在体外细胞迁移和侵袭实验
2014年6月1日
常用的，非常方便的方法研究细胞迁移和侵袭的体外描述。第一种方法是测量细胞运动的细胞伤口愈合测定法。第二种方法是，评估的趋化和细胞的侵袭能力Transwell小迁移和侵袭实验。
细胞迁移是一个高度动态的过程。它对多种生理功能很重要，例如正常的胚胎发育、免疫反应以及疾病过程。例如，癌症转移和炎症。
细胞迁移的研究对于癌症生物学、免疫学、细胞生物学和发育生物学等广泛的生物医学科学非常重要。细胞迁移可分为四个机械独立的步骤：延伸、形成新的粘附、细胞体收缩，最后是尾部分离。在这里，我们将介绍两种简单的方法来仔细研究体外细胞迁移的动态性质。
第一种方法是细胞培养的封闭测定。这种检测方法很常用，并且对于具有最基本实验室设置的实验室来说非常容易获得。封闭细胞培养测定是一种使用移液器吸头并在汇合的单层细胞上产生的划痕的测定，汇合的细胞单层将随着时间的推移闭合先前形成的伤口。
可以使用时间作摄影或使用快照图片详细研究细胞迁移的动力学。可以测量距离，并随着时间的推移计算细胞移动的速度。第二种相关方法，transwell 细胞迁移和侵袭测定，在将细胞接种到 transwell 膜上后也很容易获得。
通常也称为博伊登室。可以测量它们向化疗引诱剂梯度的迁移能力。这两种高度可及的实验程序在许多研究领域都非常有价值。
第二章，细胞培养外壳，测定。您好，我叫 Calvin Justice。我是东卡罗来纳大学布罗迪医学院肿瘤学系 Yang 博士实验室的研究生。
今天，我将演示两个程序，分别测量体外细胞的迁移和侵袭能力。现在让我们开始细胞培养外壳。论文 细胞培养箱中使用的细胞。
可以使用常规细胞培养技术在组织培养板中生长。首先吸出用于细胞生长的生长培养基，用 PBS 洗涤一次，然后向板中加入 2 毫升至 0.25% tripsin EDTA，并将其插入培养箱中 3 分钟。从培养箱中取出板，加入 3 毫升补充有 10% FES 的 DMM。
从板中取出培养基，并将其放入 15 mL 锥形管中。以 1500 RPM 的速度离心 5 分钟。离心后，将细胞重新悬浮在补充有 10% FES 的 2 mL DMM 中。
然后用血细胞计数器计数细胞。完成计数后，对一些将在 24 小时内汇合的细胞进行铺板。将板放入培养箱中 24 小时，以允许细胞附着和铺展。
从培养箱中取出板，在显微镜下观察，以确保板 100% 汇合。接下来，在生物安全罩中，小心使用移液器吸头，不要损坏组织培养板，从孔的顶部到底部划一个伤口。用移液器吸头产生伤口后，吸出培养基并用 2 毫升生长培养基轻轻洗涤。
在这种情况下，补充有 10% FES 的 DMEM 以洗去任何现有的碎屑，再次吸出培养基。最后，加入两毫升生长培养基，如果有，将 play 插入显微镜下方的温度和 CO 2 受控室中。箱中的延时摄影功能。
延时功能不可用。拍摄标记位置和孔的初始照片，然后将板放入培养箱中。如果可以使用延时摄影，请在显微镜上设置延时摄影功能。
我们将延时设置为 16 小时。16 小时后每 5 分钟拍摄一张照片，可以将板从腔室中取出，并在实验期间采集的照片可以保存到闪存驱动器上。将 USB 插入计算机并打开 Image J 程序。
单击 file（文件）。导入图像序列。查找实验期间拍摄的图像。
单击第一个文件，然后单击 open。将出现 Next sequence 选项。选择照片列表中的第一张图片，然后插入视频所需的增量。
现在您将看到 VI 阅读器选项。选择最适合选择、试验和单击的内容。好。Image J 程序现在将制作视频、保存视频、单击文件、另存为 VI 或任何其他可能适合您的实验的选项。
然后可以在细胞研究中分析该视频，以查找可能感兴趣的迁移特征。可能研究的特征是 La Malo Podal 扩展、细胞体收缩和尾部分离。在没有时间损失摄影的情况下，可以取出在初始照片后放入培养箱中 12 至 16 小时的板。
应再次拍摄最初拍摄的区域，并且必须添加比例尺以进行进一步测量。在测量了第一张照片中生成的伤口的初始宽度后，应使用比例尺将以像素为单位测量的宽度转换为微米。接下来，应在与以前相同的区域中以像素为单位测量最终的图片缠绕宽度，然后再次使用比例尺将其转换为千分尺。
最后一步是从初始宽度中减去最终宽度，以获得伤口在分配的时间段内闭合的总宽度。测得的最终迁移距离应除以分配给外壳速度和千分尺/小时的时间。快照方法可以在许多孔中重复，以代替不同大小的孔，以便对细胞迁移进行更定量的分析，第 3 章，反式孔细胞迁移和创新检测。
首先，您必须首先在组织培养板中培养目标细胞以进行该程序。接下来，用 PBS 洗涤一次，然后用细胞解离、缓冲液或胰蛋白酶从组织培养板上分离目标细胞。此外，我们建议您阅读胰蛋白酶如何影响您正在研究的细胞的文献，因为它的使用可能会影响您的结果。
分离离心 1500 RPM 离心 5 分钟后，取出并吸出现有培养基，然后重悬细胞和 0.1% BSA。打开 Transwell 插入物的包装，将其放入为其特定尺寸设计的孔中。如果您先进行 Transwell 侵袭检测，请将基质胶添加到插入片段的顶部并孵育 30 分钟，然后再进行下一步。
将 100 微升细胞溶液铺在 transwell 膜顶部。孵育 10 分钟，让细胞沉淀下来。铺板的细胞数量取决于细胞类型，可能需要进行后续实验。
要确定这个数字，请使用移液管小心地将所需的化疗引诱剂添加到孔底部的插入物下方。尽量不要移除插入物。孵育时间取决于细胞类型。
孵育后取出 transwell 插入物，并根据需要多次使用棉签涂抹器从膜顶部轻轻去除未迁移到膜中的多余培养基和细胞。小心不要损坏膜。将 600 至 1000 微升 70% 乙醇加入空瓶的下腔室中。
将 ole 小室放入含有 70% 乙醇的孔中，孵育 10 分钟，以便进行细胞固定。同样，根据需要多次使用棉签涂抹器，以去除尚未从膜顶部迁移到膜中的细胞中残留的乙醇。向孔中加入 600 至 1000 μL 至 0.2% 的结晶紫，并将插入片段放入其中进行细胞染色。
