Name: 优化高等级胶质瘤细胞培养从外科标本用于临床相关的动物模型和3D免疫化学 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-07T14:15:00.000+00:00
Duration: 12 min 25 s
Description: 学习从高级别胶质瘤手术标本中分离培养神经球的方法，用于建立患者特异性细胞培养物和临床相关动物模型。该技术保留原始肿瘤的分子特征，支持长期自我更新和肿瘤形成能力评估。

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本工作由亨利·福特医院赫尔梅林脑肿瘤中心资助。

1. 从新鲜手术切除的胶质母细胞瘤标本制备单细胞悬液用于神经球培养
<ol>
	<li>在取得患者书面同意并遵循机构指南的前提下，于高级别胶质瘤切除术后立即采集肿瘤样本用于细胞培养。</li>
	<li>通过组织病理学确认肿瘤样本的诊断。将标本从手术室立即转运至超净台内的组织培养操作区，确保在术后1小时内开始处理。 
	注：若手术在远程地点进行，可将肿瘤样本切成较小组织块，放入含有DMEM/F12的离心管中（保持冰上）。肿瘤样本可在术后数小时后再进行处理。</li>
	<li>取200–500 mg组织（最佳量），使用手术刀片将肿瘤样本切碎，转移至含有10 ml无血清DMEM/F12培养基的15 ml离心管中。反复倒置混匀，静置使组织块自然沉降，吸除上清液，必要时重复此步骤。</li>
	<li>新鲜配制酶解组织解离液和终止液。
	<ol>
		<li>酶解组织解离液：5 ml 0.05% 胰蛋白酶-EDTA，2.5 ml 无钙镁Hank’s平衡盐溶液（HBSS），2.5 ml IV型胶原酶储备液（2,000 U/ml&#160;溶于含钙镁的HBSS中）。</li>
		<li>终止液：5 ml 胰蛋白酶抑制剂溶液，5 ml DMEM/F12，2 μl 5,000 U/ml DNA酶I（用无钙镁HBSS配制）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>吸除上清液，向切碎的肿瘤组织中加入酶解组织解离液，每0.5 g组织使用2 ml。轻轻倒置混匀。</li>
	<li>将组织与溶液在37 °C组织培养孵箱中，于旋转条件下孵育30分钟。</li>
	<li>使用2 ml移液器吹打混匀，根据消化程度决定是否终止消化，或返回孵箱继续孵育15–30分钟。</li>
	<li>加入2倍体积的终止液以终止消化反应，并使用5 ml血清移液器进行机械吹打。</li>
	<li>通过40 μm细胞筛过滤未消化的组织残渣。在室温下以800 × g离心5分钟收集细胞，随后用10 ml DMEM/F12洗涤3次&#160;。</li>
	<li>将最终的细胞沉淀重悬于5 ml DMEM/F12中。</li>
	<li>将细胞悬液缓慢铺加在5 ml Lympholyte-M液面上，于室温下以1,300 × g离心20分钟。</li>
	<li>将含有有核细胞的界面层转移至含有10 ml DMEM/F12的15 ml离心管中。</li>
	<li>在室温下以800 × g离心5分钟收集细胞，再用DMEM/F12重复洗涤2次。</li>
	<li>将获得的单细胞悬液重悬于细胞复苏冻存液中，分装至冻存管，经程序性缓慢降温后，置于液氮中长期保存以备后续使用。</li>
	<li>进行培养时，将细胞重悬于添加生长因子的神经球培养基（NMGF）中，在标准条件下（5% CO2、37 °C、湿度饱和的组织培养孵箱）以较低密度（&#60;1 × 105 个细胞/ml）接种于常规T25组织培养瓶中（图1A）。
	<ol>
		<li>按以下配方配制NMGF：
		<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="384">
			<colgroup>
				<col />
				<col />
				<col />
			</colgroup>
			<tbody>
				<tr height="20">
					<td height="20" style="height:20px;width:188px;">配制500 ml DMEM/F12&#160;</td>
					<td style="width:79px;"></td>
					<td style="width:117px;"></td>
				</tr>
				<tr height="20">
					<td height="20" style="height:20px;">储备液</td>
					<td>体积</td>
					<td>终浓度</td>
				</tr>
				<tr height="20">
					<td height="20" style="height:20px;">N2添加剂（10x）</td>
					<td>5 ml&#160;</td>
					<td>1x</td>
				</tr>
				<tr height="20">
					<td height="20" style="height:20px;">250 mg/ml BSA储备液&#160;</td>
					<td>1 ml</td>
					<td>0.5 mg/ml</td>
				</tr>
				<tr height="20">
					<td height="20" style="height:20px;">10 mg/ml庆大霉素试剂</td>
					<td>1.25 ml</td>
					<td>25 μg/ml</td>
				</tr>
				<tr height="20">
					<td height="20" style="height:20px;">100x抗生素/抗真菌剂</td>
					<td>2.5 ml</td>
					<td>0.5x</td>
				</tr>
				<tr height="20">
					<td>100 mg/ml bFGF</td>
					<td>0.1 ml</td>
					<td>20 ng/ml</td>
				</tr>
				<tr height="20">
					<td height="20" style="height:20px;">100 mg/ml EGF</td>
