Name: 生发中心的高度已解决活体条纹照明显微镜 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-09T21:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: 学习使用多焦点双光子显微镜进行高分辨率活体成像技术，通过条纹照明模式观察小鼠淋巴结生发中心内的免疫系统动态行为。该方法显著提升了成像深度与分辨率。

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我们感谢 R. Heintzmann 在条纹照明方法开发过程中富有成效的讨论，感谢 K. Rajewsky 和 A. Haberman 提供 C57BL/6 B1-8 GFP 转基因小鼠。我们感谢德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft）通过项目 NI1167/3-1（资助 R.N.）、HA5354/4-1 以及 SFB633 项目 A15（资助 A.E.H.），以及夏里特医学院（Charité）通过 Rahel-Hirsch 奖学金项目（资助 R.N.）提供的经费支持。我们特别感谢 JIMI 网络在富有成效的讨论和基础设施支持方面所给予的帮助。

条纹照明TPLSM的多光束设置
此处使用的装置是一种专用的多光束双光子激光扫描显微镜，如先前所述6,20。该系统如图1所示。该方法也可应用于其他能够将相机采集与振镜扫描镜运动同步的双光子激光扫描显微镜，即使这些显微镜仅具备单光束扫描能力。在这种情况下，其缺点是采集速度较低，但与基于标准光电倍增管（PMT）的双光子激光扫描显微镜（TPLSM）的采集速度相似。为了在最低光漂白和光损伤的前提下，实现最快采集速度，并在分辨率和对比度方面达到最佳质量，建议考虑以下装置调节步骤：
<ol>
	<li>检查钛宝石激光器的激光功率：在100%功率下进行检测，与出厂原始值及先前自行记录的读数进行比较；若需使用700–1,000 nm范围内的激发波长，则按当前状态直接使用。</li>
	<li>测试钛宝石激光束分光器的遥控指示功能， 即 检查0%和100%设置。若在100%时仍有Ti:Sa光束残留，则检查并重置步进电机的零位。Ti:Sa光束分束器由一个低阶λ/2波片和一个偏振器组成，可将偏振方向相互垂直的激光束分至相互垂直的光路：一束导入显微镜用于激发，另一束用于泵浦光参量振荡器（OPO）。通过自动旋转λ/2波片，可连续调节Ti:Sa和OPO的输出功率。</li>
	<li>调节OPO至所需波长，并测量输出功率。&#160;如果功率过低（使用800 nm波长的4 W Ti:Sa激光器时，应在约1,050–1,100 nm范围内获得0.8–1 W的OPO输出光束），应优化泵浦波长，并检查反射镜和扇形晶体的设置。选择制造商推荐的最佳参数值（通常以图表或曲线形式提供），然后对其进行微调，直至OPO在目标输出波长下实现共振且输出功率提升。
	<ol type="i">
		<li>如果功率仍然较低，使用四个可触及的镜片调节旋钮，缓慢地、以微小幅度交替调节OPO的前端和末端两个可触及的镜片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>检查钛宝石激光器和/或光参量振荡器光束是否准确地照射在入口镜的中心位置。
	<ol type="i">
		<li>使用一张白色纸张（不要过于光亮或反光！）和红外观察仪来观察OPO光束以及波长更长的Ti:Sa光束。
		<ol type="i">
			<li>操作近红外钛蓝宝石激光束时（通常对一般人而言，720–750 nm 以下波长可见），须佩戴防护护目镜。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将激光功率在准直过程中调至尽可能低，以最大限度降低潜在的眼部损伤风险。</li>
		<li>始终保持房间的环境光线开启，以使瞳孔处于收缩状态。</li>
		<li>请注意，激光功率是通过由半波片（λ/2 plate）和偏振器组成的衰减器进行精细调控的，但在钛宝石（Ti:Sa）激光束进入扫描头时，这些衰减元件尚未起作用！</li>
	</ol>
	</li>
