Name: 一个方法研究的化学诱导卵巢早衰的运动能力和适应心脏的影响在小鼠 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 26 s
Description: 了解使用VCD化学诱导小鼠卵巢早衰模型评估运动能力与心脏适应性的方法。该技术通过阴道细胞学监测动情周期，结合自愿转轮运动，为研究绝经后代谢与心血管疾病提供重要实验基础。

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本研究获得了美国国立卫生研究院（NIH）基金（HL 098256）、NIH 颁发给 J.P. Konhilas 的国家资助的科研培训奖（K01 AR052840）和独立科学家奖（K02 HL105799），以及心血管科学跨学科培训基金（HL007249）的支持。亚利桑那大学萨弗心脏中心和史蒂文·M·古特基金会也为本研究提供了资助。

所有动物实验、饲养和护理均按照亚利桑那大学机构动物护理和使用委员会批准的方案进行，并遵循2011年美国国立卫生研究院（NIH）关于实验动物护理和使用的指南。&#160;
1. 使用4-乙烯基环己烯二环氧乙烷处理
<ol>
	<li>VCD 给药方案：在化学通风橱中，将 0.587 ml VCD 加入洁净的烧瓶中，用芝麻油定容至 10 ml，轻轻倒置混匀，用 Parafilm 封口并盖好&#160;。将溶液转移至给药小瓶中，用 Parafilm 密封，并在 4 °C 下保存最多 7 天。确保所有试剂均为无菌状态。&#160;
	<ol>
		<li>使用芝麻油作为溶剂对照，因为 VCD 溶于芝麻油中。将 VCD（分子量 = 140.2 g/mol，密度 = 1.09 g/ml）储存于 -20 °C。</li>
		<li>VCD 注射方案：在小鼠 2 月龄时，称重后每日进行腹腔注射室温 VCD，剂量为 160 mg/kg，连续注射 20 天。对照组小鼠以相同方式注射溶剂溶液（芝麻油），给药体积为 2.5 ml/kg。 
		注意： 在注射期间，应交替注射部位以降低局部感染风险。使用以下公式计算所需注射体积：体重（g）× kg/1,000 g × 2.5 ml/kg = 需注射的溶液体积（ml），使用 27 G 针头时每只小鼠注射量约为 50 ml。由于针头较细，无需使用局部麻醉剂。</li>
		<li>动情周期监测：完成注射后，通过采集阴道涂片每日监测动情周期。采用背部颈皮抓握法固定小鼠。将含有 0.2 ml 无菌生理盐水的眼科滴管插入阴道口约 0.5 cm 深度。反复吹打生理盐水三次，取一滴置于空白载玻片上。立即使用标准光学显微镜在 100X&#160;放大倍数下进行显微观察。 
		注意： 通过阴道细胞学检测确认动情周期停止，从而验证卵巢功能衰竭。图 2A 展示了小鼠动情周期不同阶段（即前动情期、动情期、动情后期和动情间期）典型的阴道细胞学特征17-19。在前动情期，细胞主要包括有核上皮细胞（图 2A，箭头指示有核细胞）；在动情期，细胞主要为角化的鳞状上皮细胞；动情后期以多种细胞类型混合为特征，其中以白细胞为主；动情间期则以白细胞占主导。观察样本时可能需要调节焦平面以清晰看到细胞及其细胞核。如图 2B 所示，典型的小鼠动情周期为 4–5 天。若小鼠持续处于动情间期达 15 天以上，则视为无周期性。在整个研究期间持续监测动情周期，以确认 VCD 处理小鼠确实缺乏动情周期。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 自主笼轮运动
 
将7月龄的近交系C57BL/6和B6C3F1雌性小鼠暴露于自主笼中转轮跑动。将动物单独饲养于笼中（47 cm x&#160;26 cm x&#160;14.5&#160;cm），并自由接触笼中转轮，持续28天。
<ol>
	<li>设备设置：笼内转轮装置包含一个直径为11.5 cm&#160;、跑带宽度为5.0 cm&#160;的转轮，配备一个由转轮旋转激活的数字磁性计数器。每次进行转轮跑步测试前，应根据制造商的指南校准笼内转轮。测量跑步转轮的内径，计算周长，并将该值输入数字计数器作为转轮尺寸。
	<ol>
		<li>使用胶带将数字磁性计数器的计算机部分固定在转轮支架上。</li>
		<li>使用胶带将数字磁性计数器的计算机部分固定在转轮支架上。</li>
		<li>将数字磁性计数器的自由磁铁固定在与连接计算机的磁铁同侧的中央杆上，再次用胶带充分固定以防止动物啃咬损坏。磁铁的位置应确保转轮每旋转一圈，计算机都能记录一次，且不会对转轮的完整旋转造成任何干扰或阻力。 
