Name: 原位胶质母细胞瘤小鼠模型的维护脑实质的物理约束，并适用于活体双光子显微镜 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-21T15:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: 了解原位胶质母细胞瘤小鼠模型的建立方法，通过颅窗植入肿瘤球体并进行双光子活体成像。该技术可长期追踪肿瘤进展、血管重塑及细胞微环境动态变化，为神经肿瘤学研究提供高分辨率在体观察手段。

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作者衷心感谢 KK Fenrich 博士、M-C. Amoureux 博士、P. Weber 和 A. Jaouen 提供的有益讨论；感谢 M. Hocine、C. Meunier、M. Metwaly、S. Bensemmane、J. Bonnardel、IBDML 动物实验中心工作人员以及 IBDML PicSIL 成像平台工作人员提供的技术支持。本研究得到了法国国家癌症研究院（INCA-DGOS-INSERM6038）向 GR 提供的资助，法国国家科研署（ANR JCJC PathoVisu3Dyn）和大脑研究联合会（FRC）向 FD 提供的资助，以及法国医学研究联合会和 Cancéropole PACA 向 CR 提供的博士后奖学金支持。

所有实验操作均依照法国法律法规，并遵循1986年11月24日欧洲共同体理事会指令（86/609/EEC）关于实验动物的护理与使用规定进行。动物研究已获得罗讷河口省兽医服务局（许可证编号 D-13-055-21）授权，并经普罗旺斯-蓝色海岸伦理委员会批准&#176;14（项目编号 87-04122012）
1. 类球体的制备
<ol>
	<li>琼脂糖包被培养皿的制备
		<ol>
			<li>将1 g琼脂糖与100 ml未添加胎牛血清的细胞培养基混合。使用微波炉（850瓦，加热40秒，随后再加热3次，每次15秒；每次加热之间搅拌溶液）煮沸溶液，使琼脂糖完全溶解。将该1%琼脂糖溶液在120 °C条件下高压灭菌20分钟，以确保无菌。注意：在高压灭菌前务必确保琼脂糖完全溶解。不均匀可能会影响球状体的形成。</li>
			<li>从高压灭菌器中取出后，向每个100 × 20 mm的培养皿中加入10 ml 1%琼脂糖溶液。在室温下静置20分钟，使琼脂糖溶液完全凝固。</li>
			<li>在琼脂糖表面加入10 ml PBS以维持湿度。用封口膜包裹琼脂糖包被培养皿的盖子进行密封，防止蒸发。若PBS层能适当保持湿度，培养皿可在4 °C保存长达2个月。</li>
		</ol>
	</li>
	<li>球状体培养
		<ol>
			<li>在75 cm2培养瓶中，将胶质瘤细胞接种于推荐的培养基中，以单层形式进行培养。</li>
			<li>将其中一个1%琼脂糖包被培养皿中的PBS替换为1.5 ml来自含有胶质瘤细胞二维单层培养瓶的&#34;预处理培养基&#34;。</li>
			<li>移除含有胶质瘤细胞二维单层的培养瓶中的培养基。</li>
			<li>用10 ml PBS轻轻冲洗单层细胞。</li>
			<li>加入2 ml 0.05%的胰蛋白酶/EDTA溶液，并在37 °C孵育4分钟。注意：孵育时间可能因所用细胞系不同而有所变化。</li>
			<li>加入8 ml培养基以终止胰蛋白酶的作用，并轻轻吹打细胞悬液。注意：吹打时注意避免将空气吹入细胞悬液，以免增加细胞死亡。</li>
			<li>将6 ml细胞悬液转移至无菌样品瓶中。</li>
			<li>在800 rpm条件下离心4分钟。</li>
			<li>弃去上清液，并将细胞沉淀轻轻重悬于3 ml培养基中。</li>
			<li>将细胞悬液接种至已准备好的琼脂糖包被培养皿中。</li>
			<li>将培养皿置于37 °C、5% CO2的培养箱中培养2至3天，直至形成所需直径的球状体。</li>
		</ol>
	</li>
</ol>
2. 类球体与窗片移植
<ol>
	<li>注射系统的准备
		<ol>
			<li>将玻璃毛细管（直径1 mm）在70%乙醇中超声清洗10分钟。用去离子水冲洗两次，然后放入培养箱中干燥。</li>
			<li>使用拉管仪拉制数根已清洁的玻璃毛细管，以制备少量储备毛细管。</li>
			<li>用组织纸轻轻刮擦拉制好的毛细管尖端末端，使其断裂，形成所需大小的斜面末端：通常外径为300-350 &#181;米，内径为250-300 &#181;m. 在拉制过程中，使用目镜配备有刻度镜的体视显微镜控制毛细管的直径。</li>
			<li>将毛细管的非斜面端通过一段塑料管连接至三通接头，塑料管的内径需与毛细管的外径相匹配。</li>
			<li>使用塑料管将歧管的另外两个接口连接到 25 &#181;1 微升注射器和装有组织相容性矿物油的 1 毫升注射器。</li>
			<li>调节多通阀选择器，使微量注射器与1 ml注射器之间形成通路。移除 将微量注射器的活塞向后推，注入矿物油至微量注射器内，直至推动1 ml注射器的活塞时有矿物油渗出。更换微量注射器的活塞时需小心操作，避免在管内留下气泡。</li>
			<li>调节多路选择阀，使毛细管与1 ml注射器之间形成通路。用矿物油填充毛细管，直至油从尖端溢出，注意避免管内产生气泡。</li>
			<li>调节多通阀选择器，使微升注射器与毛细管相连。排出约10 &#181;矿物油。</li>
			<li>将毛细管尖端浸入PBS溶液中，利用微升注射器的刻度吸入5&#181;毛细管中 PBS 的液面。注意油与 PBS 之间的弯月面清晰可见。</li>
			<li>将毛细管固定在手术体视显微镜下的三轴显微操作器上。该系统将用于在视觉控制下将毛细管精确定位至注射位点。</li>
		</ol>
	</li>
	<li>球体植入
		<ol>
			<li>在诱导室中通过吸入异氟烷（1.5%空气混合气体，持续1至1.5分钟）对小鼠进行轻度镇静。</li>
			<li>用氯胺酮/赛拉嗪混合物（120 mg/kg，12 mg/kg）经腹腔注射麻醉动物。需注意麻醉常导致动物体温下降。建议在26℃的环境中进行手术。 &#176;C，并使用底部带温控加热垫的方式保持动物体温。</li>
			<li>涂抹眼药膏以防止眼睛干燥。</li>
			<li>剃除动物的头皮毛发。</li>
			<li>使用耳杆和咬合器将动物固定于立体定位仪中。</li>
			<li>用聚维酮碘清洁皮肤（先用3%皂液，再用10%溶液）。</li>
			<li>用手术刀在头皮正中纵向做一个1厘米长的切口。用剪刀剪开并去除顶骨上方的皮肤。</li>
