Name: 免疫突触由双色时间选通受激发射损耗（STED）纳米显微可视化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-24T20:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: 学习使用双色STED纳米显微技术可视化NK细胞毒性免疫突触，实现亚100纳米分辨率的细胞骨架与蛋白成像。该方法为研究细胞骨架与胞吐作用关系提供高分辨率工具。

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感谢 Geoff Daniels 提供的技术支持。本研究由 J.S.O. 获得的 R01 AI067946 项目资助。

1. 用抗体包被盖玻片
<ol>
	<li>将 30 ml RPMI 10% FCS 培养基和 1 ml BD Cytofix/Cytoperm 在 37 °C 预热。</li>
	<li>在磷酸盐缓冲液（PBS）中配制浓度为 5 μg/ml 的纯化抗体溶液。激活 NK92 细胞系时，建议使用抗-CD18&#160; 和抗-NKp30 抗体。
	<ol>
		<li>使用 PAP 笔在 #1.5 盖玻片上为每种实验条件标记一个约硬币大小的圆圈。对于双色实验，应设置四种条件：未染色、双染色以及两种单染色条件。在每个区域加入 200 µl 抗体溶液，37 °C 孵育 30 分钟。</li>
		<li>在室温下，将每张盖玻片轻轻浸入装有 50 ml PBS 的 50 ml 锥形管中进行洗涤。应在加细胞前立即进行洗涤，并注意避免盖玻片上的抗体干燥。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 在盖玻片上激活自然杀伤细胞；固定与通透处理
<ol>
	<li>按每种条件分离 5 × 105 个 NK92 细胞。离心后弃去上清液。用步骤 1.1 中预热的培养基 10 ml 洗涤一次。再次离心并弃去上清液。
	<ol>
		<li>将细胞重悬于步骤 1.1 中预热的培养基中，浓度为 2.5 × 106/ml。</li>
		<li>轻轻将 200 µl 加至第&#160;1.2.1 节中形成的区域中央。在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 20 分钟。（注意：可根据所研究的生物学功能适当延长或缩短孵育时间。对于 NK 细胞颗粒极化，20 分钟已足够）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞孵育结束后，将每个盖玻片轻轻浸入装有 50 ml 室温 PBS 的 50 ml 锥形管中，进行轻柔洗涤。</li>
	<li>向 1 ml 步骤 1.1 中预热的固定/破膜溶液中加入 1 µl Triton X-100，并充分涡旋混匀。向细胞中加入 200 µl 固定/破膜缓冲液（步骤 2.3），进行固定和透化处理。室温避光孵育 10 分钟。</li>
</ol>
3. 染色细胞
<ol>
	<li>制备染色缓冲液：磷酸盐缓冲液（PBS），1% BSA，0.1% 皂苷。
	<ol>
		<li>在 200 µl 染色缓冲液中配制一抗溶液（见步骤&#160;3.1）。（注意：使用前应对抗体进行滴定）。避免使用与盖玻片包被所用物种相同的宿主来源的一抗（步骤 1.2）。STED 成像时也应避免使用链霉亲和素-生物素连接系统。</li>
		<li>参照第 2.3.1 节，用 50 ml 染色缓冲液轻柔洗涤盖玻片。用棉签轻拭 PAP 笔画区域边缘，去除多余缓冲液。加入在第 3.1.1 节中配制的一抗溶液。室温避光孵育 30 分钟。（建议：将盖玻片置于载片盒中，并在盒内放置湿润的纸巾以维持湿度）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在 200 µl 染色缓冲液中配制二抗溶液。推荐使用的荧光染料包括 Alexa Fluor 488、Pacific Orange 和 V500。通常，1:200 的稀释比例适用于 STED 成像。