		注意：已成功使用布基胶带将数字磁性计数器的组件固定在跑步转轮上。胶带应足够牢固，完全覆盖磁铁并防止动物啃咬造成损坏。磁铁应尽可能靠近转轮，但不得妨碍其运动。然而，应每天检查装置是否有啃咬损坏，并在必要时进行修复。</li>
		<li>通过将转轮支架插入动物笼顶部的金属丝网中，将转轮安装到笼内。使用长尾夹将转轮支架固定在笼的金属丝网上。 
		注意：长尾夹应位于金属丝网的上方，远离动物。将计算机部分及多余的电缆穿过笼的金属丝网，使计算机和多余电缆置于动物无法触及的位置。可通过在笼的金属丝网上放置一个中等大小的塑料称量皿来固定计算机和多余电缆。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>运动训练：对于同一窝仔鼠，随机将其分配至久坐对照组或运动训练组。所有动物均可自由饮水并给予标准硬质啮齿类动物饲料。
	<ol>
		<li>手动记录磁性计数器提供的每日跑步距离（km/天）和总跑步时间（hr/天）。每天在相同1小时时间段内记录距离和时间值，以确保在为期28天的运动期间获得准确且一致的数据。每天记录后清零（归零）磁性计数器，以确保次日读数准确。</li>
		<li>计算每组动物的平均跑步距离和平均速度。根据每只小鼠每日的距离和时间数据计算速度。数据可按每日或每周平均值的形式展示。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>组织采集：在特定运动周期结束后，将运动组和久坐对照组动物从笼中取出后30分钟内，通过吸入麻醉下颈椎脱位法处死。称量体重，并迅速取出心脏、骨骼肌和卵巢。
	<ol>
		<li>在组织采集时，将采集的卵巢用苏木精-伊红（H&amp;#38;E；图2C）染色并制片。在显微镜下，对每只VCD处理组和对照组动物的卵泡进行计数并分类为原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡或窦状卵泡20。原始卵泡包含一个小的初级卵母细胞、一层紧贴卵母细胞的扁平或鳞状颗粒细胞以及基底膜。初级卵泡的特征是存在一层或多层立方状颗粒细胞，围绕卵母细胞排列成单层。次级卵泡的颗粒细胞围绕卵母细胞形成多层结构，并出现卵泡膜。窦状卵泡的特征是存在一个充满液体的腔隙或“窦腔”。</li>
		<li>为取出心脏，在腹侧做正中切口，打开膈肌后观察心脏。迅速在心脏基底部将其切除，并置于冰冷的磷酸盐缓冲液（PBS）中，充分冲洗以去除残留的心室血液。修剪掉心脏周围的多余组织，称量全心重量，并在液氮中速冻。</li>
		<li>用冰冻改良磷酸盐缓冲盐水溶液（PBS）清洗所有其他切除的组织，并在液氮冷却的异戊烷中速冻。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 强制跑台运动
<ol>
	<li>采用强制运动范式测量运动能力时，使用跑步机并按以下方式设置：
	<ol>
		<li>在跑步机坡道底部放置一个电击网格。该电击作为运动的刺激源。电刺激的强度和频率由使用者手动控制。每个通道的网格可单独启用或禁用。所有数据采集均手动完成。</li>
		<li>定期根据制造商的指南对跑步机进行校准。
		<ol>
			<li>确保跑步机控制器前面板的切换开关设置为“STOP”。</li>
			<li>将速度传感器放置在跑步机皮带通道1上，并用螺母牢固固定在下图所示位置。</li>
			<li>使用跑步机控制器前面板上的旋钮，将速度调节至88.7 m/min，然后在跑步机控制器前面板上将电刺激频率设置为2 Hz。</li>
			<li>按下“ODOMETER RESET”按钮以启动校准程序。 
			注意：实验设计中必须包含久坐或非运动对照组。久坐组应与运动组年龄匹配。我们先前已证明，将久坐小鼠单独饲养在与运动小鼠相同大小的笼子中，与将久坐小鼠与其同胞共同饲养相比，对所关注的参数无显著影响。因此，久坐小鼠与其同胞共同饲养，并置于与运动小鼠相同的房间内。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>适应性训练：在实验前3–7天，每天让小鼠适应跑步机环境。具体操作为：将小鼠放入跑步机中，皮带静止不动，关闭电击网格，但开启皮带电机（产生噪音）。让小鼠不受干扰地停留至少15分钟。</li>
	<li>热身：本方案中使用的热身步骤如下：
	<ol>
		<li>将每只小鼠放置在跑步机上。关闭电击网格，将皮带速度提高至4 m/min，持续15分钟。</li>