孵育 10 分钟。一般从膜的顶部去除多余的结晶紫染料。然后非常小心地避免洗掉迁移的细胞，根据需要将膜浸入蒸馏水中多次，以去除剩余的结晶紫。
让膜干燥以使用显微镜观察细胞。可以用手术刀小心地去除膜并放在玻璃盖玻片上，或者您可以在插入物仍在遗嘱中的情况下查看细胞。使用倒置显微镜，应拍摄多个视场的照片。
为了很好地表示迁移的单元格数量，可以使用 Adobe Photoshop 计数工具对单元格数量进行计数。累积的数据可以插入到条形图中，以最好地表示您的结果。第四章，代表性结果。
接下来，我们将带您了解细胞培养包箱检测和 transwell 细胞迁移检测的一些代表性结果。如本视频所述，两种检查细胞运动的相关方法，我们将从细胞培养的封闭测定开始。在这里，我们显示 0 4 小时内在 8 12 小时拍摄的快照图片。
如您所见，在生成伤口后可能会拍摄照片，并且随着时间的推移可以测量伤口闭合的距离。我们使用散点图显示数据，并使用前面讨论的方法确定伤口闭合随时间的变化速度。此外，还可以使用延时摄影详细研究单个细胞迁移。
在这种情况下，我们在伤口闭合过程中放大单个细胞，跟踪它们随时间的迁移并观察它们的运动 可以详细检查前缘伸展、尾部缩回和一般运动等特征。现在，您将介绍横向细胞迁移检测的一些结果。在这里，我们展示了两张拍摄的膜和 transwell 细胞迁移测定后的照片。
第一张图片显示了没有趋化因子的结果，其中几乎没有细胞通过膜迁移。第二张图片显示了使用趋化因子的结果，其中细胞向膜的迁移增加。在右侧，我们使用带有代表标准误差的误差条的条形图来显示实验的量化结果。
第五章，结论 在横向细胞迁移或侵袭试验中进行细胞培养围合试验后积累的数据揭示了细胞在 2D 环境或 3D 环境中的迁移能力。这些结果可以与其他结果进行比较，以潜在地揭示以前未知的数据，并且也可能与其他生化测试相关。这两个相关的常用测试很有价值，并且对于最基本的细胞生物学实验室设置来说很容易获得。
我们感谢您今天参加我们的活动，并祝愿您未来的科学事业好运。
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概览
本文描述了研究体外细胞迁移和侵入的方法，这对于理解各种生理和病理过程至关重要。重点介绍了两种主要技术：细胞伤口愈合检测和transwell迁移和侵入检测。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 癌症生物学
- 免疫学
背景
- 细胞迁移对于胚胎发育和免疫反应至关重要。
- 它在癌症转移和炎症等疾病过程中起着重要作用。
- 理解细胞迁移涉及研究其动态性质和机械步骤。
- 这一领域的研究涵盖多个生物医学科学。
研究目的
- 提供检查细胞迁移的可访问方法。
- 增强对细胞运动机制的理解。
- 促进癌症生物学和免疫学等相关领域的研究。
使用的方法
- 细胞伤口愈合检测来测量细胞运动。
- transwell迁移和侵入检测来评估趋化和侵入能力。
- 体外技术来研究动态细胞行为。
- 细胞迁移机械步骤的分析。
主要结果
- 展示了研究细胞迁移的有效方法。
- 强调了细胞运动在各种生物学背景中的重要性。
- 提供了细胞侵入机制的洞察。
- 促进了癌症和免疫学的进一步研究。
结论
- 细胞迁移是一个复杂的过程，对许多生物功能至关重要。
- 可访问的方法可以增强细胞生物学研究。
- 理解这些过程可以导致治疗疾病的进展。
常见问题
Executive Industry Relevance
Cell migration and invasion assays provide critical functional readouts for evaluating therapeutic targets in oncology, immunology, and inflammation. These accessible in vitro methods enable early-stage mechanistic de-risking by quantifying cell motility and invasiveness under controlled conditions. The data support target validation and phenotypic screening efforts, improving predictive confidence in lead identification and preclinical model selection.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogate therapeutic hypotheses by measuring changes in cell motility following target modulation.
- Operational Value: Use simple scratch or transwell formats to rapidly assess functional consequences of genetic or pharmacological perturbations.
- Predictive Value: Generate quantitative migration and invasion metrics to support target prioritization and pathway de-risking.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Establish reproducible, quantitative readouts for compound effects on cell migration and invasion.
