至预先称重的5 ml离心管中&#160;离心管，于 -80 °C 冻存至少 30 分钟。</li>
	<li>动作要迅速，以免冷冻内容物融化，打开管盖后，用橡皮筋将实验室用纸固定在管口上。**若发生任何融化现象，需先重新冷冻，再放入冻干机中。</li>
	<li>冻干 72 小时，体积为 5 ml&#160;体积。将冻干颗粒用封口膜包裹后，于 -80 °C 保存在离心管中。</li>
</ol>
3. 尺寸与表面形貌
扫描电子显微镜
<ol>
	<li>扫描电镜样品应在成像当天制备。将一条双面碳导电胶带贴在电镜样品台表面。可用永久性记号笔在样品台的金属部分做标记，以便后续识别。</li>
	<li>使用金属药匙取少量冻干的纳米颗粒，并轻轻将其均匀分散在胶带表面。用实验室擦拭纸轻刷样品台表面，或使用压缩空气吹扫，以去除未牢固附着的颗粒。</li>
	<li>用金-钯合金对样品进行溅射镀膜，时间为30–120秒。较长的溅射时间可获得更光滑的成像表面，但可能导致颗粒表面细微结构的丢失。</li>
	<li>观察颗粒的典型成像参数为：工作距离5–15 mm，电子束电压5–12 kV，束斑大小1–3。较高的电子束电压可能导致样品局部加热，从而改变颗粒的表面形貌。微米级颗粒在100倍放大下可见，而纳米级颗粒需在3,000倍放大下才能清晰分辨。</li>
	<li>理想的样品应是在样品台平坦表面上均匀分布的颗粒单层。冻干过程中偶尔会形成次级结构（如片状或球状聚集体）。聚焦于片状物边缘（片状物与胶带交界处）或球状结构的顶部，有助于找到适合扫描电镜观察的颗粒。每批样品应至少采集三幅图像，以获得具有代表性的颗粒尺寸与形貌信息。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