					<td>0.1 ml</td>
					<td>20 ng/ml</td>
				</tr>
			</tbody>
		</table>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将培养1–3周后形成的神经球（图1B–E）转移至新的培养瓶，以分离去除贴壁细胞和碎片。每3–4天进行部分换液。 
	注：若使用上述方案解离原位移植瘤，则可省略步骤1.11–1.13。</li>
</ol>
2. 胶质母细胞瘤神经球培养的维持及下游应用
<ol>
	<li>解离：观察神经球培养物，并每3-4天进行一次部分换液。当培养瓶中大多数多细胞神经球直径达到100 μm时，将其解离为单细胞悬液：
	<ol>
		<li>将含有神经球的培养基转移至15 ml离心管中，重力沉降神经球约5分钟，吸除上清液，将细胞沉淀重悬于10 ml不含钙和镁的DPBS中。</li>
		<li>混匀后于室温孵育10分钟，期间细胞依靠重力沉降。</li>
		<li>吸除7-8 ml DPBS，然后使用预先润湿的血清移液管通过机械方式解离神经球。</li>
		<li>在4 °C条件下以800 × g离心5分钟，收集解离后的细胞沉淀。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>传代：将解离后的细胞（步骤2.1）重悬于NMGF培养基中，按1:3比例分装至所需数量的培养瓶中，在标准条件下继续培养。继代后将形成二级神经球，后续应再次进行解离以生成三级神经球。</li>
	<li>评估长期自我更新能力：重复解离操作，直至神经球培养物完成至少10次传代，相当于在体外培养中维持不少于2个月。</li>
	<li>冻存：为冷冻保存神经球，需先将神经球解离（步骤2.1），然后将细胞沉淀重悬于Recovery细胞冻存液中，分装至冻存管，采用程序降温法缓慢冷冻后，置于液氮中长期保存。
	<ol>
		<li>从冻存状态复苏神经球细胞时：在37 °C水浴中快速解冻细胞，立即转移至含有10 ml DMEM/F12培养基的15 ml离心管中。轻轻混匀后，在4 °C条件下以800 × g离心5分钟。再用培养基洗涤细胞沉淀一次，将细胞重悬于NMGF培养基中，接种至T25组织培养瓶中进行培养。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>免疫缺陷小鼠颅内移植用细胞悬液制备：
	<ol>
		<li>解离神经球（步骤&#160;2.1），将细胞沉淀重悬于不含钙和镁的DPBS中。使用血细胞计数板结合台盼蓝排斥法计数活细胞。</li>
		<li>根据移植所需计算细胞数量，通常为每只小鼠3 × 105个细胞，取所需数量的细胞转移至离心管中，在1,000 × g条件下离心收集细胞沉淀。</li>
		<li>通过轻弹微量离心管，将细胞沉淀重悬于适合注射的体积中（每只小鼠5 μl）。将细胞悬液置于冰上，于2小时内使用完毕。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 肿瘤源性胶质母细胞培养的替代方案（适用于神经球培养失败的情况）
<ol>
	<li>向 NMGF 培养基中添加胎牛血清，使其终浓度为 2% FBS/NMGF。</li>
	<li>从 NMGF 培养的细胞开始：从 NMGF 培养瓶中收集活细胞（图&#160;1F），重悬于 2% FBS/NMGF 中，并以相对较低的密度（&#60;1 × 105 个细胞/mL）接种至普通的 T25 组织培养瓶中，在标准条件下（5% CO2、37 °C、湿度控制的组织培养孵箱）进行培养（图&#160;1G）。</li>
	<li>从冷冻保存但从未培养过的细胞开始（步骤 1.14.）：解冻细胞，用无血清培养基洗涤后接种至 2% FBS/NMGF 中，并按照步骤 3.2 所述条件进行培养。在将活细胞转移至 2% FBS/NMGF 前，先在 NMGF 中培养 3 天，可作为去除已分化细胞的替代预筛选方法。</li>
</ol>
4. 通过免疫组织化学对神经球进行形态学和分子分析
<ol>
	<li>培养神经球，直至大多数悬浮的多细胞球体达到100 μm直径。</li>
	<li>从培养箱中取出培养瓶，立即离心收集神经球，弃去上清液，加入10 ml不含钙镁的DPBS，避免扰动沉淀。吸除DPBS后，重悬于10%中性缓冲甲醛溶液中，在室温下孵育20分钟。</li>
	<li>离心收集球体，重悬于30%乙醇中，孵育30-45分钟。</li>
	<li>将30%乙醇更换为50%乙醇，孵育15分钟，再更换为新鲜的50%乙醇，继续孵育30分钟。</li>
	<li>重复步骤4.4，使用70%乙醇进行处理。</li>
	<li>用95%乙醇更换两次，每次10-20分钟，并用无水乙醇重复处理，直至球体呈现亮白色且收缩紧密。</li>
	<li>用镜头纸制作一个小的滤纸锥形漏斗，放入烧杯中的小漏斗内。用无水乙醇润湿镜头纸。</li>
	<li>用新鲜的100%乙醇轻轻悬浮沉淀，倒去多余乙醇，将球体通过镜头纸锥形漏斗过滤，确保其全部进入锥尖。用额外的无水乙醇冲洗原管，将残留的球体全部倒入滤纸锥中。</li>
	<li>从漏斗中取出纸锥，小心地将球体移至纸锥底部。将纸折叠成方形，确保球体尽可能牢固地包裹在内。</li>
	<li>将包裹好的神经球转移至包埋盒中，并送入自动组织脱水机进行处理。</li>
	<li>设置自动组织脱水机程序如下：无水乙醇，10分钟；二甲苯，15分钟（2次）；石蜡，10分钟（4次）。</li>
	<li>从脱水机中取出包埋盒，放置于石蜡包埋仪的加热区域。确保整个表面无碎片、灰尘或其他杂质，并用吸管吸尽镊子加热槽中的石蜡。预热干净的无蜡镊子，并在预热的底模中加入少量石蜡。</li>
	<li>打开包埋盒，取出纸包并置于包埋仪加热区。小心展开纸锥，直至球体可见。用预热的镊子尽可能收集全部材料，并转移至底模中的液态石蜡中。</li>
	<li>根据需要重复操作，以尽可能回收所有球体。用经乙醇擦拭过的预热洁净刀片轻轻刮取滤纸，收集残留球体，注意避免纸屑混入蜡块。</li>
	<li>用温热的镊子小心打散任何聚集的球体团块。将球体从边缘移向中央，形成均匀的一层。将底模移至冷却区，使球体固定到位，然后放入包埋盒，缓慢注入石蜡，彻底冷却。</li>
	<li>神经球石蜡包埋块可用于常规切片和免疫组织化学分析。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