		<li>启用电击网格，保持皮带速度为4 m/min，再持续10分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>运动训练方案
	<ol>
		<li>热身后，保持电击网格开启，将皮带速度提高至5 m/min，持续15分钟。</li>
		<li>再将皮带速度提高至15 m/min，持续15分钟。</li>
		<li>训练结束后，将小鼠转移回其笼子中。 
		注意：在本研究中，运动训练每日进行，持续1周。</li>
		<li>急性运动方案：急性运动方案旨在确定极端运动应激的短期和长期效应。
		<ol>
			<li>热身后，每10分钟将皮带速度从5 m/min逐步增加至10、15、20、25和30 m/min。 
			注意：若小鼠无法继续奔跑或出现疲劳或痛苦迹象，应立即终止运动。在本研究中，大多数动物在25 m/min时停止，无一动物通过30 m/min阶段。</li>
			<li>每只小鼠测试三次，每次测试间隔2–3天。计算每只小鼠所有运动阶段的平均值。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>耐力运动方案：耐力运动方案旨在使小鼠长期暴露于跑步机运动刺激中，用于测试其对中等强度运动应激长期效应的耐受能力。
		<ol>
			<li>从热身阶段所述的皮带速度开始，即4 m/min。</li>
			<li>以每分钟1 m/min的速度逐步增加皮带速度，直至达到最终速度20 m/min。典型研究方案的总持续时间为50分钟。</li>
			<li>运动方案结束后，将小鼠转移回其笼子中。 
			注意：避免让小鼠运动至力竭。若在实验过程中任何时刻小鼠出现疲劳迹象，应立即关闭电击网格，允许小鼠休息并恢复。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 数据与统计分析
<ol>
	<li>以均值 ± 标准误（SEM）表示结果，采用双因素方差分析（以处理组和运动为两个主效应因素），随后进行 Student-Newman-Keuls 事后检验或学生 t 检验，以比较各组均值之间的差异。</li>
	<li>通过将每只运动动物的心脏质量与静息组的平均心脏质量进行比较，计算运动引起的心脏质量变化百分比。每个动物的心脏质量差异以相对于静息动物的百分比变化表示。p 值小于&#60;0.05 被认为具有统计学显著性。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在我们之前的研究中，已采用过笼中转轮运动和跑步机跑步运动方案16,21,22。所有动物均饲养在专用的运动实验室内，以尽量减少环境或人为干扰。任何对动物生物节律的干扰都可能显著影响其运动表现。因此，整个动物护理、运动表现监测与记录以及运动干预均应在每天相同的时间段内进行。研究人员应采取预防措施，尽量避免给动物带来额外应激，例如限制应激暴露时间，并在适当情况下对饲养笼进行遮盖。
笼中跑轮运动
在准备笼中转轮装置时，转轮应便于小鼠进入和离开。笼底应仅铺少量垫料，以防止小鼠在转轮周围筑巢而阻碍转轮自由转动。磁性传感器应安装在转轮的固定部分，磁铁则固定在可自由转动的转轮上，以便在小鼠运动时记录每一次转轮旋转。连接磁性传感器的记录设备应置于笼顶金属网盖上方，所有外露电线必须用胶带固定或置于小鼠无法触及的位置，以防止小鼠啃咬造成损坏。磁铁和磁性传感器也需用胶带固定在相应结构上，以避免损坏或发生意外移动。在每日数据采集过程中，必须仔细检查所有已用胶带固定的电线，确保其完好无损，并在必要时重新粘贴。由于小鼠可能需要数天时间适应新环境并开始规律运动，因此数据记录应根据每只动物个体情况进行调整。尽管动物在转轮上活动的时间可能长达数小时，但大部分跑动行为发生在夜间。因此，即使某些动物在白天看似静止不动，也可能表现出较高的活动水平。此外，部分动物跑动量较少的情况也较为常见。通常，每日平均跑动距离为1 km或更少的情况多源于随机的笼内活动，而非真正意义上的持续跑动行为。因此，在最终数据分析中，应将跑动参数等于或低于每日1 km或每日1 hr的动物视为非跑动者并予以排除。
根据具体研究目的和所用小鼠品系的不同，运动时长可作相应调整。我们之前的研究表明，对于所涉及的两种小鼠品系，笼内转轮上的平均跑步速度和每次运动持续时间均随着时间逐渐增加，并在4周后趋于稳定。