	<li>检查钛宝石激光器和/或OPO激光束是否准确击中入口处的振镜；如果未对准，则调节激光束进入扫描头之前的最后两面反射镜。
	<ol type="i">
		<li>使用红外观察仪和一小片白色（但不 shiny/reflective！）纸张。</li>
		<li>始终关闭显微镜入口处的光圈，以便更精确地判断激光束的位置。&#160;重要提示：在进入第6步之前，切勿忘记重新打开光圈！</li>
	</ol>
	</li>
	<li>相应调整反射激光束的光路进入显微镜。&#160;对小段区域进行操作，并执行迭代式光束扫描。
	<ol type="i">
		<li>如果物镜出射的光强不足，请检查整个光路。</li>
		<li>每次在系统长时间闲置后首次使用、进行重大维修、更换任何光学元件，或怀疑输出存在问题时，均应检查光路。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>确保所有有源光学表面清洁，尤其是无灰尘！如果表面覆盖有一层灰尘，波前在进入物镜之前就会发生畸变，导致最终的激光束无法提供样品的清晰图像！
	<ol type="i">
		<li>必要时，用折叠的镜头纸蘸取乙醇或异丙醇擦拭镜面。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>检查光路设置完成后，光束是否返回到位于棱镜型脉冲压缩器末端、入口反射镜正上方的反射镜。此后，光束被反射进入光束合束器（BM）。</li>
	<li>检查激光束是否照射到位于光束多路复用器入口处、λ/2波片正前方的光阑，调整激光束的偏振方向，以满足多路复用器（BM）对宽波段50%透射和50%反射的要求。
	<ol type="i">
		<li>首先，关闭光阑以便更精确地判断光束位置，并在两个光阑之间进行光束校准。 即 一个位于显微镜入口处，另一个位于BM入口处。对于其他单光束扫描显微镜，光阑应位于xy扫描器的入口处。</li>
		<li>如果光束未对准缩小后的光阑中心，请调节位于BM入口光阑前的上述反射镜。重要提示：在进行步骤10之前，务必重新打开光阑。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>重新打开光圈后，检查激光束是否照射在体镜（BM）反射镜的中点位置。使用窄条纸片，以免遮挡体镜复杂光路的其他部分！</li>
	<li>检查光束是否击中出口镜的中心：平行偏振光对应上方镜面 &#34;P&#34;，用于垂直偏振光的底部反射镜 &#34;S&#34;若未对准，则在双色镜前调整入口镜。</li>
	<li>检查是否 &#34;S&#34; 和 &#34;P&#34; 偏振光束使多组光进入偏振分光立方体，并在进入xy扫描镜前适当地重叠。若使用单光束扫描显微镜，则跳过这些步骤。</li>
	<li>检查激光光束是否穿过扫描镜和管镜的中心，并通过物镜后焦面的中央。重要提示：此步骤必须在激光光束处于中心位置时进行。&#160;位置，而非停车位置！
	<ol type="i">
		<li>更换物镜，安装瞄准工具（&#34;靶心&#34;）并检查激光束是否击中目标中心，以及照明是否均匀。</li>
		<li>如果情况如此，需在背镜（BM）前关闭光圈，并检查是否出现中心为黑色圆斑（干涉极小）的圆形干涉图样。
		<ol type="i">
			<li>如果入口镜相对于中心位置发生显著偏移，则进行调整&#160;靶心</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>现在用物镜替换靶心， 例如 20倍&#160;水浸物镜
	<ol type="i">
		<li>用一张白纸检查输出的光场。光场应明亮、均匀且位于中心位置。</li>
		<li>测量输出功率：在100% OPO和100%泵浦Ti:Sa（4 W）条件下，经过透镜后在1,100 nm处（本实验所用显微镜系统）应获得约100–150 mW的输出功率。若激光功率低于此范围，则不足以支持多光束SI-TPLSM实验。对于单光束扫描SI-TPLSM，5–10 mW的功率即可满足需求。激光束必须保持在中心位置，不得进行扫描！</li>
	</ol>
	</li>
	<li>若进行磁珠-扫描仪-双光子激光扫描显微（MB-SI-TPLSM），请按如下步骤调整BM中的镜面：