	<ol>
		<li>用 50 ml 染色缓冲液轻柔洗涤盖玻片。用棉签轻拭 PAP 笔画区域边缘，去除多余缓冲液。加入二抗溶液。室温避光孵育 30 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对其他目标蛋白重复洗涤和染色步骤。若使用鬼笔环肽（Phalloidin）检测 F-肌动蛋白，可将其与二抗同时孵育，通常稀释比例为 1:200。</li>
</ol>
4. 将盖玻片封固在载玻片上
<ol>
	<li>准备封片剂。注意：推荐使用 Prolong 或 Prolong Gold。必须避免使用 VECTASHIELD，因其与 STED 不兼容。若使用 Phalloidin，则必须避免使用 2,2-thiodioethanol。Mowiol 可以接受。</li>
	<li>在载玻片上滴加约 10–20 µl 封片剂。将盖玻片（细胞面朝下）翻转并轻轻封片，注意避免产生气泡。封片后将载玻片在室温下孵育 24 小时（盖玻片朝上），然后进行成像。</li>
	<li>用指甲油密封盖玻片边缘。</li>
</ol>
5. 实验设置
<ol>
	<li>启动所需的激光器和软件。以100%功率启动STED耗尽激光器。对STED激光器进行准直，对于商用系统而言，此步骤通常为自动化程序。</li>
	<li>使用目镜在显微镜下对样品进行聚焦，首先从单标记对照样品开始。</li>
</ol>
6. 参数优化
<ol>
	<li>扫描第一个通道，并优化激光功率、激发光束位置和检测器范围。如果可能，避免增益超过&#62;100。在共聚焦模式下采集图像以优化设置。使用行平均和/或帧平均可提高分辨率。检查是否存在像素饱和。注意：在共聚焦成像中允许一定程度的饱和，因为后续应用STED技术会降低发射光强度。对于STED成像，理想的像素尺寸应低于30 nm，但更小的像素尺寸可获得更高的分辨率。成像区域的大小将决定像素尺寸的下限。更小的像素尺寸可能会增加光漂白。
	<ol>
		<li>施加STED耗尽光束并采集图像，起始耗尽激光功率设为50%。若观察到分辨率有所提升，可进一步增加耗尽激光功率。在此阶段，可能需要调整激发激光功率、行平均和/或增益。</li>
		<li>应用时间门控以降低背景信号（最小值0.3纳秒）。调整参数直至分辨率优于共聚焦成像。分辨率可通过估算半高全宽（FWHM）来近似判断。&#160;该值表示在感兴趣结构上绘制线轮廓时，高斯峰强度达到最大值一半处的宽度，是估算分辨率的常用方法。</li>
		<li>当第一个通道的成像效果满意后，启动第二个序列进行顺序扫描。通常建议优先扫描长波长荧光染料。对第二个通道重复步骤6.1。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过使用两种扫描序列对单标记对照样本成像，确认无光谱重叠。软件中的光谱解混功能可校正轻微的光谱重叠，但应尽可能避免出现光谱重叠。</li>
</ol>
7. 图像采集
<ol>
	<li>获取图像。对于定量成像，建议每种条件下至少获取 20 张图像。&#160; 然而，具体数量应根据实验问题并结合样本量计算等统计学方法来确定。保存实验。</li>
</ol>
8. 去卷积
<ol>
	<li>使用反卷积软件或批量处理程序打开文件。通过软件检查每个通道的参数，特别确认每个通道的激发光谱和发射光谱、STED耗尽发射以及成像方向（若图像为三维，则需确认为向上或向下）。</li>
	<li>使用反卷积向导进行反卷积。默认设置通常已足够，但信噪比（SNTR）会因不同荧光染料而异，需针对每个通道和每个实验单独确定。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。本文的部分出版费用由Leica Microsystems, Inc.承担。