笼中转轮跑动是一种动物模型中的自发性运动形式，通常被认为是在较低应激条件下进行的。与可以预设某些参数的跑步机运动不同，实验笼中的所有跑动行为均为自发进行，容易受到环境或行为线索的影响。因此，除非使用较大的实验组数量，通常应避免在不同实验条件之间进行比较。这种运动范式还可应用于其他研究领域，例如将行为反应与生理效应相结合的研究，如认知神经科学。对于采用自发性笼中转轮范式的实验，最关键的步骤是笼具的设置以及对运动活动的监测。
跑台运动
适应性训练步骤对于准备动物进行跑台运动实验至关重要。根据具体研究目的的不同，适应性训练周期的持续时间可能有所差异。本研究中选择为期一周的适应期，以使动物能够适应跑台装置以及笼内电机运转所产生的噪音，并进行热身&#160;热身阶段是运动训练方案中的重要步骤。与人类相似，小鼠在进入任何高强度运动方案前也必须进行热身，以避免受伤并防止产生潜在的数据偏差。在本研究中，我们以最低可能速度（4 m/min）启动跑带，并关闭电击网格，持续15分钟。所有小鼠在此期间开始在跑带上断续奔跑。随后打开电击网格，同时保持跑带速度为4 m/min。为避免对小鼠造成过度应激，我们将电击强度设定为较低水平（1 Hz）。数天内，所有小鼠均适应了 treadmill 跑带环境。
跑步的持续时间以及加速度也可根据每个实验设计进行调整。建议的起始加速度为 1 m/min。当小鼠出现疲劳迹象时，必须立即关闭其所在的跑带通道。通常，小鼠在跑带上表现出的疲劳迹象如下：
<ol>
	<li>持续接触电击网格超过 &#62;5-10 秒；</li>
	<li>运动能力丧失，导致在单次运动方案中接触电击网格超过 &#62;5 次；以及</li>
	<li>运动能力丧失，导致在单次运动方案中至少 3 次接触电击网格超过 &#62;2 秒。</li>
</ol>
上述列出的数值主要应作为特定实验的指导原则。由于不同小鼠品系之间、不同实验之间以及不同研究者之间的差异，这些参数需要针对每种运动方案分别确定。
与笼中转轮运动不同，跑步机实验必须重复进行多次，以消除环境和生物因素对跑步表现的影响。即使同一只动物，在不同测试间的跑步表现出现波动也是常见现象。由于每种运动方案都会使小鼠承受一定的应激，因此在测试之间安排适当的休息间隔是必要的。根据我们的经验，每次测试之间安排2至3天的休息期，足以让小鼠恢复。
与人类跑步机运动类似，小鼠耐力运动的速度最好通过心率或血氧饱和度来确定，但在小鼠研究中实现这一目标在技术上较为困难。跑步机实验最关键的步骤是确定力竭状态，而力竭通常在不同个体小鼠之间存在差异，一般设定为最大速度的80%。根据我们自身的经验，由于力竭标准主要依赖主观判断，不同研究人员在结果记录上可能存在显著差异。因此，在记录过程中一致地应用相同的标准至关重要。

自然绝经的发生特征是卵巢原始卵泡通过闭锁作用逐渐耗竭，最终导致卵巢衰老。在美国，女性一生中超过30%的时间处于绝经后阶段。随着卵巢功能下降，可能出现多种生理和心理后果，包括体脂增加、血管功能不稳定以及情绪或睡眠障碍。由于与未绝经女性相比，绝经后女性的肥胖/体脂水平更高1,2，她们尤其更容易发生代谢综合征及相关共病，包括心血管疾病（CVD）3。&#160;此外，越来越多的证据表明，针对心血管疾病患者的有效心脏康复应包括规律的有氧运动，且运动可降低这些人群的心血管发病率和死亡率4,5。&#160;然而，从绝经前到绝经后的过渡过程中运动能力如何变化，目前尚缺乏充分研究。更重要的是，运动作为绝经后女性预防心血管疾病风险的干预措施所发挥的作用，至今仍显著缺乏深入探讨。
目前用于模拟女性更年期最常用的可诱导模型是卵巢切除（OVX）啮齿类动物。近年来，职业化学物质4-乙烯基环己烯二环氧化物（VCD）被发现可特异性靶向初级和原始卵泡，通过加速卵泡闭锁的自然过程，最终导致卵巢功能衰竭，且在其他组织中未发现明显毒性6。经VCD处理的小鼠动情周期（类似于人类月经周期）在完成VCD注射后2-3个月内停止，从而导致雌激素逐渐撤退，模拟了围绝经期向绝经后阶段的过渡。因此，这种卵泡耗竭但保留卵巢的动物模型能够更接近地模拟人类从绝经前期经围绝经期至绝经后期的自然发展过程7-9。&#160;此外，该模型为OVX模型提供了一种非手术替代方案，可减少手术相关并发症（如感染）。在本研究中，我们采用VCD诱导的更年期小鼠模型，研究运动对更年期小鼠心脏适应性的影响。