			<li>用手术刀片轻轻去除颅骨上方的骨膜。在骨面上充分涂抹氰基丙烯酸酯，以形成粗糙表面，便于后续粘合剂的附着。</li>
			<li>在手术放大镜下钻开顶骨，制作一个直径为4 mm的颅骨开窗。整个操作过程中应充分使用含青霉素（1,000 U/ml）和链霉素（1 mg/ml）的冰冻PBS，以防止产热。用镊子和湿润的无菌纱布清除细小骨片。钻孔时应注意避开顶骨颅缝至少1 mm，以避免出血。</li>
			<li>在颅骨开窗边缘处磨薄骨质，此处将用于密封玻璃窗。目的是确保后续玻璃窗的平面定位，并使脑组织与玻璃窗之间达到最大接触面积。使用镊子缓慢去除骨质，并用PBS溶液清洁暴露的硬脑膜。</li>
			<li>取一个直径为5 mm的圆形玻璃盖玻片，用酒精清洁后用纸巾擦干。尝试将盖玻片作为颅骨开窗的盖子，确认大脑的大片平坦区域与玻璃接触。如有必要，取下盖玻片以进一步磨薄侧部颅骨。重复操作，直至盖玻片就位后轻轻施加压力时，大脑能够被压平。</li>
			<li>用酒精再次清洁盖玻片，用纸巾擦干，并单独存放备用。</li>
			<li>使用26号针头在颅骨开窗的中心位置刺穿硬脑膜，注意避开主要血管。操作时应确保不损伤脑实质，因为此步骤的目的仅为切开硬脑膜。</li>
			<li>用 PBS 溶液轻柔清洗硬脑膜，以去除出血的血液。在准备类球体注射时，用一片滤纸覆盖。</li>
			<li>使用2.1步骤中准备的类球体注射系统，吸取一个与毛细管内径相匹配的圆形类球体（直径约200-250 &#181;m）从步骤1.2制备的培养皿中取出类球体，应连同约5 &#181;l 培养基。应依靠其自身重量流至毛细管尖端。</li>
			<li>移除用于覆盖颅骨开窗的湿润滤纸，将动物置于注射系统下。</li>
			<li>将注射移液管降低至接触硬脑膜上的孔洞处，然后再次降低 250 &#181;m. 等待30秒。</li>
			<li>使用微量注射器的活塞缓慢注入球状体（2-3 &#181;l）同时用一小片薄纸巾吸出多余液体。等待30秒，然后缓慢将注射移液管提起50 &#181;m 靠近表面。再次等待 30 秒，并以 50 为步长重复提升操作 &#181;直至表面。等待时间可避免类球体粘附在移液管上而被带出。</li>
			<li>使用荧光体视显微镜确认脑内类球体的存在。</li>
			<li>混合 100-300 &#181;在培养皿中用PBS溶液浸泡直径为m的交联葡聚糖凝胶珠。等待1分钟，取出部分已水合的凝胶珠，置于颅骨开窗附近的骨组织上。</li>
			<li>在宏观控制下，选择一个直径与硬脑膜开口大小相近的珠子。使用镊子将交联葡聚糖凝胶珠切成两半。</li>
			<li>将交联葡聚糖凝胶半珠轻轻放入注射孔中，凸面朝向类球体。注意不要移除类球体，并轻轻向下按压，直至凹面边缘与周围硬脑膜接触。</li>
			<li>在玻璃载玻片上滴一滴氰基丙烯酸酯胶水；将牙签尖端浸入胶水中以蘸取少量胶水。迅速将胶水涂抹于交联葡聚糖凝胶半珠边缘周围，将其与邻近的硬脑膜粘合密封。操作时需快速且准确，避免将交联葡聚糖凝胶半珠粘附在牙签上。注意避免使用过多胶水，以防胶水扩散，干燥后影响甚至阻碍成像。等待2分钟使胶水完全干燥，随后用PBS溶液清洗颅骨开窗区域及周围骨组织。</li>
		</ol>
	</li>
	<li>窗植入术
		<ol>
			<li>将直径为5 mm的圆形盖玻片置于颅骨开窗部位上方（见2.2.12）。盖玻片的边缘必须位于颅骨开窗外部的变薄颅骨上。盖玻片需与硬脑膜及边缘处的变薄骨组织直接接触。确保硬脑膜与玻璃盖玻片之间实现直接接触至关重要，否则可能形成瘢痕组织，影响光学透明度。</li>
			<li>用纸巾吸去盖玻片边缘的PBS，以便在盖玻片中心施加轻微压力时，液体不会完全覆盖颅骨开窗区域。这将确保在目标区域侧边，骨组织、玻璃和脑组织能够粘合在一起。</li>
			<li>用镊子轻轻按压盖玻片中心以保持轻微压力，同时在骨组织与盖玻片交界处小心涂抹氰基丙烯酸酯胶。胶水将自发扩散，直至接触到PBS溶液界面；由于胶水具有疏水性，溶液将起到屏障作用。密封过程应在一分钟内完成，但在盖玻片完全固定前务必极度小心，避免移动。否则可能导致氰基丙烯酸酯渗漏至硬脑膜，从而导致手术失败。</li>
			<li>若胶水溢出至玻璃表面，需使用显微手术刀片以螺旋方式轻轻刮除，以免影响光学透明度。操作时注意避免用力过大，以防压碎盖玻片。</li>
			<li>通过在盖玻片边缘朝向邻近颅骨处涂抹牙科水泥来加固玻璃固定装置。确保覆盖从盖玻片至头皮的整个暴露颅骨区域。使用额外的水泥在盖玻片周围构建侧壁，以形成浸没物镜所需的储液池。牙科水泥将在10分钟内固化。</li>
		</ol>
	</li>
</ol>
3. 术后护理与成像准备
<ol>
	<li>术后护理
		<ol>
			<li>将小鼠从立体定位仪中取出，在骨盆区域皮下注射地塞米松（0.2 mg/kg）和力美达（Rimadyl，5 mg/kg），然后将其放置于含有温暖组织巢穴的笼子中。</li>
			<li>持续监测动物，直至麻醉作用完全消失。通常在手术后2至3小时，小鼠即可完全恢复活动能力。确保动物能够方便地获取食物和水，并提供含葡萄糖的琼脂糖凝胶（琼脂糖3%，葡萄糖3%）。</li>
			<li>每天监测动物体重，并在术后前10天内每天皮下注射地塞米松（0.2 mg/kg）和力美达（Rimadyl，5 mg/kg）。出于伦理考虑，当体重下降超过原始体重的15%时，应实施安乐死。随着肿瘤体积增大，颅内压升高，导致动物出现运动功能障碍。该现象依赖于所使用的肿瘤细胞系，并在术后不同时间点出现。应特别注意根据所用细胞系明确实验终点的特征。</li>
		</ol>
	</li>
	<li>成像前准备
		<ol>
			<li>将小鼠置于诱导室中，通过吸入异氟烷（空气中浓度1.5%，持续1至1.5分钟）进行轻度镇静。</li>
			<li>通过腹腔注射氯胺酮/赛拉嗪混合物（100 mg/kg，10 mg/kg）对动物进行麻醉。此类麻醉通常可维持约45分钟的观察时间。若需进行更长时间的成像，应使小鼠持续吸入含异氟烷的空气（浓度0.25–0.75%）。</li>
			<li>涂抹眼膏以防止眼睛干燥。</li>
			<li>将动物置于立体定位仪上，并用耳杆固定颅骨。</li>
			<li>为观察血管，可静脉注射荧光染料。</li>
			<li>若观察窗表面污浊，可用细刀片和纸巾角落轻轻清除碎屑进行清洁。切勿使用酒精清洁观察窗，因其可能与牙科水泥不相容，并可能导致窗口下方脑组织降温。</li>
		</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