相较于共聚焦显微镜，分辨率的提升在一定程度上依赖于一些无法控制的因素。这些因素包括盖玻片厚度的微小偏差以及封片介质的不一致性。保持成像室内的温度和湿度尽可能稳定非常重要，且STED光束应大约每60分钟重新校准一次。如实验步骤中所述，必须避免使用VECTASHIELD封片剂，因其与STED不兼容。此外，应始终使用#1.5盖玻片，若条件允许，应选用经验证具有特定厚度的盖玻片。
该方法的一种改进是在共聚焦成像中增加额外的通道，使用发射波长大于STED光束的荧光染料。通过这种方式，最多可实现四个成像通道（两个用于共聚焦，两个用于STED）。然而，若采用此方法，必须首先采集那些荧光染料发射光波长大于STED耗尽激光的通道，因为施加STED光束会导致这些通道的光子被耗尽。该技术的一个优势是可应用时间门控，这还能通过消除短寿命光子的发射来提高共聚焦的分辨率34。特别是，采用时间门控技术，使发射探测器的时序与脉冲激发STED同步，可在靠近盖玻片成像时减少来自盖玻片玻璃反射的背景荧光。即使在不适合使用STED的实验中，只要采用脉冲激发光源，时间门控也可作为提高共聚焦分辨率的有效工具。
有多种方法可用于提高STED的分辨率。一种方法是减小针孔尺寸，使其小于标准的1艾里单位，但这也会减少到达样品的光量。可通过增加激光功率或增益来补偿这一损失。另一种方法是提高扫描线平均次数，这将增加每个光子采集的信息量，从而改善分辨率。然而，这可能会加剧样品的光漂白，因此需要在分辨率与光漂白之间取得平衡。类似地，使用GFP等荧光蛋白时，需仔细优化实验条件以避免光漂白。如有必要，可通过降低STED激光功率来实现。延长成像时间点也有助于提高光子采集效率并减少光漂白。在分析活细胞STED数据时，应考虑光漂白的校正问题。
当然，STED 也可实现三维成像，相比传统共聚焦成像同样具有分辨率提升。当与去卷积技术结合使用时，效果尤为显著；但需注意校正沿 z 轴多层成像过程中发生的位置漂移。若使用 Huygens 软件进行去卷积，可通过“stabilize image”（图像稳定）功能实现该校正。采用此方法，z 轴方向的分辨率将得到改善。这一进步显著优于传统共聚焦成像（其轴向分辨率较差），甚至优于单独使用 STED 的情况（后者在轴向分辨率方面也相对有限） z-轴分辨率。在STED成像过程中采集多个图像堆栈时，需注意避免样品发生漂白；如有必要，可降低扫描线平均次数或激光功率强度以减少光漂白。再次需要指出的是，若对不适合STED成像的其他荧光染料进行成像，则在首次顺序扫描中施加的耗尽光束将抑制这些通道的荧光发射。因此，当对发射波长大于592 nm的通道采用共聚焦扫描时，混合STED/共聚焦成像策略将不适用于三维成像。
总之，我们选择STED技术是因为其应用相对简便，且分辨率优于标准共聚焦成像。在免疫突触成像方面，该技术已被证明是一种有效且有价值的方法，使我们能够观察到在分辨率高于200 nm时无法看到的F-肌动蛋白结构的细节。尽管其中许多细节看似微小，但它们可能对自然杀伤（NK）细胞功能产生深远影响。因此，我们正在应用最新的纳米级成像技术，以获取对维持人类健康至关重要的信息。