	<ol type="i">
		<li>放置一个均匀荧光的样品， 例如 一张红色荧光载玻片置于载物台上，将激光束聚焦于样品内部但靠近上表面处（即 靠近物镜前端。</li>
		<li>将显微镜设置为多光束模式，并选择光束数量（初始时建议仅选择一束光）以及偏振方向。 例如 &#34;P&#34;.
		<ol>
			<li>通过成像荧光玻片找到激光束：设置 &#34;P&#34; 打开快门，并在聚焦光束的同时持续运行CCD相机。</li>
			<li>确保光束处于中心位置，且扫描器已关闭。务必确保光束未被扫描！</li>
			<li>通过在中心附近寻找一个亮点来定位光束&#160;相机芯片的</li>
			<li>将光束聚焦至光斑最亮且最清晰的位置， 即 显微镜的成像平面对应于相机芯片的位置；降低激光功率，使光斑不饱和。在系统对准良好的情况下，这意味着在单光束模式下工作时，激光功率需接近最低值（约0.6 mW的激光功率即可满足要求）。</li>
			<li>如果光斑明显偏离中心，可通过调整BM前方的镜片（或单光束扫描系统的扫描仪镜片）将其移近中心。</li>
			<li>当同时对准另一种偏振方向时， 即 &#34;S&#34; 光束，现在切换到双光束模式，打开 &#34;S&#34; 快门并检查光束位置（若仅开启 &#34;S&#34; 快门打开。</li>
			<li>完成后，切换至4光束模式并使用 &#34;P&#34; 偏振模式（&#34;P&#34; 快门打开。此时将出现两束光束。</li>
			<li>将两束光束精确调整至与相机视野底边完全平行，并使其间距为2.8 µm。
			<ol type="i">
				<li>如果未正确对齐，则调整BM的第一个镜片。</li>
				<li>切勿调节中央螺丝，而应使用两个外周螺丝移动镜片，直至两束光相距2.8 um且完全水平排列。</li>
			</ol>
			</li>
			<li>现在切换到8束模式 &#34;P&#34; 偏振，并调节第二个BM镜（同样无红点）直至4个光束间距相等，为2.8 um，且与图像底边平行排列。</li>
			<li>在16束和32束模式下重复操作，分别调整第三和第四分束镜。各子光束之间保持等距至关重要，因为结构光照明显微成像（SI）算法（最简单的为最小-最大（HiLo）算法）正是基于这一假设。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将均匀荧光样品替换为具有非均匀结构的样品， 例如 经交叉染色的铃兰根。
	<ol type="i">
		<li>前往激发光束的停放位置，该位置通常设置在扫描仪坐标值较大的区域。 例如 (10,000; 10,000).</li>
		<li>使用CCD相机扫描（多束）图像。检查图像是否清晰、均匀且无畸变。</li>
		<li>如果图像显示为旋转状态，请调整相机：用手轻轻扭转相机本体，绕垂直轴进行轴向旋转，直至图像恢复正常方向。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>启动xy扫描器以控制扫描过程，生成激发模式， 即 条纹图像。
	<ol type="i">
		<li>在多光束扫描的情况下，移动 y 轴扫描镜， 即垂直于光束线，以形成方形条纹图像。</li>
		<li>如果按照步骤17.1所述生成的视野过小，可通过移动x轴扫描镜至某一位置，使微束线长度加倍且所有微束沿整条线等距分布，从而扩展扫描程序。在移动x轴扫描镜后，重复y轴扫描镜的完全相同运动，以生成更大的条纹图像。</li>
		<li>在单光束扫描的情况下，按照研究者定义的等距位置，反复交替进行y轴扫描镜和x轴扫描镜的运动，以生成所需的条纹图像。</li>
		<li>确保在控制y轴扫描镜运动时使用恒定速度指令（降低加速度/减速度），而在控制x轴扫描镜时使用最高速度指令（最大加速度/减速度）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用相机（场探测器）自动采集并保存条纹图像。因此，需将相机与扫描仪同步，并将扫描仪作为主触发源。</li>
	<li>通过将x轴扫描镜移动至不同位置，重复采集条纹图像（扫描方案见方案17），具体步骤如下：