PLGA 颗粒通常通过单乳化法或双乳化法制备，该方法能够定制颗粒的特性，如粒径、包封物和表面性质7。这些及其他特性取决于多种变量，包括溶剂类型、投料比例、乳化方法和乳化剂类型。然而，根据我们的经验，单个实验人员有可能制备出性质一致的颗粒。使用相同方案，一名训练有素的实验人员独立制备了七批纳米颗粒，其平均直径分别为：317 nm±99、342 nm±112、298 nm±104、361 nm±110、339 nm±115、360 nm±123 和 364 nm±110。将该训练有素的实验人员的各批次数据取平均值，得到平均粒径为 340 nm±25，批内标准差平均值为 110 nm±8。第二名实验人员由第一名培训后，使用相同方案制备的纳米颗粒平均粒径为 328 nm±138。然而，第三名实验人员虽已独立制备纳米颗粒数月，但按照相同方案所得颗粒的平均粒径为 220 nm±70。因此，尽管有可能制备出在预期粒径范围内的颗粒，但这依赖于对细微实验操作的精确重复。合并多批次样品可能有助于生产具有相同总体特性的大量纳米颗粒。例如，当我们对纳米颗粒进行表面修饰以用于体外（in vitro）或体内（in vivo）研究时，会同时制备多批（最多6批）每批200 mg的样品，经洗涤、收集后混合至同一管中，再分装进行表面修饰。这可确保不同处理组之间的纳米颗粒粒径、载药量、电荷以及可用于修饰的表面位点比例具有可比性。另一个例子是，若研究变量为不同药物在不同批次纳米颗粒中的疗效，则必须测量并控制载药量的批次间差异。关键在于，每一批次制备的颗粒都必须检测其特性，并在实验设计和重复中控制批次间的变异。
有机相与水相的充分乳化对于形成小颗粒至关重要。聚乙烯醇（PVA）可能是最常用的乳化剂。我们及其他研究者已采用多种乳化和稳定剂，包括维生素E-TPGS。9，聚乙烯醇（PVA）14，跨越15和泊洛沙姆16 （关于用于制备PLGA颗粒的各种试剂的详尽讨论，参见Wischke的综述） 等17）。充分乳化的聚合物应呈现为均匀的乳白色/不透明溶液。乳化效果差（或 &#34;破碎的&#34;乳液将呈现宏观的不均一性或颗粒状，甚至可能在试管中分离为两个明显不同的层。这通常表明纳米颗粒未能成功形成。如果在步骤1.9之后未立即将乳液转移至超声仪，乳液可能发生破裂。若发生此情况，应再次涡旋至均匀，并立即进行超声处理。在超声步骤（1.10）之后不应出现相分离。一旦颗粒已分散至较大体积的水相中（步骤1.11），溶液应呈现均匀的不透明至微透明状态。随着颗粒尺寸减小，透明度会增加，极小的纳米颗粒可能呈现出蓝色调。若颗粒包载了药物，则可能观察不到该色调。如果乳液无法均匀分散至大量水相中，或呈现颗粒状，则不应继续实验。观察到颗粒沉淀物的外观及其凝聚状态存在一定程度的差异属于正常现象。某些沉淀物可在轻微涡旋后重新悬浮，而另一些则可能需要数分钟的水浴超声处理。重新悬浮过程不应超过5分钟。冻干后的颗粒可能呈现多种质地，从棉絮状至自由流动状不等。
PLGA 作为纳米颗粒材料的众多优势之一，在于能够优化制备工艺，以制得适用于特定应用需求的颗粒尺寸。相较于小尺寸纳米颗粒，大尺寸纳米颗粒可包载更高比例的疏水性药物（相对于聚合物质量），但药物释放动力学也可能受到影响18-20。纳米颗粒的尺寸直接影响细胞对颗粒的内吞机制及其在组织中的分布，从而导致递送效率产生显著差异。例如，单核吞噬细胞系统会识别并清除血液循环中大于 1 μm 的颗粒。小尺寸纳米颗粒可能适用于直接脑内输注，因为较大颗粒会被致密的细胞外基质截留；小尺寸纳米颗粒的递送还可能通过增强的渗透与滞留效应（EPR 效应）实现对肿瘤的被动靶向。药物包封效率存在较大差异，具体取决于药物本身的特性、颗粒尺寸以及乳化剂的性质（即&#160;其在水相与有机溶剂中的溶解度）。单乳与双乳乳化方法也会影响药物载量和纳米颗粒尺寸。相较于双乳化法，采用单乳化法包载疏水性物质可能有助于制备超小尺寸纳米颗粒。关于该主题的详细讨论，建议读者参考其他相关文献资料23-28。最后，还存在其他可选的乳化方法，包括高速均质化，这些替代方法可能在特定药物或药物递送应用中具有优势29。
单乳液法为多种配方参数的调整提供了空间，每个参数都可能改变纳米颗粒的特性。例如，改用二氯甲烷（DCM）作为溶剂通常会生成粒径更大且分布更宽的纳米颗粒。由于乙酸乙酯（EtAc）可与水混溶，初级乳液中聚合物液滴的表面张力降低，从而形成更小的纳米颗粒。可用相同体积的EtAc替代DCM。也可使用其他溶剂或溶剂混合物以优化药物包封效率和颗粒特性。其他配方参数同样会影响颗粒尺寸：例如，增加溶剂体积、溶剂与聚合物的比例、超声强度，或离心速度与时间，均会导致所收集颗粒的尺寸减小。可通过连续离心（例如&#160;先进行快速低速离心以去除较大颗粒，再进行较长时间的高速离心以收集超小颗粒）或过滤方法对颗粒进行尺寸分级。
在此，我们描述了可实现制备平均直径在220 nm至1.98 μm范围内的PLGA颗粒的配方参数。这些用于制备PLGA颗粒的方法可用于优化颗粒设计（尺寸、包封物及表面特性），以满足未来药物递送应用的需求 体外 或 体内.

