免疫突触由双色时间选通受激发射损耗（STED）纳米显微可视化

该程序的总体目标是使用 TED 显微镜可视化 NK 细胞裂解突触中的 F 肌动蛋白等结构。这是通过首先使用激活抗体在玻璃上重现突触来实现的。该程序的第二步是固定渗透性并对细胞进行染色以寻找感兴趣的结构。

接下来，通过激光扫描共聚焦显微镜对载玻片进行成像，然后应用稳态耗尽以提高图像分辨率。最后一步是使用反卷积算法处理图像。最终，由于双色稳定和内窥镜检查，结果可以显示细胞结构的亚 100 纳米分辨率。

这种方法可以帮助回答细胞生物学领域的关键问题，例如细胞骨架与胞吐作用之间的关系。在我们的例子中，我们对自然杀伤细胞分泌称为裂解颗粒的特殊溶酶体感兴趣。通常，刚接触这种方法的人会很挣扎，因为在 TED 耗尽激光器的应用中可以调整多个变量。

耗尽束的不当应用将导致分辨率恶化而不是提高 在制备过程中，用 10% FCS 加热 30 毫升 RPMI 培养基，并单独加热。1 毫升 BD CY 效果 cyop 烫到 37 摄氏度。然后开始用抗体包被盖玻片的过程。

取 1.5 号盖玻片并使用 PAP 笔。在盖玻片上做一毛硬币大小的方块。为每个测试条件准备一个方块。

圆圈中加入 200 μL 抗体，浓度为 5 μg/mL，溶于 PBS。对于 NK 92 细胞活化，使用抗 CD 18 和抗 NK P 30 抗体。将加载的盖玻片在 37 摄氏度下孵育半小时，然后在室温下浸泡洗净 PBS 立即添加每个测试条件的细胞，必须有 500， 000 个细胞可供使用。

在 10 毫升预热培养基中洗涤细胞，然后将它们重悬于相同的加热培养基中。在细胞完全悬浮的情况下，以每毫升 250 万个细胞的浓度倒出 200 μL 到盖上的每个抗体方块中。在这种情况下，将盖玻片与 37 摄氏度和 5% CO2 的细胞一起孵育。孵育洗涤后，20 分钟足以使 NK 细胞中的颗粒极化，盖子在室温下在 PBS 中轻轻滑动。

首先将一微升 TRITTON X 100 加入一毫升温热的 BD CY 效果细胞烫发溶液中。然后漩涡。将 200 μL 此溶液涂抹于盖玻片上的每个条件方块中。

然后将细胞置于室温避光中等待 10 分钟。孵育完成后，在染色缓冲液中轻轻洗涤盖玻片。然后用棉签擦干周围区域的边缘。

接下来，在染色缓冲液中加入 200 μL 一抗到周围区域，让盖玻片在黑暗中孵育半小时。一些用于稳态成像的良好二抗包括 Alexa floor 4 88 Pacific orange 和 Horizon V 500。这些方法中的每一种在 1 到 200 的稀释度下效果很好。

孵育洗涤后，盖上盖子，染色、缓冲并轻拍干燥。和以前一样，将 200 μL 二抗涂抹到每个条件方块中。然后让他们在黑暗中再静置 30 分钟。

此时，可以在额外洗涤后添加其他抗体。例如，Phin 可以在 1 到 200 的剂量下施用以检测 f 肌动蛋白。对于封固剂，请选择 prolong 而不是 vector shield，这与 stead 不兼容。

如果使用 phin 染色，请避免使用两种 2 硫代乙醇，但没问题，现在将 10 至 20 微升封固剂涂抹在载玻片上。将盖玻片倒置，轻轻将其放入培养基中，避免气泡。然后将玻片孵育 24 小时。

盖上盖子，第二天滑上，用指甲油密封盖玻片并继续成像。启动激光器和软件。稳态耗尽激光器应以 100% 功率预热并对齐。

使用目镜聚焦在样品上，然后转向软件。扫描第一个通道，即波长最长的通道。第四层，优化激光器的功率、激发光束位置和探测器范围。

避免设置在 100 以上。接下来，捕获共聚焦图像并检查像素。饱和度、线和帧平均都将提高像素分辨率。

目标是低于每像素 30 纳米。对于稳定来说，一些饱和度是可以接受的。接下来，以 50% 的功率应用稳态耗尽光束并捕获图像。

如果分辨率提高，则可以施加更大的功率。此外，调整激发激光功率或线平均值或增益也可以提高分辨率。要减少背景，请应用 0.3 纳秒的时间选通并向上调整。

应使用完整的半宽最大值计算来估计新的分辨率。满意后，当所有通道都调整完后，对第二个通道重复这些步骤。通过对所有扫描序列的单个染色对照进行成像来检查光谱重叠。

轻微的重叠可以通过软件的光谱解混来校正，但最好避免或保持在最低限度。现在，采集图像进行定量成像。根据实验条件，每个条件至少获得 20 张图像。

要转移保存的图像，请在相应的软件中打开文件。检查每个通道的参数，特别是激发和入院光谱、稳态耗尽发射和成像方向。然后应用软件的反卷积计算。

默认设置通常就足够了，但信噪比会因地板力而异，因此需要为实验手动设置该参数。有一些常见的陷阱可能会导致 stead 的分辨率不理想。一个正在采样中。

这会导致颗粒感和像素信息的丢失，例如在这些 f 肌动蛋白丝中。增加行或帧平均通常可以解决此问题。另一个问题是由长像素引起的漂白或过度采样。

停留时间通常是由于图像采集前扫描的线平均过多造成的，也可能是罪魁祸首，可以在采集图像之前使用较小的扫描或使用更高的扫描速度来纠正。降低激光功率也有助于一切正常。图像将得到显著改善。

反卷积将进一步改善图像。无论是在数量上还是在定性上。尝试此程序时，应常规获得低于 100 纳米的分辨率。

请务必记住在每次实验前进行稳态光束对准，此后按照此程序大约每小时进行一次。可以进行定量分析等其他方法，以回答有关共定位、亚细胞定位和分子相互作用的其他问题。