有多种情况表明，雌激素与两性啮齿类动物笼中转轮运动之间存在关联10-13。通过手术切除卵巢（OVX）导致雌激素耗竭，会降低小鼠和大鼠的自发运动活性14,15。本研究采用两种运动方式来检测VCD诱导的更年期小鼠的运动能力。笼中转轮跑动通常被视为动物模型中的一种自发性运动，被认为是在较低应激条件下进行的。然而，笼中转轮跑动并不能反映动物相对的运动能力，后者需要动物在更高强度下运动。因此，采用强制性跑步机运动来测定运动能力，该能力以对运动强度的耐受性和耐力为指标。此外，我们先前已证实，笼中转轮运动可诱发心肌肥厚，且这种肥厚性生长具有性别依赖性16。&#160;因此，我们还检测了VCD诱导的更年期小鼠对笼中转轮运动的心脏适应性。

<table><tbody><tr><td>4-乙烯基环己烯二环氧乙烷 (VCD)</td><td>Sigma</td><td>V-3630</td><td></td></tr><tr><td>直径 11.5 cm、跑带宽度 5.0 cm 的跑轮</td><td>Petsmart</td><td>型号 6208</td><td></td></tr><tr><td>数字磁性计数器</td><td>Sigma Sport</td><td>型号 BC 600</td><td></td></tr><tr><td>跑步机运动装置</td><td>Columbus Instruments</td><td>型号 1055SDRM</td><td></td></tr></tbody></table>

一种研究化学诱导小鼠卵巢功能衰竭对运动能力和心脏适应性影响的方法

A Method to Study the Impact of Chemically-induced Ovarian Failure on Exercise Capacity and Cardiac Adaptation in Mice

绝经后女性患心血管疾病（CVD）的风险增加，然而运动作为预防绝经后女性心血管疾病风险的措施，其作用尚未得到充分研究。因此，我们研究了自主笼中转轮运动和强制性跑步机运动对更年期小鼠心脏适应性的影响。目前最常用于模拟人类更年期的可诱导模型是卵巢切除（OVX）啮齿类动物模型。然而，OVX模型与人类更年期存在若干差异。在本研究中，我们对雌性小鼠给予4-乙烯基环己烯二环氧乙烷（VCD），该物质可加速卵巢功能衰竭，作为研究运动对更年期小鼠影响的替代性更年期模型。VCD选择性加速原始卵泡和始基卵泡的丢失，导致内分泌状态与人类从绝经前到围绝经期再到绝经后的自然进程高度相似。为了确定运动对VCD处理的雌性小鼠运动能力和心脏适应性的影响，我们采用了两种方法：首先，我们让一组经VCD处理和未处理的小鼠进行自主笼中转轮运动；其次，我们采用强制性跑步机运动，通过测定运动强度耐受性和耐力，评估另一组经VCD处理和未处理小鼠的运动能力。

典型的实验方案（如本研究所采用的）如图1所示。在连续20天给予VCD处理后，通过阴道细胞学检测判断VCD注射小鼠是否存在动情周期，同时对溶剂对照注射小鼠也进行监测。动情周期的分期依据阴道涂片中上皮细胞、角化上皮细胞和白细胞的比例确定（图2A）。若涂片中仅见角化上皮细胞，则表明小鼠处于动情期，即仍具有周期性。小鼠的动情周期通常持续4天，因此，若VCD注射动物连续15天处于以白细胞占主导的间情期（图2A），则被判定为无周期性。VCD处理小鼠的动情周期先出现紊乱，随后在开始注射VCD后的2至3个月内完全停止（图2B）。与对照组相比，VCD处理组的卵巢组织表现出明显的萎缩。在高倍放大下可见，初级卵泡和原始卵泡已完全耗竭（图2C）。
为了检测VCD诱导的卵巢功能衰竭对运动能力的影响，我们在停止动情周期4至6周后，将7月龄的VCD处理组和溶剂对照组小鼠（两种品系：C57BL/6和B6C3F1）随机分配至静息组或笼内跑轮运动组（图1）。在整个为期4周的运动期间，记录每只运动小鼠每日的运动时间和距离。C57BL/6小鼠在溶剂或VCD处理后每周的每日跑轮运动在距离、时间和速度方面的平均值如图3所示。在C57BL/6或B6C3F1小鼠品系中，VCD处理组与溶剂对照组之间在笼内跑轮运动的平均每日时间、距离和速度方面均未观察到显著差异（图4A）。计算所得的跑轮运动速度随着4周运动期逐渐增加，这与先前研究结果一致16，但各实验组之间无显著差异。这些研究表明，VCD诱导的卵巢功能衰竭对自主笼内跑轮运动的影响至少跨越两种小鼠品系。
在完成自愿性笼内转轮运动方案后，记录小鼠的身体形态测量数据，并迅速切除心脏并称重。我们此前已证明，自愿性笼内转轮运动可导致心脏质量增加16。本研究中，我们还通过绝对心脏重量（HW）以及将HW标准化为胫骨长度（TL）的比值，证实了笼内转轮运动可诱导心脏肥大（表1）。与久坐不动的小鼠相比，溶剂处理组和VCD处理组小鼠的绝对心脏质量和HW/TL比值均显著升高。然而，在自愿性笼内转轮运动后，对照组小鼠与VCD诱导卵巢功能衰竭小鼠之间的心脏肥大程度无显著差异。