免疫突触是由信号蛋白和细胞骨架成分构成的复杂微环境。杀伤性突触最初被描述为具有 &#34;靶心&#34; 具有环状肌动蛋白和黏附分子围绕中央分泌区域的结构1-4然而，我们现在知道，它由微小的活性信号域组成，这些信号域的功能依赖于细胞骨架持续的动态重组5-11我们目前所掌握的关于突触的许多信息都源于显微镜技术，而免疫学家一直是前沿成像技术的早期采用者。
其中一种新兴技术是超分辨率显微镜。传统的光学显微镜在空间分辨率上受到光的衍射极限限制，该极限使包括共聚焦显微镜在内的所有荧光显微镜的分辨率下限约为 200 nm。近年来，已发展出若干能够突破衍射极限实现更高分辨率的技术，包括受激发射损耗显微镜（STED）、结构光照明显微镜（SIM）、随机光学重建显微镜（STORM）和光激活定位显微镜（PALM）。这些技术在其他文献中已有详细综述12-15，但下文将简要概述。每种系统以独特的方式实现亚衍射极限的分辨率，因此，超分辨率技术的选择应根据具体实验及所研究的实验体系而定。
利用高强度环形耗尽光束实现STED超分辨率成像，该光束在激发后选择性地&#34;关闭&#34;每个目标荧光分子周围的荧光，从而实现突破衍射极限的荧光显微成像16-18。STED的一个优势是图像采集速度快，且所需的后期处理相对较少。虽然染料的选择取决于耗尽光束的光谱位置（在商用系统中该位置为592 nm），但已有多种 commercially available 的染料可供使用，使得两种荧光分子的组合成像成为可能。此外，诸如GFP等常用的荧光报告分子也可用于成像，因而能够开展活细胞实验19,20。
我们先前已使用受激辐射损耗显微技术（STED）来识别并量化自然杀伤细胞（NK细胞）用于脱颗粒的F-肌动蛋白低密度区域21,22。我们认为，STED是成像免疫突触的良好选择，因其具有相对灵活的荧光染料可用性，并且在x-y轴方向上的分辨率有显著提升。此外，在本实验所使用的商用STED系统中，采用高速（12,000 Hz）共振扫描器可实现快速图像采集，同时对样品的损伤最小。染料选择灵活性有限被认为是STED的一个缺点12，但使用多种市售荧光染料进行双色STED成像相对简便。将STED与激光扫描共聚焦显微镜整合，还可实现STED与共聚焦成像的联合使用，因此尽管STED仅限于两个通道，其他结构仍可通过共聚焦成像以约200 nm的分辨率进行观察（E. Mace，未发表观察结果）。尽管本文描述了STED在免疫细胞成像中的应用，但该技术也已广泛应用于多种细胞类型（包括神经细胞）以及多种细胞结构的可视化研究23-26。
SIM 采用不同的方法来生成超衍射极限的图像。通过可视化已知的周期性激发模式，随后经过数学变换，可以获得关于待研究未知结构的信息27。这使得横向分辨率提高至约 100 nm28,29。SIM 的优势在于其与所有标准共聚焦染料和探针兼容，但缺点是图像采集速度较慢，且需要长时间的后期处理12。这也限制了其在活细胞成像中的应用。
最后，可通过荧光分子的随机光开关实现超分辨率成像。该策略被应用于光激活定位显微技术（photo-activated localization microscopy, PALM）和随机光学重建显微技术（stochastic optical reconstruction microscopy, STORM）。通过连续采集多帧相机图像，并对随机激活的分子进行定位，这些分子被依次开启 &#34;开启&#34; 和 &#34;关闭&#34; 随着时间的推移，通过累积的图像帧可生成分辨率为20-30 nm的图像30-32 这种分辨率的代价是获取图像所需的时间。
本文详细展示了在受激辐射损耗（STED）显微镜中制备和成像双色样品的实验方案。该系统采用脉冲式可调谐白光激光器进行激发。由于激发光为脉冲形式，可实现时间门控检测，从而进一步提高分辨率。此外，系统配备了钆镓砷杂化（HyD）探测器，其灵敏度高于传统的光电倍增管，因而可降低激光功率需求。STED的耗尽光为连续施加，波长设定为592 nm，这决定了可用于双色STED的染料选择。常用的染料组合通常包括一种可被488 nm光激发的染料（如Alexa Fluor 488、俄勒冈绿、DyLight绿色染料或Chromeo 488）和一种可被458 nm光激发的染料（如Pacific Orange或Horizon V500）。因此，尽管两种染料的发射波长范围相近（均可被耗尽激光作用），但其激发波长不同。借助可调谐的白光激光器和可调谐探测器，可在最大程度上增强信号并消除光谱重叠，操作相对简便。因此，我们已成功应用多种市售染料组合，例如Pacific Orange与Alexa Fluor 488（本文所用）。&#160; 本实验方案主要针对人自然杀伤（NK）细胞的评估，因为这一直是我们实验室的研究重点。&#160; 在本示例中，我们特别采用了NK92细胞系，这是我们在实验工作中长期常规使用的细胞系21,33。