该方法可利用光学成像技术，在数天至数周内持续监测原位移植胶质瘤的生长情况。同一动物模型在病理发展过程中可接受几乎任何类型的脑部成像检测；而双光子显微镜的特定制备方法则提供了在活体动物脑内实现亚细胞分辨率的独特机会。本方案的优势在于，可促使肿瘤向脑实质内生长，而非在硬脑膜外生长——若胶质瘤细胞通过受损的硬脑膜逸出中枢神经系统，则可能发生后者情况。在缺乏脑内环境物理约束的情况下，肿瘤细胞确实会增殖更快，因为它们无需浸润脑实质16。既往发表的方法在移植后未尝试封闭硬脑膜，这一问题尤为突出，因为这些方法注射的是细胞悬液而非类球体9,13,14。事实上，细胞悬液难以实现局灶性施用，因为在将移液管从脑深部撤回至硬脑膜的过程中，单个细胞会系统性地沿注射轨迹播散。
本实验方案可应用于多种小鼠品系，包括转基因小鼠和免疫抑制小鼠。可移植并可视化多种胶质瘤细胞系，包括直接来源于人组织活检的细胞，前提是这些细胞在移植前已转染并稳定表达荧光报告基因。手术过程通常可在1小时内完成，可快速获得成组的实验动物。因此，该方法可用于研究血管重塑、药物治疗对血管生成和肿瘤生长...