接下来，我们采用非自主（强制）跑台运动来测定小鼠的运动能力。首先使小鼠进行高强度运动方案，即每10分钟逐步增加平均速度，直至力竭。结果显示，对照组小鼠的平均最大速度为26.7±0.95 m/min，VCD处理组小鼠的平均最大速度为28±1.4 m/min。我们还采用20 m/min的较低强度（约为最大速度的80%）运动来检测耐力能力。如图4B所示，对照组与VCD处理组在高强度和低强度运动能力方面均未发现显著差异，表明VCD诱导的卵巢功能衰竭对小鼠的运动能力无显著影响。
综上所述，由VCD处理诱导的更年期对自主或强迫跑步能力以及心脏对运动的适应性反应均无影响。
<img alt="显示VCD诱导卵巢功能衰竭的时间线（以月为单位）及运动方案细节的示意图。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51083/51083fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51083/51083fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. VCD给药与实验方案。 小鼠从2月龄开始，连续20天给予VCD（160 mg/kg）或芝麻油（溶剂对照）。VCD或溶剂注射结束后，按照方法部分所述监测动情周期并确定周期性。卵巢功能丧失发生在60–90天内，并通过阴道细胞学确认。在7月龄时，小鼠进行为期4周的自主转轮运动，或接受跑步机运动方案。
<img alt="动情周期阶段：前期（Proestrus）、动情期（Estrus）、间期（Metestrus）、静止期（Diestrus）的细胞显微图像；周期长度图示。" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/51083/51083fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51083/51083fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. VCD诱导小鼠卵巢功能衰竭。 A： 经溶剂注射小鼠未染色阴道涂片的细胞学图像，显示动情周期的四个阶段：1）前期（proestrous），主要由有核上皮细胞组成；2）动情期（Estrus），以无核角化细胞为特征；3）间期（metestrus），包含有核上皮细胞（箭头）、无核角化上皮细胞（箭头）以及白细胞；4）静止期（diestrus），主要由白细胞组成。B： 溶剂注射组与VCD注射组小鼠动情周期的平均长度（天数）。一个周期定义为从一次动情期的第一天到下一次动情期第一天的时间间隔。阴道细胞学检测自注射开始约6周后进行。与溶剂注射组动物相比，VCD注射组动物的动情周期变得不规则，经过12个动情周期后，所有VCD注射动物的细胞学检测均不再显示周期性变化。C： 8月龄小鼠卵巢组织的H&amp;E染色结果。对溶剂处理组（左图）和VCD处理组（右图）小鼠的卵巢组织进行5μm厚度切片，在20X（上图）和200X（下图）放大倍数下观察。200X放大图像显示，与VCD处理组小鼠相比，溶剂处理组小鼠卵巢组织中存在较多卵泡。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51083/51083fig2highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="静态平衡图；距离、时间、速度数据表；周分析；对照剂与VCD处理研究。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51083/51083fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51083/51083fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. 对照剂或VCD处理的C57Bl/6J雌性小鼠在笼内转轮上的自主运动表现。左图：在4周研究期间，每1周时间段内的平均跑步距离（km/天）。中图：在4周研究期间，每1周时间段内的平均跑步时间（hr/天）。右图：在4周研究期间，每1周时间段内的平均跑步速度（km/hr）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51083/51083fig3highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的高清版本。</a>