<table><tbody><tr><td>#1.5 盖玻片</td><td>VWR</td><td>48393-172</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm</td><td>BD Biosciences</td><td>554722</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>棉签</td><td>Fisher Scientific</td><td>S450941</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 离心管（50 ml）</td><td>VWR</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FCS）（500 ml）</td><td>Atlantic Biologicals</td><td>S11050</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗兔 Pacific Orange</td><td>Life Technologies</td><td>P31584</td><td></td></tr><tr><td>实验室用擦拭纸</td><td>VWR</td><td>82003-820</td><td></td></tr><tr><td>指甲油</td><td>VWR</td><td>100491-940</td><td></td></tr><tr><td>NK-92 细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-2407</td><td></td></tr><tr><td>鬼笔环肽 Alexa Fluor 488</td><td>Life Technologies</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Life Technologies</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>Prolong 抗荧光淬灭封片剂</td><td>Life Technologies</td><td>P7481</td><td></td></tr><tr><td>纯化抗 CD18 抗体</td><td>Biolegend</td><td>301202</td><td></td></tr><tr><td>纯化抗 NKp30 抗体</td><td>Biolegend</td><td>325202</td><td></td></tr><tr><td>纯化抗穿孔素抗体</td><td>Biolegend</td><td>308102</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基（500 ml）</td><td>Life Technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>皂荚皂苷（来自皂荚树皮）</td><td>Sigma</td><td>S4521</td><td></td></tr><tr><td>Super PAP 笔</td><td>Life Technologies</td><td>008899</td><td></td></tr><tr><td>曲拉通 X-100</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>22142</td><td></td></tr><tr><td>Huygens 去卷积软件</td><td>SVI</td><td>Contact company</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP8 TCS STED 显微镜</td><td>Leica Microsystems</td><td>contact company</td><td></td></tr></tbody></table>

双色时间门控受激发射损耗（sted）纳米显微镜观察免疫突触

Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion (STED) Nanoscopy

自然杀伤细胞通过形成严格调控且高度精确的免疫突触（IS），以裂解病毒感染细胞或肿瘤细胞。动态的肌动蛋白重组对自然杀伤细胞的功能及免疫突触的形成至关重要。传统上，对突触处F-肌动蛋白的成像依赖共聚焦显微镜，但光的衍射极限限制了包括共聚焦在内的荧光显微镜的分辨率，约为200 nm。近年来成像技术的进步推动了突破衍射极限的超分辨率成像技术的发展。为了可视化免疫突触处的F-肌动蛋白结构，我们通过将自然杀伤细胞黏附于玻璃表面的激活受体上，重建其细胞毒突触。随后，我们采用双色受激发射损耗显微镜（STED）对目标蛋白进行成像。该方法可在突触处实现&#60;80 nm的分辨率。本文中，我们描述了样本制备步骤以及利用双色STED纳米显微镜对NK细胞免疫突触处F-肌动蛋白进行成像的图像采集过程。我们还展示了使用Leica SP8软件和时间门控STED技术优化图像采集的方案。最后，我们采用Huygens软件对图像进行去卷积后处理。

