一种研究化学诱导小鼠卵巢功能衰竭对运动能力和心脏适应性影响的方法

该实验的总体目标是加速卵巢中卵泡自然闭锁的过程，从而导致卵巢功能衰竭、雌激素耗竭以及雌性个体停止动情周期，形成一种与更年期极为相似的状态。这一目标首先通过连续15至20天给予一种职业化学物质——乙烯基环氧化物（VCD），该物质已被证实可特异性地靶向并破坏小型初级卵泡和原始卵泡，通过加速其自然闭锁过程实现上述效应。第二步是在开始VCD注射约六周后，通过阴道细胞学检测来确定雌性动物是否停止动情周期及卵巢周期活动。

必须通过阴道细胞学观察到持续15至20天的动情周期停止或无周期性变化，以确认动情周期的丧失及卵巢功能衰竭。最后一步是实施可能受更年期或更年期过渡影响的干预措施，例如自主笼轮运动和心脏适应性反应。最终，通过自主笼轮活动和心脏适应性变化来判断更年期是否会降低笼轮活动量。

与现有方法（如切除术）相比，该技术的主要优势在于，切除术是一种手术操作，会导致雌激素突然耗竭，而本方法则模拟了女性从绝经前期向绝经后期过渡过程中雌激素自然、渐进性减少的特点。该技术的应用前景涵盖绝经后女性代谢性疾病和心血管疾病的治疗，因为相较于绝经前女性，绝经后女性更易发生代谢综合征及其相关共病，尤其是心血管疾病。本方法的可视化演示至关重要，因为阴道细胞学操作步骤较难掌握，需特别注意正确实施涂片技术，并准确识别动情周期（EST cycle）的各个阶段。

四种，储存二氧化乙烯（VCD）于零下20摄氏度。为准备注射用VCD，取0.587毫升VCD加入洁净的给药小瓶中，用芝麻油定容至10毫升，用Parafilm封口后轻轻颠倒混匀。4摄氏度保存，最长可保存七天。

开始VCD注射方案时，选取两只两个月大的小鼠，连续20天每日称重，使用27号针头，以每千克160毫克的剂量，每天进行一次腹腔注射室温VCD。注射期间尽量交替注射部位，以类似方式降低局部感染风险。注射期结束后，对照组小鼠以每千克2.5毫升的剂量注射溶剂对照液——芝麻油。

通过采集阴道涂片每日监测动情周期。本研究成功的关键因素之一是获取高质量的阴道涂片以进行细胞学判定。采用背部颈后皮抓握法固定小鼠。

将含有0.2毫升无菌生理盐水的滴管插入阴道口，深度达0.5厘米。用滴管将注入的生理盐水混合3次，然后取一滴置于空白载玻片上。立即使用标准光学显微镜在100倍放大倍数下对每个样本进行显微镜检查，以确认卵巢功能衰竭。

随后，采用VCD诱导的绝经小鼠进行运动实验。笼中转轮装置包含一个直径为11.5厘米、跑动表面宽5厘米的转轮，配备数字磁性计数器，转轮旋转时可触发计数。每次进行转轮跑步实验前，需根据制造商的指南对笼中转轮进行校准测试。

测量跑轮的内径，计算周长，并将该数值作为轮子尺寸输入数字计数器，然后将跑轮安装到笼具上，滑动跑轮，使其穿过动物笼具顶部的金属丝。

使用文件夹夹将跑轮支架固定在笼具的网格上，夹子应位于网格的顶部，远离动物。将计算机部分及任何多余的线缆穿过笼具的网格。

将计算机的多余电缆放置在动物无法触及的位置。可通过在笼具的线缆上方放置一个中等大小的塑料称量皿来固定计算机的多余电缆。然后，将数字磁性计数器的计算机部分连接到跑轮支架上。

使用胶带将数字磁性计数器的自由磁铁固定在与连接计算机的磁铁电缆同一侧的中央杆上。同样，需用胶带充分包裹以保护磁铁，防止被啃咬损坏。磁铁应放置在合适位置，确保车轮每旋转一圈，计算机都能准确记录，且不会对车轮的完整旋转造成任何干扰或阻力。

通过将跑轮支架的支脚插入跑轮中央横杆上的安装孔，将跑轮固定在支架上。确保跑轮能够自由旋转。

应每天监测设备是否有啃咬损坏，并根据需要进行修复。从同胎出生的幼崽中随机选取七个月大的近交系 C57BL/6（黑六）和 B6C3F1 雌性小鼠，分配至运动组或久坐对照组。实验动物单独饲养于 47 × 26 × 14.5 厘米的笼具中，可自由接触笼内转轮，持续 28 天；对照组动物则共同饲养在无转轮的笼具中。