	<ol type="i">
		<li>选择足够的重复步数以及连续条纹图像之间的适当步长，以覆盖两个相邻光束之间的距离（本例中为 2.8 µm，扫描镜每一步为 25 nm）；建议允许少量重叠。 即 额外的0.3-0.4 µm。</li>
		<li>将x方向位移设置为与给定波长下横向分辨率极限相匹配的值。例如，在此系统中，每次x扫描镜移动采用10步，进行12或13次位移，可同时获得最佳的轴向和横向分辨率。通过结构化样品载玻片进行验证。 例如 铃兰根部切片，需根据所用系统确定最佳编号。</li>
		<li>优化这两个值，直到铃兰图像变得最清晰：&#160; 使用计算得到的SI图像上的线轮廓工具，并比较线轮廓的宽度（即铃兰细胞壁的荧光信号）。</li>
		<li>采集每幅与扫描仪移动同步的条带图像，并分别保存。 例如 为 TIFF 或二进制文件。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>打开一组完整的条纹图像作为矩阵， 即 三维矩阵，在评估程序中使用最小-最大算法或傅里叶变换算法生成高分辨率SI图像的二维矩阵。这些算法此前已有详细描述20.</li>
</ol>
小鼠免疫及活体成像前准备
动物实验已获得相应的州级动物福利委员会（LAGeSo，柏林卫生与社会事务局）批准，并依照现行指南和规定进行（动物实验许可证 G0153/08）。
<ol start="21">
	<li>按照先前所述方法诱导腘窝淋巴结的生发中心反应并制备成像区域4。通过免疫磁珠法从B1-8+/+ Jκ-/-小鼠及B1-8+/+ Jκ-/- GFP+小鼠的脾脏中纯化B细胞。</li>
	<li>通过静脉注射将3 × 106个NP特异性B细胞注入C57Bl/6受体小鼠，B细胞纯度需&#62;95%，其中⅛为B1-8+/+ Jκ-/- GFP+，⅞为非荧光标记的B1-8+/+ Jκ-/- B细胞。</li>
	<li>细胞转移后一天，用10 µg NP-CGG（硝基苯基-鸡ɣ球蛋白）与完全弗氏佐剂（CFA）乳化后注射至小鼠右后足垫进行免疫。</li>
	<li>使用ATTO590-琥珀酰亚胺酯对抗CD21/CD35抗体的Fab片段进行标记。
	<ol type="i">
		<li>为在活体中突出显示生发中心内滤泡树突状细胞（FDC）的网络结构&#160;in vivo，在进行活体分析前12–24小时，将10 µg荧光染料标记的Fab片段注入小鼠右后足垫。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
在进行活体成像前，应对腘窝淋巴结进行如下准备（免疫后第8-10天）：
<ol start="25">
	<li>根据小鼠体重，通过腹腔注射氯胺酮/赛拉嗪对其进行麻醉。</li>
	<li>检测反射以在整个成像期间监测麻醉深度。</li>
	<li>彻底剃除小鼠腿部、背部和右侧 flank 区域的毛发，并使用脱毛膏完全清除残留毛发。</li>
	<li>固定右侧大转子：用手指定位骨性突起，用剪刀做一小切口，直至出现一小块白色三角形筋膜。</li>
	<li>用固定器的尖头镊子夹住该筋膜下方的骨性突起。</li>
	<li>使用有齿镊子固定腰部区域的脊柱。</li>
	<li>将右后肢固定在固定器上，并拧紧螺丝。</li>
	<li>用胶带固定尾巴，以保持肢体处于正确位置。</li>
	<li>在大腿尾侧，于明显可见的腘静脉进入组织的区域做皮肤切口，用钝头镊子分离皮肤与下方组织，并沿腘静脉从近端向远端进行暴露。</li>
	<li>用钝头镊子暴露淋巴结，尽量避免切割，以保护细小的淋巴管（暴露过程中保持淋巴结处于 PBS 中）。</li>
	<li>在淋巴结周围涂一圈真空脂，形成凹槽后注入 PBS。</li>
	<li>将盖玻片放置到位，并安放温度探头（保持温度为 37 °C，否则细胞运动速度将发生显著变化）。</li>
	<li>沿盖玻片上缘再涂一圈真空脂。</li>
	<li>将加热线圈放置在真空脂上，以类似方式形成密封，并在玻璃盖玻片上加水/PBS，以便物镜浸入。</li>
	<li>成像结束后，继续维持小鼠麻醉状态，逐步增加氯胺酮/赛拉嗪剂量至致死量，随后实施颈椎脱臼处死。</li>
</ol>