近几十年来，聚合物作为药物递送载体的应用日益广泛，涵盖从靶向肿瘤治疗1到免疫系统调节2等多个领域。与游离给药相比，聚合物包封或&#160;偶联的药物通常具有更高的疗效，因为与聚合物结合的药物可免受降解。这种保护作用可延长药物的生物半衰期，并可能在降低全身副作用的同时提高治疗效果3-5。
聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）具备纳米级递送系统的多种理想特性，可实现包封药物的长期释放，并降解为生物相容性的乳酸和羟基乙酸产物。包封于PLGA中的小分子、蛋白质和核酸在多种疾病应用中已显示出增强的活性8。重要的是，该材料平台便于对粒径、电荷以及配体的表面展示等特性进行灵活定制，从而实现颗粒向特定组织的靶向递送或用于成像目的。由于PLGA已以可生物降解缝合线的形式在人体中应用（例如 Purasorb、Purac Biomaterials 和 Vicryl、Ethicon Inc.），其临床转化潜力较高。
油-水（单重）乳液或水-油-水（双重）乳液是一种可用于将疏水性和亲水性药物以微米或纳米级形式包封于PLGA中的方法。简而言之，将PLGA溶解于有机相（油相）中，并在表面活性剂或稳定剂存在下与水相乳化。疏水性药物可直接加入油相，而亲水性药物（水溶性药物）则可先与聚合物溶液乳化，再进行颗粒的形成。高强度超声处理有助于形成细小的聚合物液滴。随后将所得乳液加入大量水相中并搅拌数小时，使溶剂挥发。通过离心收集固化后的纳米颗粒并进行洗涤（图1）。
本文介绍了一种使用单乳化法和双乳化法制备聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）纳米颗粒的技术，以乙酸乙酯（EtAc）作为溶剂，维生素E- D-α-生育酚聚乙二醇琥珀酸酯（TPGS）作为乳化剂。与其它类型的稳定剂相比，使用维生素E-TPGS具有多种潜在优势例如&#160;聚乙烯醇（PVA），包括改善的乳化和包封效率。其他研究团队已报道维生素E-TPGS的优势，例如抑制P-糖蛋白（P-gp），这是一种跨膜外排蛋白，在癌细胞中常过表达，可通过将药物泵出靶细胞而引起耐药性。此外，我们展示了如何利用扫描电子显微镜（SEM）对颗粒进行表征和粒径测定，并进一步提供了通过调整实验方案实现粒径调控的操作指导。

<table><tbody><tr><td>聚乳酸-羟基乙酸共聚物 &amp;nbsp; (PLGA)</td><td><a href="http://www.absorbables.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Lactel</a></td><td>B6010-2P</td><td>特性粘度：0.55–0.75 dl/g</td></tr><tr><td>乙酸乙酯 (EtAc)</td><td>Sigma</td><td>270989</td><td></td></tr><tr><td>二氯甲烷 (DCM)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>维生素E聚乙二醇1000琥珀酸酯 (Vitamin E TPGS)</td><td>Sigma</td><td>57668</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯醇</td><td></td><td></td><td>87–89% 水解，30,000–70,000 Da</td></tr><tr><td>设备</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>超声破碎仪</td><td>Fisher Scientific</td><td>Model 705</td><td>700 W（超声波发生器）</td></tr><tr><td>超声探头</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>1/8 英寸</td></tr><tr><td>涡旋振荡器</td><td>VWR</td><td>58816-121</td><td></td></tr><tr><td>多位置搅拌器</td><td>Corning</td><td>MP5I</td><td></td></tr><tr><td>超速离心机</td><td>Beckman-Coulter</td><td>L8-80M</td><td></td></tr><tr><td>固定角转子</td><td>Beckman-Coulter</td><td>50.2TI</td><td></td></tr><tr><td>水浴超声仪</td><td>Fisher Scientific</td><td>FS30</td><td></td></tr><tr><td>冷冻干燥机</td><td>Millrock</td><td>BT85</td><td></td></tr></tbody></table>

