双色时间门控受激发射损耗（STED）纳米显微镜观察免疫突触

本实验的总体目标是利用TED显微镜技术对自然杀伤细胞（NK细胞）杀伤突触中F肌动蛋白等结构进行可视化观察。首先，通过在玻璃表面使用激活抗体重建突触结构；其次，对细胞进行固定、通透处理，并对目标结构进行染色。

接下来，使用激光扫描共聚焦显微镜对切片进行成像，随后应用稳态耗尽技术以提高图像分辨率。最后一步是使用去卷积算法处理图像。最终，得益于双色稳态耗尽与内窥显微技术，结果可实现对细胞结构的亚100纳米分辨率成像。

该方法有助于解答细胞生物学领域中的一些关键问题，例如细胞骨架与胞吐作用之间的关系。在本研究中，我们关注的是自然杀伤细胞分泌一种称为溶细胞颗粒的特化溶酶体。通常，初次使用该方法的研究人员会遇到困难，因为在应用 TED 耗竭激光时存在多个可调节的变量。

耗尽光束的不当应用不仅无法提高分辨率，反而会导致分辨率下降。实验准备时，将30毫升含10%胎牛血清（FCS）的RPMI培养基和1毫升BD Cytofix/Cytoperm固定/透化液分别预热至37摄氏度。随后开始用抗体包被盖玻片的过程。

取1.5号盖玻片，使用PAP笔在盖玻片上画出硬币大小的方格。每种检测条件准备一个方格。

每个圆圈中加入200微升抗体，抗体浓度为每毫升5微克，溶于PBS中。对于NK 92细胞的激活，使用抗CD 18和抗NK P 30抗体。将加样后的盖玻片在37摄氏度孵育30分钟，然后用室温PBS浸洗，立即进行后续操作：为每种测试条件准备好500,000个细胞并加入。

用 10 毫升预热的培养基洗涤细胞，然后将细胞重新悬浮于相同温度的预热培养基中。按每毫升含 250 万个细胞且细胞完全悬浮的状态，将 200 微升细胞悬液分别加入盖玻片上的各个抗体方格中，在 37°C、5%CO2 条件下孵育盖玻片上的细胞。孵育 20 分钟足以使 NK 细胞内的颗粒极化；孵育结束后，在室温下用 PBS 轻柔地洗涤盖玻片。

首先，在1毫升温热的BD CYTOFIX/CYTOPERM溶液中加入1微升TRITON X-100，然后涡旋混匀。将200微升该溶液分别加入盖玻片上的每个实验条件区域。

然后将细胞置于室温避光处，静置10分钟。孵育结束后，用染色缓冲液轻轻洗涤盖玻片。随后用棉签轻轻擦干周围区域的边缘。

接下来，向圈出的区域加入200 µL用染色缓冲液稀释的一抗，将盖玻片置于避光环境中孵育30分钟。适用于稳定成像的一些优良二抗包括Alexa Fluor 488、Pacific Orange和Horizon V500。这些二抗在1:200的稀释比例下均具有良好的效果。

孵育洗涤后，将盖玻片放入染色缓冲液中，然后轻轻吸干。与之前相同，每种条件的方格中加入 200 µL 二抗。然后避光静置 30 分钟。

此时，可在额外洗涤后加入其他抗体。例如，可使用 1:200 稀释的 Phin 抗体检测 F 肌动蛋白。封片剂应选择 Prolong，而非 Vector Shield，因为后者与 STED 不兼容。

如果使用phin染色，则避免使用二硫苏糖醇，但使用其他试剂是可行的。现在将10至20微升封片剂滴加到载玻片上。将盖玻片倒置，轻轻将其放入封片剂中，避免产生气泡。然后将载玻片孵育24小时。

盖上盖玻片，第二天取出，用指甲油封固盖玻片，然后进行成像。启动激光器和软件。稳态耗尽激光器应在100%功率下预热并进行光路校准。

使用目镜对样本进行聚焦，然后切换到软件。扫描第一个通道，即波长最长的通道。在第四层，优化激光功率、激发光束位置和检测器范围。

避免设置超过100。接下来，采集共聚焦图像并检查像素。饱和度、线平均和帧平均均可提高像素分辨率。

目标是达到每像素低于30纳米。为保持稳定，可接受一定程度的饱和。接下来，以50%功率施加STED耗尽光束并采集图像。

如果分辨率提高，可施加更高的功率。此外，调节激发激光功率、扫描线平均次数或增益也可能提高分辨率。为降低背景信号，可应用0.3纳秒的时间门控，并逐步向上调节。

应使用完整的半高全宽计算来估计新的分辨率。当所有通道均调整完毕后，若结果满意，则对第二个通道重复上述步骤。通过使用所有扫描序列对单染对照样本进行成像，以检查光谱重叠情况。

轻微的光谱重叠可通过软件进行光谱拆分校正，但最好避免或尽量减少重叠。现在开始采集用于定量成像的图像。根据实验条件，每组至少采集20张图像。

要对保存的图像进行去卷积处理，请在相应的软件中打开文件。检查每个通道的参数，特别是激发光谱和发射光谱、稳态耗尽发射以及成像方向。然后应用软件的去卷积计算功能。

默认设置通常已足够，但由于不同地面受力之间的信噪比存在差异，该参数需针对实验手动设定。使用 stead 时存在一些常见问题，可能导致分辨率不理想，其中之一是采样不足。

这会导致图像颗粒感增加以及像素信息丢失，例如这些 f 肌动蛋白丝中的情况。增加扫描线或帧平均次数通常可解决此问题。另一个问题是由于像素停留时间过长导致的荧光漂白或过度采样。

停留时间过长通常是由于在图像采集前进行了过多的扫描线平均所致，这也可能是造成问题的原因，可通过在图像采集前采用较小的扫描范围或使用更高的扫描速度来纠正。降低激光功率也有助于整体工作的顺利进行，图像质量将显著改善。

去卷积将进一步提升图像质量，无论是在定量还是定性方面。在尝试此操作时，应常规获得低于100纳米的分辨率。

需要记住的是，在每次实验前以及此后大约每小时都应按照本方案进行稳定的光束校准。此外，还可采用其他方法（如定量分析）来回答有关共定位、亚细胞定位及分子相互作用的进一步问题。