适当的酶解消化是本方案中的关键步骤。在将组织于37 °C下在细胞解离溶液中旋转孵育之前，必须将其充分剪碎，孵育时间至少为30分钟。在此期间，需对组织进行机械吹打，并验证解离程度。根据组织的粘连程度，可酌情将孵育时间额外延长15至30分钟，以完成单细胞的解离。由于细胞活力会下降，不建议在解离溶液中孵育超过1小时。尽管最佳起始组织量为200至500 mg，但本方案已成功利用低至50 mg的肿瘤组织获得神经球培养物。
无血清NMGF是一种选择性培养基，包含肿瘤主体的大部分肿瘤细胞以及宿主细胞中将有部分无法存活，而另一些细胞在接种后会贴附于组织培养处理过的培养瓶上。至关重要的是，在培养1-3周后形成的神经球（图1B-E）必须转移至新的培养瓶中，以与已分化的肿瘤细胞和碎片分离。
GBM 细胞经酶解分离后未经培养（步骤 1.10）可冷冻保存，作为备用细胞来源，以便在神经球培养失败时用于其他培养基中的培养。我们已成功从此类冻存样本中获得神经球培养物，以及在含 2% FBS/NMGF 的培养基中生长的单层细胞。
从概念上讲， &#34;肿瘤干细胞&#34; 是一个正在进行中的研究领域，这一新兴领域尚需进一步阐明，因为其临床意义重大，尤其是在肿瘤异质性、可塑性以及治疗耐药性的产生方面。19,20除了在构建患者特异性胶质母细胞瘤动物模型方面具有重要作用外，神经球培养还具有以下价值： 体外 研究细胞信号转导和基因表达在生长因子、缺氧及药理学试剂作用下的变化11,21我们选择使用福尔马林固定、石蜡包埋的神经球的切片，以保留其三维结构，通过免疫组织化学方法研究蛋白质表达及翻译后修饰。11，由于与标记和成像整个球体这一更常见的方法相比，其具有更优的亚细胞定位能力。
研究表明，并非所有源自成年哺乳动物大脑的神经球中的细胞都是干细胞22。类似地，由胶质母细胞瘤（GBM）肿瘤培养出的神经球可能并非克隆性来源，这是由于存在更多已分化的癌性前体细胞以及在高细胞密度下已知会发生自我聚集现象23，该现象被部分研究者视为此方法的一项局限性。为了富集具有长期自我更新能力的干细胞，而非仅能短暂以神经球形式生长的前体细胞22，需将原代神经球解离后进行继代培养形成二代神经球，并至少连续传代10次，相当于持续培养约2个月，这一指标提示细胞群中干细胞比例已得到富集22。根据我们的经验，达到该标准的GBM神经球培养物可无限期地持续扩增为神经球。肿瘤分级具有影响，因为我们已成功从GBM和间变性星形细胞瘤（分别为WHO IV级和III级）获得培养物，但未能从低级别胶质瘤中成功建立培养。
在添加10% FBS的传统培养基中培养胶质母细胞瘤细胞的最常用方法，会导致细胞在基因组和表型上与原始肿瘤产生显著差异&#160;4另一方面，神经球培养物是呈现癌症干细胞表型的细胞的稳定且长期的来源。4神经球法在长期培养中用于富集肿瘤干细胞（CSC），以建立原位小鼠异种移植模型，其应用日益广泛。然而，该方法并非对所有高级别星形细胞瘤样本均有效，这是其主要局限性。目前已有研究正在探索亲本肿瘤的分子特征如何影响神经球的形成。鉴于患者特异性胶质母细胞瘤（GBM）模型在个体化医疗时代具有重大优势，而这种个体化医疗正随着基因组信息的可及性不断推进，因此有必要进一步探索并广泛验证培养高级别胶质瘤的其他实用替代方法。 &#34;组学&#34; 信息以及潜在靶向治疗的数量不断增加。