单乳液或双乳液法结合维生素e-tpgs制备plga纳米颗粒

PLGA Nanoparticles Formed by Single- or Double-emulsion with Vitamin E-TPGS

聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）是一种生物相容性良好的可生物降解聚合物，属于脂肪族聚酯家族。由于其已被美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于人体（如可吸收缝合线），PLGA长期以来一直是药物递送应用的热门选择。疏水性和亲水性药物可通过单乳法或双乳法制备成PLGA微粒。简而言之，将药物溶解于聚合物中，或与聚合物在有机相中乳化，随后将该有机相乳化于水相中。待溶剂挥发后，通过离心洗涤并收集微粒，再进行冻干以实现长期保存。PLGA在水性环境中通过水解缓慢降解，包封的药物可在数周至数月内持续释放。尽管PLGA在药物递送方面具有诸多优势，但纳米颗粒的可重复制备仍具挑战性；不同设备、试剂批次以及乳化方法的细微差异均可能引入显著的实验变异性。本文中，我们将详细描述使用乳化剂维生素E-TPGS通过单乳法或双乳法制备微粒和纳米颗粒的过程及其表征方法。采用扫描电子显微镜（SEM）测定颗粒的形貌和粒径。我们提供了在不同乳化剂浓度下制备的纳米颗粒的代表性SEM图像，并展示了成像伪影及乳化失败的示例。本方案可轻松调整，以使用其他乳化剂（例如 聚乙烯醇，PVA）或溶剂（例如&#160;二氯甲烷，DCM）。