为所有动物提供水和标准的硬质啮齿类动物饲料。手动记录每天跑动的距离和跑步的总时间，这些数据由磁性计数器提供；每天在相同的一小时内记录距离和时间值，以确保在为期28天的运动期间获得准确且一致的数据。每天记录后，清除磁性计数器，以确保次日读数的准确性。

在特定运动周期结束后，处死动物前记录其体重，然后进行组织采集。为暴露心脏，在腹侧做正中切口，切开膈肌并迅速暴露心脏。在心脏基底部将其切除，并置于冷的磷酸盐缓冲液中，以充分冲洗残留的心室血液。去除心脏上多余的组织，称量全心重量，如有需要，可将其在液氮中速冻保存。

收集额外的切除组织，用改良的冰冷磷酸盐缓冲液冲洗，随后在液氮冷却的异戊烷中速冻。本研究中，通过VCD处理诱导卵巢功能衰竭，并通过阴道涂片的显微镜检查予以确认。动情周期的阶段根据上皮细胞、定量的上皮细胞以及白细胞在有核上皮细胞中的比例来确定，其中以有核上皮细胞为主。

此处箭头指示在雌激素细胞中以无核的鳞状上皮细胞为主，而有核细胞较少。Maestros 以多种细胞类型混合为特征，其中以白细胞为主。Diastrous 则以白细胞占主导。

小鼠的动情周期通常在注射VCD前持续四天。动物在持续处于动情间期15天后被视为无周期状态。该图显示了对照组和VCD注射组动情周期的平均持续天数。

一个周期从动情期（ES）的第一天开始计算，至下一个周期的第一天为止。在注射开始约六周后，ES期的阴道细胞学变化开始出现。观察发现，与注射溶剂对照组动物相比，VCD注射组动物的动情周期变得不规律；在经历12个动情周期后，VCD注射组所有动物在完成VCD注射方案时，其阴道细胞学均不再显示周期性变化。卵巢组织横切面的苏木精和伊红（H&E）染色显示，与对照组相比，VCD处理组卵巢组织出现显著萎缩。

在20倍放大倍数下观察（200倍放大倍数下），可见VCD处理组织中的初级卵泡和原始卵泡完全耗竭。与溶剂对照处理组织相比，通过两种品系的七个月龄VCD处理和溶剂对照处理小鼠，检测了VCD诱导的卵巢功能衰竭对运动能力的影响；在为期四周的运动周期中，每天记录每只动物在笼中转轮上的运动时间和距离。该图显示了每日跑步指标的周平均值，包括距离、时间和速度。

对于经溶剂或VCD处理的C57BL/6小鼠，在C57BL/6或B6C3F1小鼠品系中，VCD处理组与溶剂处理组在每日平均跑步距离和在转轮上花费的时间等运动表现指标上均未观察到显著差异。这表明，在自主笼内转轮运动方案持续期间，VCD诱导的卵巢功能衰竭对自主转轮运动行为的影响至少跨越了两个小鼠品系。记录了动物的体态测量数据，并迅速取出心脏称重，结果与先前的观察一致。

通过绝对心脏重量以及心脏重量与胫骨长度的比值来评估笼中转轮运动引起的心肌肥厚。尽管与久坐不动的小鼠相比，溶剂对照组和VCD处理组小鼠的绝对心脏质量和心脏重量与胫骨长度的比值均显著增加，但对照组与VCD诱导卵巢功能衰竭组之间在心肌肥厚程度上未观察到可测量的差异。在完成自愿的笼中转轮运动后，VCD处理组和溶剂对照组小鼠进一步接受强制性 treadmill 跑台运动，以评估其高强度和低强度运动能力。

在高强度方案中，跑步带速度每10分钟逐步增加，直至小鼠出现力竭迹象。平均而言，溶剂处理小鼠的最大速度为26.7 ± 0.95 米/分钟，而VCD处理小鼠的最大速度为28 ± 1.4 米/分钟（力竭前）。采用20米/分钟的低强度跑步来检测耐力能力。

通常情况下，经载体处理的小鼠力竭前的最长运动时间为 28.3 ± 1.3 分钟，经 VCD 处理的小鼠为 29.7 ± 1.4 分钟。在高强度或低强度运动能力方面，载体处理组与 VCD 处理组之间未发现显著差异，表明 VCD 诱导的卵巢功能衰竭对小鼠运动能力无影响。该技术建立后，为细胞、分子和生理学领域的研究人员探索更年期在啮齿类动物中的作用奠定了基础。

观看本视频后，您应该能够充分理解如何正确进行VCD注射、实施阴道细胞学检查以及开展生理学干预。