胶质母细胞瘤（GBM）是一种世界卫生组织（WHO）IV级星形细胞瘤，是最常见且最具侵袭性的原发性脑肿瘤。GBM肿瘤细胞可表现出多种发育表型，包括具有特定特征的细胞 &#34;肿瘤干细胞&#34; （CSC）特性，例如表达神经干细胞（NSC）标志物、长期自我更新能力，以及产生成熟分化细胞的潜能，这些分化细胞表达星形胶质细胞标志物并构成肿瘤的主要部分1-3尽管关于肿瘤干细胞的分子身份及其临床意义仍需进一步阐明，但本研究的重点在于肿瘤干细胞的操作性定义：长期自我更新能力 体外&#160;并在免疫缺陷啮齿类动物中原位移植后具有分化并再生原始肿瘤的能力。
几十年来，胶质母细胞瘤细胞一直在含有10%胎牛血清（FBS）&#160;的传统培养基中进行培养。一些高代次的商业化血清培养胶质母细胞瘤（GBM）细胞系在免疫缺陷啮齿类动物中具有致瘤性，但其基因组和分子特征与原始肿瘤存在显著差异4，限制了它们作为临床相关模型的应用。近年来，研究发现GBM中存在对表皮生长因子（EGF）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）有反应的具有干细胞/前体细胞表型的细胞2。随后，分离的GBM肿瘤样本被培养于无血清培养基中3，该培养基最初是为从成年哺乳动物脑组织中筛选和扩增神经干细胞而设计的5。这种培养条件抑制大多数非肿瘤性及高度分化的肿瘤细胞群体的生长，同时促进干细胞和前体细胞以悬浮多细胞球体（即神经球）的形式生长3，其行为类似于成年哺乳动物神经干细胞5。对在添加生长因子的神经球培养基（NMGF）中或在添加10% FBS的传统培养基中培养的原代GBM细胞进行系统的平行比较发现，GBM神经球具有致瘤性，具备多向分化潜能，并能保留原始肿瘤的基因型；相比之下，在低代次时添加10% FBS的培养物不具致瘤性，且在高代次时与原始肿瘤在遗传上显著偏离4。
基于假定的肿瘤干细胞（CSC）标志物CD133的表达，通过细胞分选从解离的胶质母细胞瘤（GBM）肿瘤中分离CSC的方法已被提出6,7，但后续研究显示，CSC表型与这些标志物的表达之间并无明确关联8-10，这降低了对该策略的初期热情，尽管目前仍在测试新的标志物10。由于迄今尚无经过验证的、可明确定义CSC的标志物组合，加之在临床前研究中需要大规模扩增这些细胞，因此细胞分选法在常规CSC富集培养中并不实用。通过在NMGF培养基中形成神经球的能力筛选出的GBM细胞 invariably 表达神经干细胞标志物。我们观察到Sox2和nestin在神经球培养物中普遍存在，而CD133蛋白仅在部分GBM神经球中表达（未发表数据及参考文献11）。
多个实验室正在采用相似的通用方法，通过酶解离和在添加生长因子的无血清培养基中培养，从胶质母细胞瘤肿瘤中建立神经球培养物3,4,11-14，而其他同行则报告称尝试从胶质母细胞瘤（GBM）样本中建立长期神经球培养物未获成功。本文所述的高级别胶质瘤的酶解离与神经球培养的一般方法与上述文献中描述的方法相似。我们根据对100多个GBM样本进行解离和培养的经验，对该方案进行了优化。采用本方案从新鲜GBM样本中获得长期神经球培养物的效率超过40%，与少数提供效率数据的报道结果相近3,15，这促使人们探索替代性方案，例如在含有EGF和bFGF的无血清培养基中，将细胞持续或间歇性地以单层形式培养于经细胞外基质蛋白包被的表面16,17。然而，神经球培养仍是目前验证最充分且日益流行的方法，能够较好保留GBM肿瘤的分子特征和致瘤潜能3,4,11-14。因此，我们的策略是优先尝试建立神经球培养，同时并行测试针对无法形成长期自我更新神经球的GBM细胞的替代培养方法（图&#160;1），以提高可用于动物模型的GBM肿瘤样本的代表性。本文中我们提供了一种从GBM中建立神经球培养的实验方案。对于无法形成神经球的细胞，我们展示了一种对培养基的简单改良，作为首次尝试培养非神经球形成型GBM中致瘤性细胞的方法，初步结果令人鼓舞，目前仍在进行广泛的验证。

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>0.05% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>汉克&amp;rsquo;不含钙和镁的平衡盐溶液</td><td>Life Technologies</td><td>14170-120</td><td></td></tr><tr><td>汉克&amp;rsquo;含钙和镁的平衡盐溶液&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>24020-117</td><td></td></tr><tr><td>IV型胶原酶</td><td>沃辛顿</td><td>5004188</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶抑制剂</td><td>Sigma</td><td>T7659</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>D4527</td><td></td></tr><tr><td>N2 补充剂（100 倍浓缩）</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白，细胞培养级</td><td>Sigma</td><td>A4919</td><td></td></tr><tr><td>庆大霉素试剂溶液</td><td>Life Technologies</td><td>15710-064</td><td></td></tr><tr><td>抗生素/抗真菌素</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>重组人碱性成纤维细胞生长因子</td><td>PeproTech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>重组人表皮生长因子</td><td>PeproTech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>Lympholyte-Mouse</td><td>Cedarlane Laboratories Ltd.</td><td>CL5031</td><td></td></tr><tr><td>细胞复苏冻存液</td><td>Life Technologies</td><td>12648-010</td><td></td></tr><tr><td>无菌细胞滤网，40 &amp;mu;m</td><td>Fisher</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;#039;不含钙和镁的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Life Technologies</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝染液，0.4%</td><td>Life Technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>中性缓冲福尔马林</td><td>实验方案</td><td>245-684</td><td></td></tr><tr><td>Histoplex 组织包埋盒</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>22-146-426</td><td></td></tr><tr><td>旋转器</td><td>Miltenyi BioTec</td><td>130-090-753</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX&amp;nbsp;补充材料</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>12660-012</td><td></td></tr><tr><td>Stem Pro 神经补充剂&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>A1058-01</td><td></td></tr></tbody></table>