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</ol>

Volker Andresen 是德国比勒费尔德 LaVision Biotec GmbH 公司的股东。其他作者均无&#160;利益冲突。

活体光学成像的目标是动态且功能性地可视化细胞运动及其相互作用，以理解健康和疾病状态下组织与器官的功能5。实现这一目标的最强大技术是多光子激光扫描显微镜，但该技术仍需克服与波前畸变、散射、采集速度慢、光漂白和光损伤相关的局限性，这些因素限制了其空间分辨率、对比度以及时间分辨率。
在深层组织成像中，有两种成功的方法可实现更优的激发（和发射）光子管理，从而获得更高的空间分辨率、增强的对比度（由于信号增强，信噪比提高），并因此减少光漂白和光损伤：自适应光学方法以及使用更长的激发波长——可调谐红外激发6。在过去十年中，自适应光学的波前校正概念已从天文学领域转移到生物光学成像，也应用于多光子显微技术。早期用于双光子显微镜的自适应光学方法依赖于波前传感，并需要一个亚衍射参考源，即 类似于天文学中的&#34;导星&#34;；而当前的系统更适用于深层组织成像12。例如，它们利用激发光的相干门控进行波前传感13,15，或完全不依赖外部波前传感，而是基于瞳孔分割后的图像互相关17</sup...

双光子激光扫描显微技术（TPLSM）凭借其利用红外超短脉冲激发实现深层组织成像的优势1，通过揭示活体动物中不同细胞亚群的运动性与相互作用模式，彻底改变了我们对单细胞水平生命过程的认知2-5。然而，现有技术仍不足以阐明器官功能及其障碍的机制，而这些机制正是开发新型治疗策略的前提，因为该技术仅能提供有关健康与疾病状态下组织内细胞反应分子基础的有限信息。目前的技术仅能实现数百微米范围的空间成像窗口，这是由于散射和波前畸变效应会降低空间分辨率和信噪比6，在成年动物高度致密的组织中，这些效应尤为显著。组织中折射率的高度异质性和各向异性分布是导致散射和波前畸变的根本原因，这首先会导致三维空间分辨率随深度增加而逐渐下降，最终导致源自弹道激发光子的信号完全丧失，即信噪比的丧失。在生物科学与生物医学的深层组织应用中，这意味着现有技术无法明确揭示细胞间的通信：分辨率不足可能导致假阳性相互作用的判断，而信噪比下降则会使系统遗漏微弱结构之间的某些真实相互作用。
为了以动态方式明确检测细胞间的相互作用，需要在组织深层实现更高精度的空间分辨率。目前所采用的先进纳米显微技术基于特殊的数值算法， 例如 结构光照明显微技术，在第一激发态耗尽的情况下， 例如 STED、RESOLFT 或单分子定位 例如 dSTORM、PALM 已在固定细胞以及活细胞培养中得到广泛应用7然而，为了将这些应用拓展到组织切片、活体组织和生物体，我们仍需克服严重的 技术难题。双光子激发STED技术已得到应用，该技术采用不同波长，或采用同一波长（sw2PE-STED）分别用于激发和受激发射，以提高脑切片中的横向分辨率8 或在含有嵌入细胞的人工基质中9分别在与标准双光子激光扫描显微镜相同的轴向分辨率下，利用单光子受激发射损耗显微技术，可在活体 Thy1 EGFP 小鼠大脑皮层表面（深度达 10–15 µm）以 67 nm 的分辨率对树突棘的动态进行成像10多功能结构化照明显微镜为发育生物学提供了一种多功能工具，可实现两倍提升的二维分辨率。然而，该技术仅适用于光散射程度较低的生物体，例如斑马鱼胚胎。11然而，这些技术均无法应用于成年动物高度散射的组织中，而这类组织在数百微米尺度上是研究出生后发病疾病的生物医学与临床研究的关键模型。
无论采用何种近似方法来计算衍射极限下的波前形状， 即 点扩散函数（PSF）在通过透镜聚焦后，其沿光轴方向的宽度（轴向分辨率）至少是垂直于光轴方向的PSF宽度（横向分辨率）的三倍12不同阶次的泽尼克系数所量化的波前畸变会显著改变深部组织成像中聚焦电磁波的波前形状，导致点扩散函数（PSF）明显增大，尤其是在光轴方向上13-15因此，衍射定律和波前畸变效应均表明，光学轴向的分辨率是深层组织成像中的限制因素。虽然纳米显微技术主要致力于克服衍射极限，但在活体高分辨率成像中，需要一种能够同时克服衍射和波前畸变效应、从而提高轴向分辨率和对比度的技术。理想情况下，该技术还应具备足够快的成像速度，以实现对细胞动态过程的实时监测。
在过去的十年中，利用自适应光学技术在双光子激光扫描显微镜（TPLSM）中实时校正点扩散函数（PSF）像差和对比度损失的方法已被广泛研究并得到显著改进13,14,16-18，因此目前这是实现 ballistic 激发光子更优管理的最佳选择14。然而，由于自适应光学中大多数波前校正方法是迭代式的，并且由于组织中折射率高度不均，需针对微小区域（几个 10 × 10 µm2）重复校正，导致成像速度远低于观察细胞运动与细胞间通讯所需的速度。此外，经自适应光学改进的双光子激光扫描显微镜在物理上仍受限于衍射极限。
空间照明调制（SPIN）和探测端的时间调制（SPADE）在理论上已被提出可用于激光扫描显微镜以提高分辨率。然而，这些技术在活体成像中的实际应用仍有待验证19。
综上所述，迫切需要开发新技术，以提高对活体成年动物深层组织成像的空间分辨率。在本研究中，我们通过控制多光束条纹照明多光子激光扫描显微镜（MB-SI-MPLSM）中的扫描过程，实现了激发模式的空间调制。20与结构化照明显微技术中对激发光束截面进行空间调制的方法不同，我们仅利用扫描过程来实现激发光的空间调制。通过将激发光扩展至更长的波长，我们能够在高散射组织的深层组织中同时提高空间分辨率和信噪比。例如 淋巴结，自由散射路径 47 µm6），与我们检测的光学非线性信号无关 例如 荧光、二次谐波产生或其他频率混合现象。利用该方法在激发波长高达900 nm的条件下，我们能够动态成像小鼠淋巴结生发中心中少数分子尺度的细胞蛋白质结构。因此，可在次级淋巴器官免疫应答过程中，更清晰地可视化滤泡树突状细胞表面携带抗原的单位与B细胞在探查抗原时的相互作用。