- Operational Value: Adapt wound closure and transwell assays to multi-well formats for medium-throughput screening.
- Assay Readiness: Generate standardized, imaging-based outputs compatible with automated analysis tools like ImageJ.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Model disease-relevant processes such as metastasis and immune cell infiltration in controlled in vitro systems.
- Operational Value: Use chemoattractant gradients in transwell assays to simulate physiological invasion microenvironments.
- Translational Continuity: Link in vitro migration data to in vivo biomarker studies and preclinical efficacy models.
Pipeline & Workflow Integration
These assays function as discovery-stage tools that inform target validation, assay development, and preclinical decision-making by providing functional, quantitative data on cell motility and invasiveness.
- Discovery Biology: Support hypothesis testing and mechanistic de-risking of targets involved in cell migration pathways.
- Screening: Enable assessment of compound libraries for modulation of migratory and invasive phenotypes.
- Analytics: Deliver quantifiable outputs such as wound closure velocity and migrated cell counts for comparative analysis.
- Translational Research: Provide disease-relevant functional readouts that align with preclinical models of metastasis and inflammation.
- Enterprise Reuse: Serve as adaptable, low-complexity assays applicable across multiple target classes and disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Mechanistic de-risking of targets through direct measurement of cell migration and invasion phenotypes.
- Operational Value: Standardized, accessible protocols requiring only basic cell culture and microscopy equipment.
- Strategic Value: Improve go/no-go decisions by reducing ambiguity in target functional validation.
- Portfolio Impact: Enable risk-adjusted prioritization of leads based on effects on cell motility and invasiveness.
Implementation Considerations
- Requires basic cell culture expertise and access to an inverted microscope for imaging.
- Time-lapse or snapshot imaging capabilities enhance quantitative analysis of migration dynamics.
- Standardization of wound size, cell density, and incubation times is essential for reproducibility.
- Transwell assays require optimization of chemoattractant concentration and incubation duration per cell type.
- Membrane coating (e.g., Matrigel) is necessary for invasion assays to model extracellular matrix barriers.
