利用蛋白A膜吸附剂和简化的操作流程分离与表征表达人源Fc嵌合蛋白

本实验的总体目标是利用蛋白A膜吸附剂和简化的操作流程，高效且有效地分离和表征表达人源嵌合FC蛋白的蛋白质。首先使用0.22微米滤膜对细胞培养上清液进行澄清处理，然后组装流式系统，并将细胞培养上清液通过蛋白A膜吸附剂进行灌流，从而实现上述目标。

接下来，用洗脱液将表达人源 FC 的蛋白从膜吸附剂上洗脱下来，所得的EIT通过超滤进行浓缩，再通过透析进行缓冲液置换。最后步骤是采用流式细胞术和蛋白质印迹法检测浓缩蛋白的纯度和产量。最终表明，与传统的采用蛋白A预装柱的亲和层析方法相比，蛋白A膜吸附剂结合简化的操作流程可缩短处理时间，并有可能提高蛋白得率。

因此，与现有的柱亲和层析方法相比，该技术的主要优势在于膜吸附器能够实现更高的蛋白质得率，同时缩短处理时间。选择合适的表征方法也可以缩短处理时间。按照制造商的说明制备膜吸附器，确保所有流经的溶液均为室温，并通过0.22微米滤膜预先过滤。首先，用0.22微米滤膜过滤的KO's磷酸盐缓冲液（DPBS）充满一支10毫升注射器，并排出所有气泡。

使用预灌注的 DPBS 去除保存液，并在使用前立即平衡膜吸附器，以确保空气不会进入膜吸附器。在将细胞培养上清液通过膜吸附器进行灌注前，立即使用真空驱动的 0.22 微米无菌过滤装置过滤上清液；将过滤后的上清液吸入鲁尔锁紧式注射器中，排出所有气泡，以准备材料和设备。首先，将注射器连接至膜吸附器的入口端。

如有需要，可将柔性管路连接至膜吸收器出口。在注射器与膜吸收器之间安装一个0.22微米的注射器滤膜。使用烧瓶或瓶子收集从吸收器流出的液体。

将注射泵设置为所需的体积流速，但不得超过制造商推荐的流速。将细胞培养上清液通过膜吸附器进行灌注，并收集穿流液。根据需要重新加载上清液至注射器中。

如有需要，可根据实验室偏好，通过流式细胞术、蛋白质印迹法或酶联免疫吸附试验（ELISA）检测流出液中是否存在蛋白质；通常无需将流出液重新回流以从膜吸附剂中洗脱蛋白质。首先，用10毫升DPBS洗涤膜吸附剂，以去除任何未结合的蛋白质。然后以所需的流速从膜吸附剂中洗脱蛋白质。

使用 10 至 15 毫升洗脱缓冲液。将洗脱液收集于含有中和缓冲液的离心管中，中和缓冲液的体积为洗脱液体积的 10%。蛋白洗脱后，根据生产商说明书再生膜吸附剂。

为长期保存，将膜吸收剂用含20%乙醇的DPBS填充，并于4摄氏度下存放。将所有EIT样品置于10千道尔顿分子量截断的离心过滤装置中。

按照制造商说明进行离心透析。保留截留物。在小体积透析装置中，使用10千道尔顿分子量截断值的透析膜，并以选定的缓冲液进行透析；可能需要向透析后的样品中添加缓冲液。

如果存在蛋白质沉淀问题，可根据需要在还原或非还原条件下，通过 SDS-PAGE 将纯化的蛋白质和 FC 标准品在所选凝胶上进行分离。建议使用小型凝胶以缩短运行时间，并上样多种量的纯化蛋白质样品，包括用 DPBS 稀释的样品，以确保纯化蛋白质条带信号处于 FC 标准品的线性信号范围内。凝胶分离后的图像分析中，使用半干转印仪，按照制造商说明书，在不连续缓冲系统中将凝胶中的蛋白质转移至聚偏氟乙烯膜上，通常转印时间为 5 至 10 分钟。

转膜后对凝胶进行考马斯亮蓝染色，以验证转膜效率。使用与碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶偶联的抗FC或抗IgG抗体，通过真空辅助蛋白质检测系统进行免疫印迹。免疫印迹时间通常少于一小时。

使用选择的底物和方法进行免疫印迹显色。通过图像分析对纯化蛋白进行定量。对FC标准品的条带信号进行线性回归分析。

如果 R 平方值大于 0.90，使用该直线方程根据条带信号计算蛋白质含量，并在必要时校正样品稀释倍数。由于蛋白质定量基于 fc 进行，需根据该蛋白质与 fc 之间的分子量差异对数值进行校正。如果 R 平方值小于 0.90，则重复快速 Western 印迹实验步骤。

最后，使用功能性检测方法或通过流式细胞术检测Fc段的方法来验证蛋白质。如蓝色直方图所示，采用Western blotting或EISA流式细胞术检测起始细胞培养上清液中是否存在具有功能性的GAL-1 HFC；新鲜的细胞培养基（此处以红色显示）作为阴性对照，与之重叠的绿色直方图为流穿组，表明膜吸附剂高效捕获并保留了GAL-1 HFC。GAL-1 HFC使用基于胺类的酸性缓冲液以每分钟1毫升的速度分次洗脱，每次1毫升，收集的洗脱组分经中和后，再通过流式细胞术检测其中是否存在具有功能性的GG-1 HFC。GL-1 HFC信号从洗脱组分1（约等于阴性对照）开始逐渐升高，在EEU 3时达到峰值，随后在洗脱组分9和10时下降至接近恒定水平。

最终的EEU 10未达到阴性对照信号的等效水平，这是由于部分吸附剂保留了GL one HFC。对纯化的GL one HFC进行定量和表征，采用快速半干转印结合真空辅助免疫印迹的Western blotting方法。通过将GA one HFC信号与HFC定量标准品进行比较，确定了纯化物质的数量和质量。

GAL one HFC 和降解的 GAL one HFC 信号均在标准品范围内。HFC 标准品条带的信号强度与 HFC 的含量呈线性关系。通过图像分析，确定纯化的 GAL one HFC（以 HFC 为基础）的浓度为 450 微克/毫升。

根据G蛋白一分子量对HFC进行校正。纯化物质的浓度为720微克/毫升。相比之下，在本图所示的Western印迹中，第六和第七泳道加入了过多的纯化GAL一HFC，导致信号饱和或超出HFC标准品的检测范围，从而无法进行定量分析。

作为蛋白质印迹法的替代方法，库马西凝胶染色可作为快速质量控制检测和（或）定量方法。请注意，在降解的GAL1 HFC样品中，除约25千道尔顿和40千道尔顿处的条带外，在约10千道尔顿处也出现了一条条带。该条带为降解的GAL1 HFC，其在蛋白质印迹中不与检测抗体发生反应。

观看本视频后，您应能充分理解如何利用膜吸附剂分离表达嵌合人源 FC 蛋白的方法，以及如何在短短四小时内对这些蛋白进行表征。