采用本方案制备的PLGA微粒和纳米粒的代表性扫描电镜图像如图2a和2b所示。颗粒呈独立、未融合的球形，表面形态光滑，且在样品中分布有较宽范围的粒径。
为确定每批颗粒的平均直径，需使用 ImageJ 软件中的“测量”功能直接对扫描电镜（SEM）图像进行测量。应从视野中随机选取至少 150 个颗粒进行直径测量，以获得具有代表性的粒径分布。一批颗粒的平均粒径取决于配方参数。例如，在图 2a中，采用 1 ml 溶剂与 100 mg PLGA 的比例，并在乳化相中加入 0.05% 的维生素 E-TPGS，制备得到微粒（平均直径为 730 nm±370）；而在图 2b中，采用 4 ml 溶剂与 200 mg PLGA 的比例，包载疏水性药物喜树碱，并在乳化相中使用 0.3% 的维生素 E-TPGS，制备得到纳米粒（平均直径为 340 nm±70）（完整配方参数见图注）。一般而言，乳化剂浓度越高，所得颗粒越小，通过调节乳化剂浓度在 0.3% 至 0.01% 范围内，可实现 220–2,000 nm 的平均粒径范围（图 3）。
我们的产率范围为74-98%（由一名实验人员制备的22批纳米颗粒，使用不同的溶剂、乳化剂和乳化条件）。对于更大尺寸的样品，可能会观察到更高的产率&gt;150 nm）批次时需格外注意，因为小尺寸的纳米颗粒在离心和洗涤步骤中容易丢失，尤其是在倾倒上清液时。仔细使用移液器操作液体有助于避免此问题。提高离心速度和/或延长离心时间可通过更有效地收集超小尺寸纳米颗粒并使沉淀更紧密，从而减少洗涤过程中的损失，进而提高产率。本方案主要针对以TPGS为乳化剂、EtAc为溶剂制备纳米颗粒的工艺，但也可使用其他溶剂和/或乳化剂。通常情况下，我们发现与二氯甲烷（DCM）相比，EtAc制得的纳米颗粒尺寸更小且粒径更均一例如 直径分别为540 nm±190（EtAc）和2,160 nm±1,530（DCM）（溶剂中PLGA浓度为100 mg/ml，乳化至2 ml 0.1% TPGS中），这可能是由于EtAc与水混溶，而DCM不溶于水。聚乙烯醇（PVA）是一种常用的乳化剂，已被我们实验室及其他研究团队广泛使用。我们观察到，使用不同批次的市售PVA制备的纳米颗粒存在差异。因此，建议在可能的情况下使用同一批次的PVA储存液，以提高实验的可重复性。根据我们的经验，与TPGS相比，PVA在更高浓度下乳化效果更佳例如 直径为140 nm±48，100 mg/ml PLGA溶于DCM，乳化至2 ml 5% PVA中。
使用扫描电子显微镜（SEM）表征纳米颗粒可能具有挑战性，原因在于设备和成像过程的差异。因此，区分反映颗粒形成问题的形态学特征与成像过程中无意引入的伪影显得尤为重要。融合（Fusing）图4a 和 4b），凹陷（图4c），或开裂（图4f在SEM图像中有时会观察到颗粒的伪影。这些伪影有时表明颗粒形成不良（例如 在 图4a，乳化剂浓度过高导致无法形成离散颗粒）也可能是由于表征方法引入的假象所致（例如 在 图4b，样品在溅射镀膜过程中被加热，且在 图 4c，SEM电子束的局部加热在成像过程中会改变颗粒的表面形貌）。为避免成像伪影，应尽量缩短溅射镀膜时间，并保持较低的电子束功率。较长的溅射时间可观察到更平滑的形貌，但可能导致颗粒发生熔融粘连。溅射时间过短则可能使成像困难，因为颗粒在图像采集过程中会因带电而移动。快速采集图像有助于避免电子束长时间照射及图像畸变图4d 和 4e）。高能电子束照射还可能导致纳米颗粒表面膨胀和开裂（图4f）。如果通过调整表征参数仍无法减少形貌伪影，则这些伪影可能反映了纳米颗粒本身的真实问题。在制备过程中，纳米颗粒的融合可能由超声功率过高导致的过热、溶剂蒸发不完全、洗涤阶段重悬不充分或冻干失败引起。
<img alt="油水分离过程；超声处理、蒸发、收集；冻干示意图。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51015/51015fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51015/51015fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 纳米颗粒制备示意图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51015/51015fig1highres.jpg" target="_blank">点击此处查看大图</a>。
<img alt="纳米颗粒结构（SEM）及尺寸分布（μm，nm），比较分析图。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51015/51015fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51015/51015fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图2. 采用单乳化法所制备的PLGA微粒和纳米颗粒的扫描电镜图像及其相应的尺寸分布。在（A）中，将100 mg PLGA溶解于1 ml乙酸乙酯中，乳化至2 ml 0.05%维生素E-TPGS溶液中，并在45 ml 0.01%维生素E-TPGS溶液中固化成粒。相应的尺寸分布如（C）所示。在（B）中，将200 mg PLGA和40 mg喜树碱溶解于4 ml乙酸乙酯中，乳化至4 ml 0.3%维生素E-TPGS溶液中，并在90 ml 0.3%维生素E-TPGS溶液中固化成粒。相应的尺寸分布如（D）所示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51015/51015fig2highres.jpg" target="_blank">点击此处查看高清图像</a>。
<img alt="粒径分析；柱状图和扫描电镜图像显示TPGS含量对微球粒径的影响。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51015/51015fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51015/51015fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. 粒径取决于乳化剂浓度。 增加维生素E-TPGS浓度可得到更小的纳米颗粒。图中显示了将100 mg PLGA溶于1 ml乙酸乙酯后，分别乳化至（A）0.01%、（B）0.05%、（C）0.1% 或（D）0.3% 维生素E-TPGS溶液，并在45 ml 0.3% 维生素E-TPGS中固化所制备的颗粒的平均直径及其相应的扫描电镜图像。误差线表示单一批次中两张图像共200次直径测量结果的标准偏差。标尺代表5 μm（A-C）和200 nm（D）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51015/51015fig3highres.jpg" target="_blank">点击此处查看高清大图</a>。
<img alt="SEM显微图像，显示颗粒形态和聚集情况。粉末微观结构分析。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51015/51015fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51015/51015fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图4"> 
图4. 通过扫描电镜（SEM）观察到的表面形貌伪影。 在（A）中，整个样品中均存在严重的熔融和片状结构。维生素E-TPGS的浓度过高（1%），导致无法形成独立的颗粒。在（B）中，样品的部分区域发生熔融，但存在大量独立的纳米颗粒区域，尤其是在溅射镀层存在缝隙的位置。我们认为这些熔融伪影是由于溅射镀层过程中产生的加热所致。在（C）中，颗粒初始时表面光滑，但样品持续暴露于SEM电子束下后，出现了凹陷和皱褶。图像（D）是在样品极少暴露于SEM电子束条件下获得的低分辨率图像，颗粒呈现光滑且近圆形的形态。在（E）中，同一样品被更长时间暴露于电子束下，其原始形态发生了明显畸变。在（F）中，高电压（12 kV）下长时间电子束照射导致颗粒受热并出现开裂。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51015/51015fig4highres.jpg" target="_blank">点击此处查看高清大图</a>。

我们描述了使用维生素E-TPGS作为乳化剂制备和表征由聚（乳酸-共-乙醇酸）组成的纳米颗粒和微粒的方法。通过改变乳化剂浓度等配方参数，可制备出平均直径在220 nm至&#160;1.98 µm范围内的纳米颗粒。