多形性胶质母细胞瘤是成人中最具有侵袭性的脑肿瘤类型，其中位生存期为12个月，5年生存率仅为5%。临床治疗主要依赖手术、放疗和化疗，通常采用联合治疗方案。然而，这些治疗手段的效果仍仅为姑息性1-3。
迄今为止，大多数神经肿瘤学研究依赖的技术只能提供静态视图，并且需要在不同时间点处死大量携带肿瘤的动物（例如参见4,5）。近期发展的基于活体成像的随访方法使得能够在同一动物体内随时间推移研究胶质瘤的生长以及肿瘤细胞与其病理生理微环境之间的相互作用。这为获取以往无法实现的独特信息开辟了途径6. 可利用在特定细胞中表达荧光标签的转基因动物来研究肿瘤细胞之间的特异性相互作用 例如 本文中的神经元.
过去十年中，活体双光子显微镜技术7 已成为基础神经肿瘤学研究和临床前试验的金标准8,9 因其能够对小鼠大脑进行深层活体观测&#62;硬脑膜下500 µm处，具有微米级空间分辨率10采用活体双光子显微镜结合植入慢性颅窗的原位动物模型11可以在同一只小鼠上随时间推移监测肿瘤的进展过程9,12.
然而，这些先前发表的动物模型的一个主要缺点是，它们未能模拟肿瘤生长所受的物理限制，因为在注射细胞悬液后硬脑膜未被封闭9,13,14。胶质瘤细胞可能泄漏至硬膜外间隙，从而将原位胶质瘤模型转变为异位模型。
本文介绍的动物模型包括将荧光标记的胶质瘤细胞球注射至大脑皮层深度200 µm处，随后使用交联葡聚糖凝胶半珠和组织相容性胶水封闭硬脑膜。该方法使肿瘤生长局限于脑实质内，从而维持病理生理相关的物理约束条件。在肿瘤上方植入的慢性玻璃窗可为活体双光子显微镜提供便捷的光学通路。通过使用在特定细胞中表达荧光标记的转基因动物，可长期动态观察胶质瘤的生长过程，并研究其与微环境的相互作用（本例中通过荧光标记的葡聚糖突出显示神经元和血管系统）。