<table><tbody><tr><td>ATTO590 &amp;ndash; 用于偶联的 NSH</td><td>ATTO Tec，德国</td><td>AD-590-35</td><td></td></tr><tr><td>CD21/35 &amp;ndash; Fab片段 &amp;ndash; ATTO590</td><td>柏林DRFZ</td><td></td><td>偶联反应在本机构的中心实验室进行。</td></tr><tr><td>B1-8 Jk&lt;sup&gt;-/-&lt;/sup&gt; EGFP&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt;</td><td>Prof. Anne Habermann，耶鲁大学，加利福尼亚州，美国</td><td></td><td>也可在杰克逊实验室（JAX）获取。</td></tr><tr><td>EasySep 小鼠B细胞负向筛选富集&amp;nbsp;</td><td>StemCell Technologies，德国</td><td>19854</td><td></td></tr><tr><td>聚苯乙烯微珠（605），0.2 &amp;micro;m</td><td>德国赛默飞世尔科技公司</td><td>F8803</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;仪器设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TriMScope I</td><td>德国比勒费尔德，LaVision Biotex公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OPO（手动版本）</td><td>APE，德国柏林</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ti:Sa 激光器 Chameleon Ultra II</td><td>Coherent，德国杜伊斯堡</td><td></td><td></td></tr><tr><td>水浸物镜，20倍，数值孔径0.95，红外，工作距离2 mm</td><td>Olympus 德国，汉堡，德国</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

高分辨率活体条纹照明显微成像技术观察生发中心

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

通过活体深层组织多光子显微镜监测细胞间通讯，是理解健康与疾病状态下厚组织样本及器官内免疫细胞命运的关键。通过控制多光子显微镜的扫描模式并应用适当的数值算法，我们开发了一种条纹照明方法，该方法使轴向分辨率提高了3倍，并改善了信噪比。 即 相比之下，在淋巴器官等高散射组织中，成像深度超过100 µm，优于标准的多光子显微镜。该技术的采集速度以及光漂白和光损伤效应与基于标准光电倍增管的技术相似，但由于使用了场效应探测器，成像深度略低。通过采用条纹照明方法，我们能够观察到次级滤泡树突状细胞上免疫复合物沉积的动态过程——其分辨率可达生发中心中少数几个蛋白质分子水平。