单乳液或双乳液法结合维生素E-TPGS制备PLGA纳米颗粒

聚（乳酸-共-乙醇酸）（PLGA）是一种生物相容性的脂肪族聚酯类可生物降解聚合物。PLGA 长期以来一直是一种广受欢迎的……

本实验的总体目标是制备尺寸可调的聚合物纳米颗粒。首先将聚合物溶解于有机溶剂中，并加入药物或荧光包埋物；第二步是将聚合物溶液与含有乳化剂的水相进行乳化，随后在更大的水相体积中使颗粒固化，同时溶剂逐渐挥发。接下来，将颗粒通过离心收集并洗涤，随后进行冻干以长期保存。最后一步是利用扫描电子显微镜（SEM）成像对纳米颗粒的尺寸和表面形貌进行表征。最终，通过SEM证明，通过调节乳化剂浓度可以控制纳米颗粒的尺寸。该技术的应用前景可拓展至多种人类疾病的治疗，因为可对颗粒进行定制，以包封并递送多种治疗剂，实现持续作用。在靶组织中。该方法的可视化演示至关重要。乳化步骤难以掌握，因为乳化形成过程中的细微差异可能对纳米颗粒的性质产生显著影响。开始制备纳米颗粒时，将约100毫克聚乳酸-羟基乙酸共聚物（又称PLGA）放入一支13 × 100毫米的试管中。然后使用玻璃刻度移液管向样品中加入1毫升乙酸乙酯，用铝箔封住试管口，再用封口膜将铝箔牢固密封。务必用封口膜紧密包裹小瓶的顶部边缘和铝箔的底部边缘，以防止溶剂蒸发。在试管上标记溶剂的液面位置，静置过夜使聚合物充分溶解。次日，若发生溶剂蒸发，需补充适量溶剂。在靠近超声仪的通风橱内准备好以下仪器和材料。将两支带有橡胶吸头的小型玻璃巴斯德移液管置于涡旋振荡器上，并准备磁力搅拌器。此外，在超声仪下方的支架上放置一个盛满冰水的大烧杯。接下来，将45毫升0.3%（质量/体积）的维生素E-TPGS加入200毫升玻璃烧杯中，然后将搅拌速度设定为360 RPM。再将2毫升0.3%（质量/体积）的维生素E-TPGS加入一支13 × 100毫米的玻璃试管中。为了混入疏水性试剂，将包封材料直接加入聚合物溶液中，注意避免接触试管壁，并涡旋振荡试管，直至包封材料均匀分散。对于亲水性物质，将包封剂与聚合物溶液进行乳化。将最多50微升的缓冲液中药物加入聚合物溶液表面。在冰上对混合物进行超声处理约10秒，直至溶液变为不透明且均匀。接下来，将装有维生素E-T-P-G-S的试管垂直握住，在高速下涡旋振荡。将玻璃移液管尖端保持在涡旋试管液面以上一到两厘米处，缓慢地将聚合物溶液逐滴加入涡旋液表面。注意，在全部聚合物溶液添加完毕后，移液管尖端不得接触试管内壁。继续涡旋该溶液。现在乳化15秒。立即将乳化的聚合物转移至超声仪中。将试管保持浸没在冰水中，对乳液进行三次、每次十秒的超声处理。在超声过程中上下移动探头以确保均匀处理，并避免探头接触试管壁或底部。每次十秒超声处理之间暂停五到十秒，使溶液冷却后再继续操作。然后将一到两毫升的0.3%维生素E-T-P-G-S从搅拌溶液中加入乳化液中。这将稀释乳化的聚合物，使其更易于倾倒，将乳化液倒入搅拌溶液中。用搅拌溶液冲洗试管中残留的任何溶液。搅拌三小时使纳米颗粒固化。若包封材料对光敏感，需用铝箔包裹烧杯，但保持杯口敞开，以促进溶剂挥发。收集纳米颗粒时，先将样品均分为两份，分别加入标称体积为30毫升的橡树岭离心管中，并确保两管质量相差不超过0.1克。随后，在固定角度转子中以17,000 ×g离心15分钟。RC f. 延长离心时间将有助于收集到更高比例的小尺寸纳米颗粒。弃去上清液时需小心，避免扰动纳米颗粒沉淀。加入5毫升蒸馏水，使用水浴、振荡器和涡旋振荡器将纳米颗粒完全悬浮。将两个离心管中的内容物合并至一个离心管中，并加入20毫升蒸馏水，总体积为30毫升。然后重复离心和洗涤步骤两次，共洗涤三次。最后一次沉淀物重悬后的液体体积应为四到五毫升。