<table><tbody><tr><td>钻机</td><td>Dremel (德国)</td><td>398</td><td>任何高质量的外科骨科钻均可</td></tr><tr><td>钻头（#1/4 碳化钨圆头钻）</td><td>World Precision Instruments (美国)</td><td>501860 (#1/4)</td><td>哈佛仪器公司也有销售</td></tr><tr><td>组织剪刀</td><td>World Precision Instruments (美国)</td><td>14395</td><td></td></tr><tr><td>Dumont 镊子 M5S</td><td>World Precision Instruments (美国)</td><td>501764</td><td></td></tr><tr><td>牙科水泥</td><td>GACD (美国)</td><td>12-565 &amp; 12-568</td><td></td></tr><tr><td>氰基丙烯酸酯</td><td>Eleco-EFD (法国)</td><td>Cyanolit 201</td><td></td></tr><tr><td>无纤维玻璃毛细管</td><td>Clark Electromedical Instruments (英国)</td><td>GC100-15</td><td></td></tr><tr><td>微量注射器（25 &amp;micro;l）</td><td>Hamilton (美国)</td><td>702</td><td></td></tr><tr><td>显微操作器</td><td>World Precision Instruments (美国)</td><td>Kite-R</td><td></td></tr><tr><td>T型接头（三通旋塞阀 - 鲁尔锁）</td><td>World Precision Instruments (美国)</td><td>14035-10</td><td></td></tr><tr><td>立体定位仪（小鼠适配器）</td><td>World Precision Instruments (美国)</td><td>502063</td><td></td></tr><tr><td>玻璃盖玻片</td><td>Warner Instruments (美国)</td><td>CS-5R (64-0700)</td><td></td></tr><tr><td>交联葡聚糖凝胶（Sephadex）G50 粗颗粒 100-300 &amp;micro;m</td><td>可从多家供应商处获得，包括 Sigma (德国)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>眼药膏</td><td>TVM (法国)</td><td>Ocry-gel</td><td></td></tr><tr><td>荧光体视显微镜</td><td>Leica MZFLIII (德国)</td><td></td><td>其他公司也有销售</td></tr><tr><td>双光子显微镜</td><td>Zeiss LSM 7MP (德国)</td><td></td><td>其他公司也有销售（Nikon，&amp;hellip;）</td></tr><tr><td>红外可调飞秒激光器（Ma&amp;iuml;-Ta&amp;iuml;）</td><td>Spectra Physics (美国)</td><td></td><td>其他公司也有销售</td></tr></tbody></table>