<img alt="行为学数据柱状图；距离、时间、速度；C57Bl/6J、B6C3F1；溶剂对照组与VCD处理组。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51083/51083fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51083/51083fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图4"> 
图4. 溶剂对照组与VCD处理小鼠在笼内自愿转轮和跑步机上的运动表现。A：（上图）C57BL/6小鼠在为期4周的研究期间，每24小时的平均跑步距离（km/天）及在转轮上活动的时间（小时/天）。（下图）B6C3F1小鼠在为期4周的研究期间，每24小时的平均跑步距离（km/天）及在转轮上活动的时间（小时/天）。B： C57BL/6小鼠跑步机运动参数。最大持续时间（上图）和最大速度（下图），实验方案详见方法部分。

在新开发的化学诱导绝经小鼠模型上测试了两种运动模式，以研究绝经对运动能力及心脏运动适应性的影响。

绝经后女性心血管疾病（CVD）的风险增加，然而，运动作为预防CVD风险的措施所起的作用在……

该实验的总体目标是加速卵巢中卵泡自然闭锁的过程，从而导致卵巢功能衰竭、雌激素耗竭以及雌性个体停止动情周期，形成一种与更年期极为相似的状态。这一目标首先通过连续15至20天给予一种职业化学物质——乙烯基环氧化物（VCD），该物质已被证实可特异性地靶向并破坏小型初级卵泡和原始卵泡，通过加速其自然闭锁过程实现上述效应。第二步是在开始VCD注射约六周后，通过阴道细胞学检测来确定雌性动物是否停止动情周期及卵巢周期活动。必须通过阴道细胞学观察到持续15至20天的动情周期停止或无周期性变化，以确认动情周期的丧失及卵巢功能衰竭。最后一步是实施可能受更年期或更年期过渡影响的干预措施，例如自主笼轮运动和心脏适应性反应。最终，通过自主笼轮活动和心脏适应性变化来判断更年期是否会降低笼轮活动量。与现有方法（如切除术）相比，该技术的主要优势在于，切除术是一种手术操作，会导致雌激素突然耗竭，而本方法则模拟了女性从绝经前期向绝经后期过渡过程中雌激素自然、渐进性减少的特点。该技术的应用前景涵盖绝经后女性代谢性疾病和心血管疾病的治疗，因为相较于绝经前女性，绝经后女性更易发生代谢综合征及其相关共病，尤其是心血管疾病。本方法的可视化演示至关重要，因为阴道细胞学操作步骤较难掌握，需特别注意正确实施涂片技术，并准确识别动情周期（EST cycle）的各个阶段。四种，储存二氧化乙烯（VCD）于零下20摄氏度。为准备注射用VCD，取0.587毫升VCD加入洁净的给药小瓶中，用芝麻油定容至10毫升，用Parafilm封口后轻轻颠倒混匀。4摄氏度保存，最长可保存七天。开始VCD注射方案时，选取两只两个月大的小鼠，连续20天每日称重，使用27号针头，以每千克160毫克的剂量，每天进行一次腹腔注射室温VCD。注射期间尽量交替注射部位，以类似方式降低局部感染风险。注射期结束后，对照组小鼠以每千克2.5毫升的剂量注射溶剂对照液——芝麻油。通过采集阴道涂片每日监测动情周期。本研究成功的关键因素之一是获取高质量的阴道涂片以进行细胞学判定。采用背部颈后皮抓握法固定小鼠。将含有0.2毫升无菌生理盐水的滴管插入阴道口，深度达0.5厘米。用滴管将注入的生理盐水混合3次，然后取一滴置于空白载玻片上。立即使用标准光学显微镜在100倍放大倍数下对每个样本进行显微镜检查，以确认卵巢功能衰竭。随后，采用VCD诱导的绝经小鼠进行运动实验。笼中转轮装置包含一个直径为11.5厘米、跑动表面宽5厘米的转轮，配备数字磁性计数器，转轮旋转时可触发计数。每次进行转轮跑步实验前，需根据制造商的指南对笼中转轮进行校准测试。测量跑轮的内径，计算周长，并将该数值作为轮子尺寸输入数字计数器，然后将跑轮安装到笼具上，滑动跑轮，使其穿过动物笼具顶部的金属丝。使用文件夹夹将跑轮支架固定在笼具的网格上，夹子应位于网格的顶部，远离动物。将计算机部分及任何多余的线缆穿过笼具的网格。将计算机的多余电缆放置在动物无法触及的位置。可通过在笼具的线缆上方放置一个中等大小的塑料称量皿来固定计算机的多余电缆。然后，将数字磁性计数器的计算机部分连接到跑轮支架上。使用胶带将数字磁性计数器的自由磁铁固定在与连接计算机的磁铁电缆同一侧的中央杆上。同样，需用胶带充分包裹以保护磁铁，防止被啃咬损坏。