优化高级别胶质瘤手术标本的细胞培养，用于临床相关动物模型及三维免疫化学分析

Optimization of High Grade Glioma Cell Culture from Surgical Specimens for Use in  Clinically Relevant Animal Models and 3D Immunochemistry

胶质母细胞瘤是最常见且最具侵袭性的星形细胞瘤类型，对治疗具有耐药性，并在分子水平上呈现异质性。建立能够保留原发肿瘤基因组特征的细胞培养模型，可用于患者特异性 体外 和 体内 模型有望革新针对胶质母细胞瘤的个体化新疗法的临床前研发，使其能够根据每个肿瘤的分子特征进行定制。
从新鲜的高级别星形细胞瘤组织开始，将其解离为单细胞悬液，我们采用神经球形成实验作为富集具有癌症干细胞表型细胞的方法，这些细胞表现出神经干细胞标志物的表达以及长期自我更新能力 体外以及形成原位异种移植肿瘤的能力。该方法此前已有提出，目前已被多位研究者采用。根据我们对125例胶质母细胞瘤标本进行解离和培养的经验，我们制定了本文所呈现的详细操作流程，适用于高级别星形细胞瘤的常规神经球培养以及肿瘤细胞的大规模扩增，以用于临床前研究。我们报告了采用该方案成功建立长期培养的效率。&#160;并为无法以神经球形式生长的解离胶质母细胞瘤细胞提出经济可行的培养替代方案。我们还详细描述了一种用于免疫组织化学检测、保存神经球三维结构的实验方案。富含肿瘤干细胞（CSCs）的细胞培养物能够建立保留胶质母细胞瘤（GBMs）分子特征和异质性的原位异种移植模型，正日益广泛地应用于胶质母细胞瘤生物学研究以及潜在治疗方案的临床前优化设计。