显然，超分辨率成像的主要目标之一是优于传统的共聚焦显微镜成像。然而，存在一些常见陷阱，可能导致分辨率未达到理想水平，因此需要对每个实验进行单独优化。在我们的代表性实验中，我们对通过抗体结合于玻璃表面而被激活的自然杀伤（NK）细胞中的F-肌动蛋白网络进行成像。STED成像相较于共聚焦显微镜未能实现分辨率提升的常见原因及相应纠正措施如下：
<ol>
	<li>欠采样（图1a）。这可能导致图像颗粒状和像素信息丢失，表现为F-肌动蛋白丝分辨率差。通常可通过增加线平均或帧平均来校正此问题。</li>
	<li>漂白和/或过采样（图1b）。这可能是由于过度的线平均导致像素驻留时间过长所致。或者，也可能是成像前对样本扫描过度所致，包括耗尽激光的过度使用。这种情况常导致图像模糊或不清晰。可通过在采集前仅最小程度地扫描目标区域，或在可能的情况下提高激光扫描速度来校正。如果问题仍然存在，可降低耗尽激光的功率。</li>
</ol>
通过优化像素驻留时间、激发激光功率和耗尽激光功率之间的平衡，可以获得分辨率更高且信息充足的图像（图1c）。进一步结合去卷积处理，可进一步提高分辨率（图1d）。当采集参数优化后，去卷积可在定性和定量两方面提升分辨率，实现常规性的亚100 nm分辨率。
<img alt="去卷积增强细胞结构的荧光显微镜图像。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51100/51100fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51100/51100fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1. STED 成像中采集参数的优化及常见问题。 NK92 细胞在包被了抗 CD18 和抗 NKp30 抗体的玻片上激活 20 分钟，随后固定、透化，并用 Phalloidin Alexa Fluor 488 对 F-actin 进行染色。 a) 因采样不足导致图像信息丢失的示例。 b) 因光漂白或过度采样导致分辨率下降的示例。 c) 优化后的成像条件。 d) 优化条件下去卷积可实现更显著的分辨率提升。比例尺 = 5 μm。

本文展示了在玻璃表面重现自然杀伤细胞（NK细胞）细胞毒性免疫突触，并通过双色STED超分辨显微镜对其进行成像的实验方案。利用该方法，我们可获得突触蛋白和细胞骨架的亚100 nm分辨率图像。