磁铁应放置在合适位置，确保车轮每旋转一圈，计算机都能准确记录，且不会对车轮的完整旋转造成任何干扰或阻力。通过将跑轮支架的支脚插入跑轮中央横杆上的安装孔，将跑轮固定在支架上。确保跑轮能够自由旋转。应每天监测设备是否有啃咬损坏，并根据需要进行修复。从同胎出生的幼崽中随机选取七个月大的近交系 C57BL/6（黑六）和 B6C3F1 雌性小鼠，分配至运动组或久坐对照组。实验动物单独饲养于 47 × 26 × 14.5 厘米的笼具中，可自由接触笼内转轮，持续 28 天；对照组动物则共同饲养在无转轮的笼具中。为所有动物提供水和标准的硬质啮齿类动物饲料。手动记录每天跑动的距离和跑步的总时间，这些数据由磁性计数器提供；每天在相同的一小时内记录距离和时间值，以确保在为期28天的运动期间获得准确且一致的数据。每天记录后，清除磁性计数器，以确保次日读数的准确性。在特定运动周期结束后，处死动物前记录其体重，然后进行组织采集。为暴露心脏，在腹侧做正中切口，切开膈肌并迅速暴露心脏。在心脏基底部将其切除，并置于冷的磷酸盐缓冲液中，以充分冲洗残留的心室血液。去除心脏上多余的组织，称量全心重量，如有需要，可将其在液氮中速冻保存。收集额外的切除组织，用改良的冰冷磷酸盐缓冲液冲洗，随后在液氮冷却的异戊烷中速冻。本研究中，通过VCD处理诱导卵巢功能衰竭，并通过阴道涂片的显微镜检查予以确认。动情周期的阶段根据上皮细胞、定量的上皮细胞以及白细胞在有核上皮细胞中的比例来确定，其中以有核上皮细胞为主。此处箭头指示在雌激素细胞中以无核的鳞状上皮细胞为主，而有核细胞较少。Maestros 以多种细胞类型混合为特征，其中以白细胞为主。Diastrous 则以白细胞占主导。小鼠的动情周期通常在注射VCD前持续四天。动物在持续处于动情间期15天后被视为无周期状态。该图显示了对照组和VCD注射组动情周期的平均持续天数。一个周期从动情期（ES）的第一天开始计算，至下一个周期的第一天为止。在注射开始约六周后，ES期的阴道细胞学变化开始出现。观察发现，与注射溶剂对照组动物相比，VCD注射组动物的动情周期变得不规律；在经历12个动情周期后，VCD注射组所有动物在完成VCD注射方案时，其阴道细胞学均不再显示周期性变化。卵巢组织横切面的苏木精和伊红（H&E）染色显示，与对照组相比，VCD处理组卵巢组织出现显著萎缩。在20倍放大倍数下观察（200倍放大倍数下），可见VCD处理组织中的初级卵泡和原始卵泡完全耗竭。与溶剂对照处理组织相比，通过两种品系的七个月龄VCD处理和溶剂对照处理小鼠，检测了VCD诱导的卵巢功能衰竭对运动能力的影响；在为期四周的运动周期中，每天记录每只动物在笼中转轮上的运动时间和距离。该图显示了每日跑步指标的周平均值，包括距离、时间和速度。对于经溶剂或VCD处理的C57BL/6小鼠，在C57BL/6或B6C3F1小鼠品系中，VCD处理组与溶剂处理组在每日平均跑步距离和在转轮上花费的时间等运动表现指标上均未观察到显著差异。这表明，在自主笼内转轮运动方案持续期间，VCD诱导的卵巢功能衰竭对自主转轮运动行为的影响至少跨越了两个小鼠品系。记录了动物的体态测量数据，并迅速取出心脏称重，结果与先前的观察一致。通过绝对心脏重量以及心脏重量与胫骨长度的比值来评估笼中转轮运动引起的心肌肥厚。尽管与久坐不动的小鼠相比，溶剂对照组和VCD处理组小鼠的绝对心脏质量和心脏重量与胫骨长度的比值均显著增加，但对照组与VCD诱导卵巢功能衰竭组之间在心肌肥厚程度上未观察到可测量的差异。在完成自愿的笼中转轮运动后，VCD处理组和溶剂对照组小鼠进一步接受强制性 treadmill 跑台运动，以评估其高强度和低强度运动能力。在高强度方案中，跑步带速度每10分钟逐步增加，直至小鼠出现力竭迹象。平均而言，溶剂处理小鼠的最大速度为26.7 ± 0.95 米/分钟，而VCD处理小鼠的最大速度为28 ± 1.4 米/分钟（力竭前）。采用20米/分钟的低强度跑步来检测耐力能力。通常情况下，经载体处理的小鼠力竭前的最长运动时间为 28.3 ± 1.3 分钟，经 VCD 处理的小鼠为 29.7 ± 1.4 分钟。在高强度或低强度运动能力方面，载体处理组与 VCD 处理组之间未发现显著差异，表明 VCD 诱导的卵巢功能衰竭对小鼠运动能力无影响。该技术建立后，为细胞、分子和生理学领域的研究人员探索更年期在啮齿类动物中的作用奠定了基础。观看本视频后，您应该能够充分理解如何正确进行VCD注射、实施阴道细胞学检查以及开展生理学干预。

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