我们已将上述方案应用于解离和培养125例新鲜手术切除的胶质母细胞瘤样本（图1），其中包括88例初诊肿瘤和37例复发肿瘤（表2），所有操作均获得患者知情同意并遵循机构伦理指南。该方案建立长期神经球培养物的成功率为41.6%，初诊肿瘤与复发肿瘤之间的成功率相似（表2）。部分胶质母细胞瘤样本在培养最初几天内即形成神经球（图1B和图1C），而另一些样本则需要更长的培养时间（图1D和图1E）。
神经球形成的效率并不完全依赖于组织中坏死的程度，这一点通过按照方案1和方案2处理的两个样本结果得以说明：一个为新诊断的高细胞密度肿瘤（GBM1），另一个为复发且坏死的肿瘤（GBM2），两者均成功获得了神经球培养物（图2）。
在免疫缺陷小鼠中检测每个神经球培养物的成瘤潜能，是验证该方法用于富集肿瘤干细胞（CSCs）的关键步骤。根据先前报道的类似方案18，将GBM1和GBM2神经球植入免疫缺陷小鼠脑内，操作过程遵循机构及IACUC动物护理指南。异种移植瘤呈现出胶质母细胞瘤（GBM）的形态学特征，例如向脑实质浸润以及坏死（图2）。
GBM3 细胞经过解离（图 1A）后，分别在神经球培养基（图 1D 和 1E）以及含 2% FBS 的 NMGF 培养基（图 1D、1G 和 1H）中进行培养。将 2% FBS/NMGF 中培养的单层细胞和 NMGF 中培养的神经球细胞解离后，采用与 图 2 相同的方法，将等量细胞植入裸鼠体内。两种移植前培养方法在小鼠存活率、肿瘤生长动力学或形态学方面均未观察到差异（图 3A-C）。肿瘤生长特性在检测的最晚传代代数内保持稳定，神经球传至 P20，2% FBS/NMGF 培养的细胞传至 P10。尽管在含 10% FBS 培养基中培养的大多数原代 GBM 细胞中，神经干细胞标志物（包括 Sox2）表达下调3,4,11，但在 NMGF 培养基中添加 2% FBS 可维持 Sox2 的表达（图 3D）。
根据方案4处理神经球，并使用H&amp;E染色（图4A）、Sox2抗体（显示核定位，图4B）以及EGFR抗体（显示细胞膜定位，图4C）进行标记。该方案已用于检测刺激依赖性的nestin、GFAP以及增殖标志物Ki67表达变化11。
表2. 从胶质母细胞瘤（GBM）建立长期自我更新神经球培养物的效率。
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>病理类型</td>
			<td>样本数</td>
			<td>形成长期自我更新神经球的样本比例 (n)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>胶质母细胞瘤 - 未治疗，首次手术</td>
			<td>88</td>
			<td>42.0% (37)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>胶质母细胞瘤 - 复发</td>
			<td>37</td>
			<td>40.5% (15)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>总计</td>
			<td>125</td>
			<td>41.6% (52)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<img alt="胶质母细胞瘤细胞培养生长过程示意图；14天内神经球形成；NMGF方案。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51088/51088fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51088/51088fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
	图1. 从新鲜胶质母细胞瘤手术标本建立细胞培养。新鲜肿瘤经酶消化解离为单细胞。将密度分离介质中的有核细胞层接种于NMGF培养基中。解离后的神经球接种于NMGF中，通常接种后1天可见死亡细胞、碎片、贴壁的单个细胞以及少量悬浮状态的分裂细胞（A）。某些病例神经球形成较快（B,C），而另一些则较慢（D,E）。所有神经球均需解离并传代至少10代，其中41.6%的胶质母细胞瘤可获得长期自我更新的神经球。无法以神经球形式生长的存活胶质母细胞瘤解离细胞（F）可转移至其他培养条件，例如2% FBS/NMGF（G,H）。标尺（A）为100 μm，适用于所有图像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51088/51088fig1highres.jpg" target="_blank"> 点击此处查看高分辨率图像。</a>
<img alt="GBM肿瘤组织学及小鼠模型分析；H&amp;E染色、MHC I、hMit表达；示意图。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51088/51088fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51088/51088fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 
	图2. 来自GBM肿瘤的神经球生成及原位小鼠异种移植模型。 取细胞密度较高的肿瘤样本（GBM1）和坏死组织含量较高的肿瘤样本（GBM2），按照方案1和方案2进行解离并培养神经球，连续传代10次。将3 × 105个解离的神经球细胞植入免疫缺陷小鼠体内，待小鼠濒死时处死。小鼠脑组织经甲醛固定、石蜡包埋后，进行H&amp;E染色以及免疫组化检测人源性标志物、人线粒体（hMit）或主要组织相容性复合体I类分子HLA-A（MHC-I）的表达。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51088/51088fig2highres.jpg" target="_blank"> 点击此处查看高清图像。</a>
<img alt="癌症治疗研究中的生存分析图、BLI 增加、组织染色和蛋白质表达。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51088/51088fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51088/51088fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
	图 3. 在脑内接种 GBM3 细胞的小鼠中，使用 NMGF 培养为神经球或在 2% FBS/NMGF 中培养为单层细胞时，肿瘤生长相似。（A）将 GBM3 细胞在 NMGF 中培养为神经球或在 2% FBS/NMGF 中培养为单层细胞（均传代 &lt;10）后接种，其 Kaplan-Meier 生存曲线显示两组间生存率无显著差异（n=10，p=0.7174，log-rank 检验）。（B）通过活体生物发光成像（BLI）监测肿瘤生长，结果显示两组间的肿瘤生长动态无显著差异。（C）4 个 GBM3 异种移植瘤的形态无法区分，其中 2 个在 NMGF 中培养，2 个在 2% FBS/NMGF 中培养。MHC-I 染色方法同 图 2 所述。比例尺：600 μm。（D）Western blot 显示用于启动异种移植瘤（A–C）的 2% FBS/NMGF 培养物中仍保留干细胞标志物 Sox2 的表达。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51088/51088fig3highres.jpg" target="_blank"> 点击此处查看高清图像。</a>
<img alt="组织学分析，H&amp;E染色，Sox2和EGFR免疫组织化学，组织样本比较" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51088/51088fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51088/51088fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图4"> 
	图4. 通过免疫组织化学分析神经球切片中的蛋白表达。神经球培养物经甲醛固定并石蜡包埋，方法如步骤4所述，随后进行H&amp;E染色（A）、抗Sox2抗体染色（B）和抗EGFR抗体染色（C）。使用DAB底物显色（B,C）。标尺：20 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51088/51088fig4highres.jpg" target="_blank">点击此处查看高分辨率图像</a>

采用无血清神经球培养基对分离的高级别胶质瘤手术标本进行传代培养，以富集具有肿瘤干细胞表型的细胞。对于无法形成神经球的标本，提供了一种替代性实验方案。同时介绍了保持神经球三维结构的石蜡包埋技术，用于免疫细胞化学分析。