双色时间门控受激发射损耗（STED）纳米显微镜观察免疫突触

自然杀伤细胞通过形成严格调控且精密调节的免疫突触（IS），以裂解病毒感染或肿瘤源性细胞。动态……

本实验的总体目标是利用TED显微镜技术对自然杀伤细胞杀伤突触中F-肌动蛋白等结构进行可视化观察。首先，通过在载玻片上使用激活抗体重建突触结构；其次，对细胞进行固定、通透处理，并对目标结构进行染色。接下来，使用激光扫描共聚焦显微镜对切片进行成像，随后应用稳态耗尽技术以提高图像分辨率。最后一步是使用去卷积算法处理图像。最终，得益于双色稳态耗尽与内窥显微技术，结果可实现对细胞结构小于100纳米的分辨率成像。该方法有助于解答细胞生物学领域中的关键问题，例如细胞骨架与胞吐作用之间的关系。在我们的研究中，关注的是自然杀伤细胞分泌一种称为溶解性颗粒的特化溶酶体。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为在应用 TED 耗竭激光时存在多个可调节的变量。耗尽光束的不当应用不仅无法提高分辨率，反而会导致分辨率下降。实验准备时，将30毫升含10%胎牛血清（FCS）的RPMI培养基和1毫升BD CYTOF™破膜液分别预热至37摄氏度。随后开始用抗体包被盖玻片的过程。取1.5号盖玻片，使用PAP笔在盖玻片上画出硬币大小的方格。每种测试条件准备一个方格。每个圆片中加入200微升抗体，抗体浓度为5微克/毫升，溶于PBS中。用于NK 92细胞活化时，使用抗CD 18和抗NK P 30抗体。将加样后的盖玻片在37摄氏度下孵育30分钟，然后用室温PBS浸洗，立即加入待测条件下的细胞，每种条件需准备50万细胞备用。用 10 毫升预热的培养基洗涤细胞，然后将细胞重悬于相同温度的预热培养基中。按每毫升 250 万个细胞的密度使细胞充分悬浮后，将 200 微升细胞悬液转移至盖玻片上的各个抗体方格中，在 37 摄氏度、5%CO2 条件下孵育盖玻片上的细胞。在此情况下，孵育 20 分钟足以使自然杀伤（NK）细胞中的颗粒极化。孵育结束后，在室温下用 PBS 轻柔洗涤盖玻片。首先，在1毫升温热的BD CY effects cyto perm溶液中加入1微升TRITTON X 100，然后涡旋混匀。将200微升该溶液分别加入盖玻片上的每个实验条件区域。然后将细胞置于室温避光环境中，静置10分钟。孵育结束后，用染色缓冲液轻柔清洗盖玻片。随后用棉签轻轻擦干周围区域的边缘。接下来，向圈出的区域加入200 µL用染色缓冲液稀释的一抗，将盖玻片置于避光环境中孵育30分钟。适用于稳定成像的一些优质二抗包括Alexa Fluor 488、Pacific Orange和Horizon V500，这些二抗在1:200的稀释比例下均有良好效果。孵育洗涤后，将盖玻片放入染色缓冲液中，轻拍干燥。与之前相同，每种条件的方格中加入 200 µL 二抗。然后避光静置 30 分钟。此时，可在额外洗涤后加入其他抗体。例如，可使用 1:200 稀释的 Phin 抗体检测 F-肌动蛋白。封片剂应选择 Prolong，而不应使用 Vector Shield，因其与 STED 不兼容。如果使用酚染色，应避免使用二硫苏糖醇，但使用其他还原剂则无妨。现在向载玻片上滴加 10 至 20 微升封片剂。将盖玻片倒置，轻轻放入封片剂中，避免产生气泡。然后将载玻片孵育 24 小时。盖上盖玻片后，次日用指甲油封固盖玻片，随后进行成像。启动激光器和软件。STED 耗尽激光器应在 100% 功率下预热并完成准直。使用目镜对样本进行聚焦，然后切换至软件。扫描第一个通道，即波长最长的通道。在四楼，优化激光功率、激发光束位置以及探测器范围。避免设置超过100。接下来，采集共聚焦图像并检查像素。像素饱和度、逐线扫描和帧平均均可提高像素分辨率。目标是达到每个像素低于30纳米。稳定状态下可接受一定程度的饱和。接下来，以50%功率施加STED耗尽光束并采集图像。如果分辨率提高，可施加更高的功率。此外，调节激发激光功率、线平均或增益也可能提高分辨率。为降低背景信号，可应用 0.3 纳秒的时间门控并向上调节。应使用全半高宽最大值计算法来估算新的分辨率。当所有通道均调整完毕后，若结果满意，则对第二个通道重复上述步骤。通过使用所有扫描序列对单染对照样本进行成像，以检查光谱重叠情况。轻微的光谱重叠可通过软件进行光谱拆分校正，但最好避免或尽量减少重叠。接下来，进行定量成像的图像采集。根据实验条件，每组至少采集20张图像。为了对保存的图像进行去卷积处理，请在相应的软件中打开文件。检查每个通道的参数，特别是激发光谱和发射光谱、稳态耗尽发射以及成像方向。然后应用该软件的去卷积计算。默认设置通常已足够，但由于不同楼层的力信号噪声比存在差异，该参数需针对实验手动设置。使用 stead 时存在一些常见问题，可能导致分辨率不理想，其中之一是采样不足。这会导致图像出现颗粒状以及像素信息的丢失，例如这些 f 肌动蛋白丝。增加扫描线或帧的平均次数通常可解决此问题。另一个问题是光漂白或因像素停留时间过长引起的过度采样。停留时间过长通常源于图像采集前扫描过程中过度的线性平均，这也可能是造成问题的原因，可通过在图像采集前采用更小范围的扫描或使用更高的扫描速度来纠正。降低激光功率也有助于整体成像效果的改善，图像质量将显著提升。去卷积将进一步改善图像质量，无论是在定量还是定性方面。在进行此操作时，应常规获得低于100纳米的分辨率。需要牢记的是，在每次实验开始前以及此后大约每小时都应按照本方案进行稳态光束校准。此外，还可采用其他方法（如定量分析）来回答有关共定位、亚细胞定位及分子相互作用的进一步问题。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