将端粒酶自由的纳米颗粒留出一小部分用于扫描电镜成像，并将其余部分冷冻。加入质量比为1:2的TLO与聚合物作为冷冻保护剂，以实现PLGA纳米颗粒均匀且完全的重悬悬浮。这将防止形成可能损伤颗粒表面并诱导聚集的冰晶。将纳米颗粒转移至已预称重的5毫升离心管中，然后在-80°C下冷冻至少30分钟。接着，打开管盖，并用橡皮筋将实验室用纱布固定在管口上覆盖管口。操作需迅速，以防内容物融化；若已融化，需在放入冻干机前重新冷冻。将5 mL样品置于冻干机中冻干72小时。随后盖上盖子，并用封口膜密封试管，于-80 °C保存冻干颗粒。成像当天，将一条双面导电碳胶带贴在扫描电镜样品台（SEM stub）上。用永久性记号笔在样品台的金属部分标记，以便后续参考。使用金属刮刀取少量冻干的纳米颗粒，并轻轻将其均匀分散在胶带表面。用实验室纸巾轻刷载片表面，或使用压缩空气去除松散的纳米颗粒。使用5至15毫米的工作距离、5至12千伏的电子束强度以及1至3的束斑尺寸观察颗粒；更高的束流强度可能导致样品局部受热，从而改变颗粒的表面形貌。微粒在100倍放大倍数下可见，而纳米颗粒在3000倍下可被分辨。放大聚焦于球体顶部，以定位可轻松通过扫描电镜（SEM）观察的颗粒；每批样品至少采集三张图像，以获得具有代表性的颗粒尺寸和形貌信息。采用该方法制备的颗粒由单次乳化过程形成，呈现为独立的、未融合的球形颗粒，表面形貌光滑，且在整个样品中分布有较宽范围的粒径。此处所示微粒的平均直径为730纳米。此处展示的是通过单一乳化剂制备的、包载疏水性药物坎平的纳米颗粒。这些颗粒尺寸更小，平均直径为340纳米。乳化剂浓度越高，所得颗粒越小，其平均直径从2000纳米降至200纳米。随着乳化剂浓度从0.01%增加到0.3%，此处所示的SEM图像反映了这一变化。然而，当维生素E-T-P-G-S的浓度过高时，例如使用1%维生素E-T-P-G-S时，未形成独立的颗粒，整个结构中均可见严重的融合现象和片状结构。确实如此。一旦掌握了通过乳化法制备PLG纳米颗粒的方法，便可进一步采用其他方法，如表面修饰，以设计能够与特定细胞类型或体内特定区域相互作用的纳米颗粒。观看本视频后，您应能充分理解如何通过乳化法制备具有可重复性和可调控粒径的微粒。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

由维生素E-TPGS 单乳或双乳形成的 PLGA 纳米颗粒

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本方案描述了可注射型超分子聚合物-纳米颗粒（PNP）水凝胶生物材料的合成与配制方法。同时展示了这些材料在药物递送、生物制药稳定化以及细胞包封与递送中的应用。...

可注射的超分子聚合物-纳米粒子水凝胶在细胞与药物递送中的应用

为了合理设计高效的佐剂，我们开发了聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米颗粒稳定的皮克林乳液（PNPE）。该PNPE具有独特的柔软性和疏水界面，可实现强烈的细胞接触，同时提供高含量的抗原负载，从而增强递送系统对抗原呈递细胞的亲和力，并促进抗原的有效内化。...

提高抗原内化的颗粒稳定乳液对细胞亲和性

学习使用维生素E-TPGS乳化剂制备PLGA纳米颗粒的方法，通过调节乳化剂浓度控制粒径在220纳米至1.98微米之间。该技术可应用于药物递送系统的开发与研究。

单乳液或双乳液法结合维生素E-TPGS制备PLGA纳米颗粒

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