胶质母细胞瘤是最常见且最具侵袭性的星形细胞瘤类型，对治疗具有耐药性，并在分子水平上呈现异质性。建立细胞……

本实验的总体目标是建立常规的神经球培养方法，用于高级别星形细胞瘤的培养以及肿瘤细胞的大规模扩增，以满足临床前研究的需求。该目标通过以下步骤实现：首先对新鲜肿瘤组织进行急性解离，分离单细胞，并去除红细胞和碎片；第二步，将肿瘤细胞接种于添加生长因子的神经球培养基中进行培养，直至观察到神经球形成。神经球可用于体内实验和分子表征，也可经正规固定后包埋于石蜡中进行免疫学表征。最终可评估神经球培养物的长期自我更新能力、原位肿瘤形成能力及分子特征。相较于现有的10%FBS长期血清培养等方法，该技术的主要优势在于能够保留原始肿瘤的分子和遗传特性。该方法使得建立活体肿瘤库成为可能，从而可生成患者特异性的胶质母细胞瘤细胞系和动物模型，用于具有临床相关性的研究。该模型对于恶性胶质瘤患者治疗方案测试的意义显而易见。该模型最接近原发性肿瘤，能够在临床前环境中进行治疗测试。尽管该方法可为高级别胶质瘤的研究提供见解，但也可应用于其他人和动物肿瘤。通常，初次接触该方法的研究者会遇到困难，因为该方法需要规范的无菌操作技术、细致的操作流程以及多个步骤以维持细胞的长期存活。我们最初提出三维组织学方法的想法，是由于该方法在标记蛋白的亚细胞定位方面优于更常用的全神经球标记成像或细胞解离方法。该组织学方法的可视化演示至关重要，因为固定、透明、处理和包埋步骤较难掌握。需格外注意，以确保所有神经球均充分接触试剂并均匀处理，从而获得用于形态学和免疫组织化学分析的最佳组织团块。从 200 至 500 毫克的肿瘤样本开始，使用手术刀片将组织切碎。将组织块转移至含有10毫升培养基的15毫升离心管中，然后反复倒置混匀数次，使组织悬液充分混合。静置使肿瘤组织块自然沉降，随后吸除培养基。继续洗涤肿瘤组织块，直至培养基不再浑浊为止。随后，移除培养基。每0.5克混合肿瘤样品中加入2毫升酶解组织解离液，通过轻柔颠倒混匀溶液。将组织溶液置于37摄氏度的组织培养孵育箱中，在旋转条件下孵育。30分钟后，用2毫升移液器吹打悬浮液。当肿瘤消化至基本呈单细胞悬液时，加入两倍体积的终止液终止酶反应，并用5毫升血清移液器混匀细胞悬液。随后通过40微米细胞滤网过滤未消化的组织，于室温下以800 × g离心5分钟收集细胞沉淀。随后用 10 毫升培养基洗涤三次，将最终的细胞沉淀重悬于 5 毫升培养基中。将该细胞悬液缓慢铺加在 5 毫升淋巴细胞分离液 Lympho Light M 上，然后在室温下以 1300 × g 离心 20 分钟，分离细胞群体。接着收集含有有核细胞的界面层，转移至含有 10 毫升培养基的 15 毫升离心管中。然后将细胞重悬于添加了生长因子的神经球培养基中，并以每毫升少于1×10⁵个细胞的密度接种于不规则T25细胞培养瓶中，在37°C、5% CO₂的湿润细胞培养孵箱中培养。将一至三周内形成的悬浮神经球转移至新的培养瓶中，以分离贴壁细胞和碎片。如需通过免疫组织化学方法分析神经球，需先离心收集神经球，注意操作时勿扰动沉淀；弃去上清液后，向管中加入10毫升DPBS。然后去除DPBS，将沉淀重悬于10%中性缓冲甲醛中，在室温下孵育细胞20分钟。再次离心收集类固醇沉淀后，将其依次在系列乙醇中进行孵育。在第二次95%乙醇孵育后，用无水乙醇重悬PHE，直至细胞呈现明亮、白色且致密的状态。接着，用镜头纸制作一个小锥形漏斗。将其放入置于烧杯中的小漏斗内，并用无水乙醇润湿镜头纸。用新鲜的100%乙醇轻轻松解沉淀物，然后倒去多余的乙醇。将神经球通过镜头纸制成的锥形漏斗倒入，确保其完全进入尖端，并用额外的无水乙醇冲洗试管。将残留的类固醇物质全部倒入镜头纸锥形漏斗后，从漏斗中取出锥形纸。然后将镜头纸折叠成方形，确保类固醇尽可能牢固地包裹在内，再将包裹好的神经球转移至包埋盒中。现在将包埋盒放入自动组织处理机中，并运行处理程序。然后取出包埋盒，放置在石蜡包埋系统的加热区域。确认表面无碎片、灰尘或其他杂物后，用虹吸法将镊子在加热孔中的所有石蜡吸除。然后加热一对干净的无石蜡镊子，并将少量石蜡加入预热好的底模中。现在将包埋盒中的组织包从盒中取出，放置在包埋系统的加热区域。小心打开包埋纸，直至看到组织块。使用预热的镊子尽可能收集全部材料，然后将类球体转移至基模中的液体石蜡内。小心打散任何团块，并将类固醇移离角落，使其形成均匀的中央层。将基模移至冷却区域，以固定类固醇的位置。最后，将包埋盒放入并缓慢加入石蜡。待包埋盒完全冷却后，可按照表格中所述方法对神经球石蜡块进行切片，用于免疫组织化学分析。本方案从总共88例新诊断和37例复发性肿瘤中建立长期神经球培养的成功率为41.6%，新诊断肿瘤与复发性肿瘤之间的成功率相似。对于某些胶质母细胞瘤样本，神经球在最初几天内即形成，而其他样本则需要更长的培养时间。神经球形成效率并不完全取决于组织中的坏死程度，这一点可通过以下结果得到例证：一个新近诊断出的高细胞密度肿瘤，以及一个复发且已发生坏死的肿瘤，在均按上述方法处理后均成功生成了神经球，用于检测每个神经球的成瘤潜能。在免疫缺陷小鼠中进行培养是验证该方法用于富集肿瘤干细胞的关键步骤。在本实验中，将两种不同的胶质母细胞瘤神经球培养物植入免疫缺陷小鼠的脑内。异种移植的肿瘤表现出胶质母细胞瘤的形态学特征，例如侵袭脑实质和坏死。此外，在本实验中，未形成神经球的细胞被培养在添加了2%胎牛血清（FBS）的神经球培养基中，以观察这些替代培养条件下细胞的成瘤能力。与胶质母细胞瘤相比，评估了神经球培养物异种移植至裸鼠受体的情况。两种移植前培养方法在存活率、肿瘤生长动态或形态学方面均未观察到差异。尽管在含10%FBS培养基中培养的大多数原代胶质母细胞瘤细胞中神经干细胞标志物（包括SOX2）表达下调，但在添加2%FBS的神经球培养基中生长的胶质母细胞瘤细胞，经上述方法处理后仍能保持SOX2的表达。在本实验中，使用H&E染色以及SOX2抗体标记以显示其核定位，同时使用表皮生长因子抗体标记以显示细胞膜定位。结果显示，该方法可在维持神经球三维结构的同时，优化对蛋白质表达及翻译后修饰的分析。一旦掌握，若操作得当，该组织解离技术可在约两小时内完成。在实施该操作时，需注意手术与解离之间的时间间隔，以及高级别胶质瘤分子组成的异质性，均可能影响实验结果。为了在动物模型中重现原始肿瘤，还可采用其他方法，例如颅内移植。该技术正在革新神经肿瘤学领域，使得在具有临床相关性的环境中进行临床前测试成为可能。观看本视频后，您应能够充分理解如何建立和长期维持神经球，以及如何制备用于分子分析的经正规固定和石蜡包埋的神经球。请勿忘记，处理人体组织可能具有极高的危险性，因此在进行本操作时，必须始终采取个人防护措施，并使用相容且可能具有危害性的试剂。