一种保留脑实质物理约束并适用于活体双光子显微成像的原位胶质母细胞瘤小鼠模型

An Orthotopic Glioblastoma Mouse Model Maintaining Brain Parenchymal Physical Constraints and Suitable for Intravital Two-photon Microscopy

多形性胶质母细胞瘤（GBM）是最具侵袭性的脑肿瘤，目前尚无治愈性治疗方法。
该病理的鼠类模型依赖于在切开硬脑膜后，将胶质瘤细胞悬液注射到脑实质中。然而，为了便于活体双光子显微镜观察，细胞必须进行浅层注射，但浅层注射无法重现疾病的生理病理条件。事实上，大多数肿瘤细胞会通过注射通道逸出，进入硬脑膜外空间，并在缺乏脑实质机械约束的条件下异常快速地增殖。
我们的改进不仅在于将胶质瘤类球体进行局部植入，而非将胶质瘤细胞悬液注射至大脑皮层浅层，还在于使用交联葡聚糖凝胶半珠堵塞注射部位，该凝胶半珠通过氰基丙烯酸酯黏附于周围脑实质，并与硬脑膜密封。这些措施共同确保了肿瘤细胞在脑实质内的生理性扩展与浸润。最后，通过将玻璃窗用黏合剂固定于颅骨上封闭开颅部位，从而可在数周内实现慢性成像，且避免瘢痕组织形成。
利用荧光转基因动物移植荧光标记的肿瘤细胞，我们已证明胶质瘤细胞与神经元之间相互作用的动态过程（例如 Thy1-CFP小鼠）的神经元和血管系统（通过静脉注射荧光染料标记）可在疾病进展过程中利用活体双光子显微镜进行观察。
能够在脑部环境损伤最小的情况下以显微分辨率对肿瘤进行成像，这代表了当前胶质母细胞瘤动物模型的改进，将有助于神经肿瘤学领域及药物测试的发展。

手术操作完成后（图1），可通过荧光显微镜对动物进行数周的观察，直至处死。术后可能会出现炎症反应，但通常在一至两周内消失。可通过多种显微镜技术观察肿瘤生长情况，包括荧光大体成像和双光子显微镜成像（图2）。此处展示的示例图像分别在荧光大体成像系统和双光子显微镜上获得；该双光子显微镜耦合了飞秒脉冲红外可调谐激光器，并经过自主改装，可将动物置于20倍水浸物镜（1.0NA）下方进行成像。
通过结合斜射照明以实现明场反射成像和落射荧光发射的荧光宏观成像系统，随时间评估肿瘤的发育情况（图2A-2C）。对荧光信号进行阈值处理可轻松获取肿瘤区域，而浅表血管则在可见光图像的白色背景下呈现为暗色结构而被识别。另一方面，活体双光子显微镜可实现大视野的z轴层析成像及正交重建，具有亚细胞分辨率（参见 图2D 中的树突结构）。利用在特定细胞中表达荧光蛋白的转基因动物（例如Thy1-CFP小鼠，其神经元表达青色荧光蛋白，在 图2D 中以绿色伪彩显...