淋巴结中的空间分辨率
有效点扩散函数（ePSF）的尺寸对应于显微镜的空间分辨率12我们通过多光子扫描显微镜（MB-SI-TPLSM）获取淋巴结中胶原纤维的二次谐波信号，测量了这一三维函数，并与传统的双光子激光扫描显微技术进行了比较。 即 场检测TPLSM（通过CCD相机）和点检测TPLSM（通过PMTs）。
从这些测量结果可以看出，在样品表面，横向和轴向分辨率均与衍射理论预测的预期值相符20。然而，随着成像深度的增加，激发光和发射光穿过折射率差异较大的介质的光程也随之增加，导致空间分辨率显著下降，且该现象与所采用的系统设置无关（图2）。与传统的双光子激光扫描显微技术相比，采用多焦点结构光照明显微双光子激光扫描显微技术（MB-SI-TPLSM）可在任意成像深度下实现约20%更优的横向分辨率和220%更优的轴向分辨率。
生发中心内滤泡树突状细胞上免疫复合物的动态变化
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通过空间调制多焦点双光子显微镜的激发模式，可在成年小鼠淋巴结中实现高达120 µm深度的高分辨率活体成像，并增强对比度。在100 µm深度处，测得的分辨率为487 nm（横向）和551 nm（轴向），从而克服了散射和衍射极限。