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科研

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Medicine

医学

优化高等级胶质瘤细胞培养从外科标本用于临床相关的动物模型和3D免疫化学

恶性胶质瘤是一类具有显著临床和分子特征的高度侵袭性胶质肿瘤，其构成具有异质性。在临床前动物模型中，原位移植的原代异种移植瘤能够重现恶性胶质瘤亚型的组织病理学和分子特征。...

原位胶质瘤原代异种移植模型重现浸润性生长及异柠檬酸脱氢酶I突变

我们建立了小鼠皮层原位胶质母细胞瘤模型，用于活体双光子显微镜观察，该模型可重现肿瘤生长过程中通常存在的生物物理约束条件。通过以慢性玻璃窗替代肿瘤上方的颅骨，可利用双光子显微镜对肿瘤进展进行长期动态追踪。...

一种保留脑实质物理约束并适用于活体双光子显微成像的原位胶质母细胞瘤小鼠模型

利用三维人类生物凝胶培养系统，可将多形性胶质母细胞瘤的患者来源异种移植瘤微型化为活体微肿瘤。这种模拟体内环境的三维肿瘤检测方法适用于药物反应测试和分子谱型分析，包括激酶组学分析。...

利用三维人类生物凝胶培养系统和患者来源的胶质母细胞瘤细胞生成微肿瘤用于激酶组学分析和药物反应测试

以三维培养方式生长的神经球是研究胶质瘤生物学的有力工具。本文介绍了一种在通过石蜡包埋保持胶质瘤神经球三维结构的前提下进行免疫组织化学分析的实验方案。该方法可用于表征胶质瘤神经球的特性，如干性及神经分化能力。...

通过石蜡包埋的三维胶质瘤神经球培养物免疫组织化学评估胶质瘤生物标志物

激光显微切割（LMD）是一种灵敏且高度可重复的技术，可用于揭示介导胶质瘤异质性和侵袭性的分子通路。本文中，我们描述了一种优化的实验方案，通过激光显微切割从胶质瘤组织中分离特定区域，并随后进行转录组学分析。...

激光捕获显微切割胶质瘤亚区域用于肿瘤内异质性、肿瘤微流及侵袭的空间与分子特征分析

本文介绍了一种易于使用的胶质母细胞瘤侵袭实验方法。该实验适用于胶质母细胞瘤干细胞样细胞。同时介绍了一种用于便捷定量分析侵袭、迁移和增殖的Fiji宏工具。...

一种用于胶质母细胞瘤的三维球状模型

我们提出了一种新的方法，利用双光子显微镜在小鼠模型中研究荧光标记的氧化铁纳米颗粒向胶质母细胞瘤递送的过程。...

小鼠模型中胶质母细胞瘤的双光子活体显微成像

携带IDH1突变的弥漫性低级别胶质瘤是一种罕见肿瘤，难以进行培养。我们介绍一种简单的非酶解组织块培养法，可维持IDH1突变蛋白的表达，并使培养物持续存活数月。重要的是，该技术适用于冻存肿瘤组织，为胶质瘤研究提供了宝贵的资源。...

IDH1突变型弥漫性低级别胶质瘤的组织块培养方案

本实验方案的目的是为研究人员提供一种高度可重复的颅内植入技术。...

小鼠脑内立体定向接种胶质母细胞瘤患者来源异种移植细胞系

介绍了一种用于自由活动小鼠的市售遥测发射器植入手术技术，该发射器可连续测量生物电位（单导联心电图）、心率、核心体温和运动活动。同时提供了术后护理和镇痛的建议与操作规程，以促进动物恢复、改善健康状况并提高存活率。...

植入遥测发射器以获取自由活动实验小鼠心电图、心率、核心体温和活动数据

学习从高级别胶质瘤手术标本中分离培养神经球的方法，用于建立患者特异性细胞培养物和临床相关动物模型。该技术保留原始肿瘤的分子特征，支持长期自我更新和肿瘤形成能力评估。

优化高级别胶质瘤手术标本的细胞培养，用于临床相关动物模型及三维免疫化学分析

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