免疫突触由双色时间选通受激发射损耗（STED）纳米显微可视化

Neisseria meningitidis 与人类α-肌动蛋白结合蛋白的细胞内相互作用的共聚焦成像可视化与定量分析

本方案详细介绍了如何通过免疫细胞化学方法，在分离的神经元培养物和脑切片中定量突触数量。利用特定区室的抗体，我们标记突触前终末以及突触后特化位点。我们将突触定义为这些标记物产生的信号之间共定位的位点。...

量化突触：一种基于免疫细胞化学的突触数量检测方法

本视频展示了一种在支撑脂质双层（SLB）上可视化自然杀伤（NK）细胞免疫突触形成的实验技术。首先，将荧光标记的NK细胞活化受体配体与SLB结合，随后加入NK细胞进行孵育。接着，对细胞进行聚合肌动蛋白和含穿孔素的杀伤颗粒染色。该方法可利用受激发射损耗（STED）显微镜实现对突触形成过程的可视化观察。...

在支撑脂双层上自然杀伤细胞免疫突触形成的超分辨率成像

本视频展示了免疫突触拓扑结构的活细胞成像，研究携带荧光抗原的T淋巴细胞与上皮细胞之间的相互作用。荧光显微镜显示内皮细胞中红色细胞质的移位以及黄色膜环的出现，表明免疫突触的形成。...

通过活细胞成像评估免疫突触拓扑结构

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活体神经末梢中内体动态的四维荧光成像可视化

本文介绍了一种将玻璃支撑脂质双层技术与受激发射损耗（STED）超分辨率成像技术相结合的方法，用于形成免疫突触。本实验方案的目的是为使用者提供成功实施这两种技术所必需的操作步骤和指导。...

在玻璃支撑的平面脂双层上对自然杀伤细胞免疫突触进行超分辨率成像

适应性免疫由T细胞与抗原呈递细胞之间形成的动态“免疫突触”所调控。本方案描述了研究内皮细胞的方法，既可将其作为研究尚不充分的生理性抗原呈递细胞，也可作为新型“平面细胞抗原呈递模型”进行研究。...

用于成像免疫突触动态的内皮平面细胞模型

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使用受激发射损耗（STED）显微镜对B细胞免疫突触中的肌动蛋白与微管细胞骨架进行可视化观察

本方法学的总体目标是从样品制备到图像采集与重建，提供最佳实验条件，以在固定细胞中实现微管和中间丝的二维双色dSTORM成像。...

利用二维直接随机光学重建显微镜成像中间丝和微管

本方案用于成像免疫突触的形成过程以及随后向免疫突触定向的分泌性物质运输。细胞 conjugates 由经超抗原刺激的 Raji 细胞（作为抗原呈递细胞）与 Jurkat 克隆细胞（作为效应辅助性 T...

成像人类免疫突触

本方案描述了一种通过共聚焦与STED显微镜联合进行神经肌肉接头形态计量分析的方法，用于量化脊髓性肌萎缩（SMA）和与ColQ相关的先天性肌无力综合征（CMS）小鼠模型中的病理改变。...

通过共聚焦与超分辨率显微镜联合技术对小鼠神经肌肉接头进行表征

学习使用双色STED纳米显微技术可视化NK细胞毒性免疫突触，实现亚100纳米分辨率的细胞骨架与蛋白成像。该方法为研究细胞骨架与胞吐作用关系提供高分辨率工具。

双色时间门控受激发射损耗（STED）纳米显微镜观察免疫突触

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