通过活体深层组织多光子显微镜监测细胞间通讯是理解免疫细胞在厚组织内命运的关键……

本实验的总体目标是准备一台标准的双光子显微镜，用于高分辨率的活体成像。首先需要对显微镜进行校准，包括调节激光器。接着，校准光束多路复用器，以获得理想的光束形状和光束排列。对于多光束扫描，首先通过条纹照明模式扫描样品以获取原始图像。最后，应用算法计算出高分辨率的最终图像。最终，条纹照明显微技术被用于揭示小鼠淋巴结生发中心内免疫系统行为的细节，这些细节此前无法通过活体显微镜观察到。与结构化照明或定位显微镜等现有方法相比，该技术的主要优势在于其能够在活体样本的深层组织中应用。它无需对激光束形状进行任何修改，从而使得该方法极为简单，并易于在任何多光子显微镜上实现。本文展示的多光束双光子条纹照明显微镜装置，可在最低光漂白程度和最快成像速度下，实现最佳的分辨率和对比度质量。请根据文本方案中所述内容对装置进行调整。完成调整后，检查光束是否返回至位于棱镜基脉冲压缩器末端、入射镜正上方的反射镜。从此处设置好光路后，光束将被反射进入光束多路复用器。若进行多光束条纹照明，请关闭扫描器，使用多光子显微镜。通过将均匀荧光样品放置在载物台上，并将激光束聚焦于样品内部但靠近顶部表面（接近物镜前端透镜处），来调整光束多路复用器中的反射镜。将显微镜设置为多光束模式，并选择光束数量和偏振方向。例如，使用P偏振光通过成像荧光样品来定位激光光束时，打开P偏振光快门，并在聚焦光束的同时持续运行CCD相机，确保光束位于中心位置。在对准P偏振光光束时，切换至64光束模式并打开相应的快门。检查光束的位置。调节第一至第五个光束多路复用镜，确保各光束光斑间距相等。由于条纹照明算法基于此假设，需将均匀荧光样品替换为具有非均匀结构的样品。例如，采集葱白区域的根部样本并扫描多束光图像。检查图像是否清晰、均匀且平直。将非均质样本替换为均质样本。启动XY扫描器以控制扫描过程。生成条纹状激发图像模式，用于多光束扫描。移动Y轴扫描镜，使其垂直于光束照射的直线方向。通过移动此处称为块偏移的 X 扫描镜，重复生成由块数指示的图案，以产生矩形条纹图像。将异质样品重新放置，并使用扫描仪作为主触发器。将相机与扫描仪同步，以自动获取并保存条纹图像，从而重复获取条纹图像。通过在此处选择足够的重复步数、位移次数以及适当的步长，将X扫描镜移动到不同位置。在两张连续的条纹图像之间设置位移步长，以覆盖两个相邻光束宽度之间的距离。将X方向的位移设置为小于给定激发波长下横向分辨率极限的值。例如，X轴扫描镜每次移动使用10步，并进行12或13次移位，可获得最佳空间分辨率。通过调整这两个数值，观察卷积区域图像，直至其达到最清晰的状态。在常规CCD图像和计算得到的条纹照明图像上使用线轮廓工具进行分析。比较本示例中线条轮廓的宽度，即来自共焦细胞壁的荧光信号。在扫描仪移动过程中同步采集每幅原始条带图像，并将其单独保存，例如保存为TIFF或二进制文件。为生成高分辨率条带照明图像的二维矩阵，在评估程序中将一组完整的原始条带图像作为矩阵打开。采用最小最大算法或基于傅里叶变换的算法（如前所述详细方法），在深层组织中实现条纹照明、多光束、多光子显微成像。在活体生物中，随时间获取不同组织深度的条纹图像，并按前述方法进行分析，以生成生发中心、B细胞与滤泡树突状细胞之间动态相互作用的高分辨率三维影像。有效点扩散函数的尺寸对应显微镜的空间分辨率。我们通过获取小鼠淋巴结中胶原纤维的二次谐波信号或发射波长为515纳米的100纳米聚苯乙烯微球的荧光信号，测量了这一三维函数。将我们的多光束条纹照明三光子层析显微镜（T-P-L-S-M）与现有的双光子激光扫描显微技术进行比较，后者包括基于CCD相机的面探测T-P-L-S-M和点探测T-P-L-S-M。从这些测量结果可以看出，在样品表面，横向和轴向分辨率均与衍射理论预测的预期值相符。然而，随着成像深度的增加，激发光和发射光穿过折射率高度不均的介质的光程也随之增加，导致空间分辨率显著下降，这一现象与所使用的装置无关。采用M-B-S-I-T-P-L-S-M技术，无论成像深度如何，我们实现了约20%更优的横向分辨率和220%更优的轴向分辨率，相较于标准的T-P-L-S-M方法。成年小鼠次级淋巴器官在免疫应答过程中B细胞的克隆选择，是其分化为记忆B细胞或浆细胞的第一步。在此过程中，生发中心内滤泡树突状细胞与B细胞在免疫复合物结构水平上的高度动态相互作用被认为发挥着核心作用。只有借助高分辨率的活体显微成像技术，才能解析这种细胞间通讯及其对免疫应答的影响，此处通过抗CD21/35 FAB ATO590标记滤泡树突状细胞来实现可视化。M-B-S-I-T-P-L-S-M 首次实现了在活体状态下对淋巴结生发中心内免疫复合物沉积簇的尺寸进行可视化和定量分析，深度可达120微米。这些图像展示了传统基于PMT技术与M-B-S-I-T-P-L-S-M技术所获取的生发中心内免疫复合物沉积的三维荧光图像的直接对比。此外，免疫复合物沉积与生发中心B细胞之间的相互作用 now 可以被高分辨率地解析，并可结合活体功能探针，用于增殖、分化或凋亡等过程的联合研究。在尝试该操作时，需要注意的是，基于相机检测的技术其采集速度大约比标准的光电倍增管多光子显微镜高出八倍，而最大成像深度则大约低25%。观看本视频后，您应能够充分理解如何设置多光子显微镜以配合条纹照明方法使用，包括调整显微镜光路、校准光束光栅、计算扫描参数，以及最终高分辨率图像的计算方法。适用于活体深层组织实验。

highly-resolved-intravital-striped-illumination-microscopy-germinal

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

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Neisseria meningitidis 与人类α-肌动蛋白结合蛋白的细胞内相互作用的共聚焦成像可视化与定量分析

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本方案描述了生成具有自发性自身免疫生发中心的混合型小鼠骨髓嵌合体的方法，其中自身反应性淋巴细胞携带一种光激活型绿色荧光蛋白（PA-GFP）报告基因。该系统能够将组织中细胞的定位与后续的分子及功能分析相联系。...

通过光激活在混合嵌合型自身免疫模型中探究单个自身反应性生发中心

我们介绍了一种利用倒置旋转盘共聚焦显微镜对小鼠小肠进行活体成像，以观察表达GFP标记的γδ上皮内淋巴细胞（γδ...

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共聚焦与超分辨率成像技术揭示基底膜蛋白极化性细胞内运输及分泌过程 黑腹果蝇 卵子发生

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