我们建立了小鼠皮层原位胶质母细胞瘤模型，用于活体双光子显微镜观察，该模型可重现肿瘤生长过程中通常存在的生物物理约束条件。通过以慢性玻璃窗替代肿瘤上方的颅骨，可利用双光子显微镜对肿瘤进展进行长期动态追踪。

多形性胶质母细胞瘤（GBM）是目前尚无治愈性疗法的最具侵袭性的脑肿瘤类型。  
该病理的鼠源模型……

本实验的总体目标是建立一种适用于小鼠大脑皮层活体光学成像的原位胶质母细胞瘤模型。首先在顶叶皮层上方制作颅窗，以实现该目标。接下来的步骤是将胶质母细胞瘤S类球状肿瘤植入脑组织表层。实质组织随后会封闭给药装置并堵塞注射。追踪作用力对实质内肿瘤发育的影响，并维持生物物理约束。最后一步是将玻璃窗紧密地封接在脑表面，以防止瘢痕组织形成，从而在成像过程中确保最佳清晰度。最终，通过活体双光子显微镜技术，该方法可在单细胞分辨率下展示胶质母细胞瘤的肿瘤进展、血管重塑以及细胞微环境。我们最初萌生这一方法的想法，是在尝试将自身悬浮的类固醇细胞在无物理屏障的条件下进行移植，以避免细胞逃逸，但结果主要导致了非生理性的、类似体外的额外生长。该方法有助于解答神经肿瘤学领域中的关键问题，例如血管重塑的作用以及在胶质母细胞瘤进展过程中细胞相互作用的调控效应。为了植入激素，首先在气体麻醉室中对小鼠进行轻度镇静，然后通过腹腔注射氯胺酮与赛拉嗪使其完全麻醉。手术应在温度为26摄氏度的温暖环境中进行，并使用可控加热垫保持小鼠体温。涂抹眼膏并剃除头皮毛发后，将小鼠固定于立体定位仪中，使用耳杆和咬合器确保其体位正确。用3%肥皂和10%碘溶液清洁皮肤。现在使用剪刀在头皮中部纵向做一个一厘米长的切口。用手术刀片切开并去除顶骨上方的皮肤，轻轻去除颅骨上方的骨膜。在骨面上充分涂抹氰基丙烯酸盐，以形成粗糙表面，便于后续水泥粘附。现在，在手术显微镜下使用手术刀片，计划在距离颅骨缝至少一毫米的位置钻开顶骨，以避免出血；在钻孔过程中逐步去除一侧大脑半球上方的顶骨。钻孔时应添加大量含青霉素和链霉素的冰冻 PBS，以防止过热。每隔约一分钟可用镊子和湿纱布清除骨碎片，待钻孔完成后，将所有骨碎片彻底清除。接下来，在颅骨开窗的边缘处进行操作，此处将密封玻璃窗。钻孔至骨片仅轻微附着，最后用镊子缓慢凿下骨片。最终，窗口应尽可能贴近大量脑组织。窗框制备完成后，使用经无水乙醇清洁的5 mm圆形玻璃盖玻片进行测试。如有需要，继续凿削，直至在轻轻按压盖玻片时脑组织被压平。然后再次清洁盖玻片并置于一旁，以打开硬脑膜。使用26号针头在颅骨开窗的中心位置打孔，注意避开主要血管，切勿损伤脑实质。用PBS轻轻清洗硬脑膜，随后在制备s脑类球体时，用湿润的纸巾覆盖保护。该操作需要预先准备好 S 类球体注射系统和一个培养皿。首先从培养皿中吸取一个与毛细管内径相匹配的圆形类固醇。类固醇应携带约五微升的培养基，并依靠自身重力沉降至毛细管的尖端。移除用于覆盖颅骨开窗的湿润滤纸，将动物置于注射系统下。降低注射移液管，直至其接触硬脑膜上的开孔处，再继续下降 250 微米，并等待 30 秒。使用微量注射器的活塞缓慢注射类固醇，每次注射两到三微升，同时用一小片纸巾吸去多余的液体。等待30秒，然后轻轻将注射移液管上提50微米。再等待30秒后，再次上提50微米。重复此模式，

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来源：Clark, A.J., 等. 胶质母细胞瘤免疫活性动物模型的生物发光成像。J. Vis. Exp.

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