高分辨率活体条纹照明显微成像技术观察生发中心

本实验的总体目标是准备一台标准的双光子显微镜，用于高分辨率的活体成像。首先需要对显微镜进行校准，包括调节激光器。接着，校准光束多路复用器，以获得理想的光束形状和光束排列。

对于多光束扫描，首先通过条纹照明模式扫描样品以获取原始图像。最后，应用算法计算出高分辨率的最终图像。最终，条纹照明显微技术被用于揭示小鼠淋巴结生发中心内免疫系统行为的细节，这些细节此前无法通过活体显微镜观察到。

与结构化照明或定位显微镜等现有方法相比，该技术的主要优势在于其能够在活体样本的深层组织中应用。它无需对激光束形状进行任何修改，从而使得该方法极为简单，并易于在任何多光子显微镜上实现。本文展示的多光束双光子条纹照明显微镜装置，可在最低光漂白程度和最快成像速度下，实现最佳的分辨率和对比度质量。

请根据文本方案中所述内容对装置进行调整。完成调整后，检查光束是否返回至位于棱镜基脉冲压缩器末端、入射镜正上方的反射镜。从此处设置好光路后，光束将被反射进入光束多路复用器。

若进行多光束条纹照明，请关闭扫描器，使用多光子显微镜。通过将均匀荧光样品放置在载物台上，并将激光束聚焦于样品内部但靠近顶部表面（接近物镜前端透镜处），来调整光束多路复用器中的反射镜。

将显微镜设置为多光束模式，并选择光束数量和偏振方向。例如，使用P偏振光通过成像荧光样品来定位激光光束时，打开P偏振光快门，并在聚焦光束的同时持续运行CCD相机，确保光束位于中心位置。在对准P偏振光光束时，切换至64光束模式并打开相应的快门。

检查光束的位置。调节第一至第五个光束多路复用镜，确保各光束光斑间距相等。由于条纹照明算法基于此假设，需将均匀荧光样品替换为具有非均匀结构的样品。

例如，采集葱白区域的根部样本并扫描多束光图像。检查图像是否清晰、均匀且平直。将非均质样本替换为均质样本。

启动XY扫描器以控制扫描过程。生成条纹状激发图像模式，用于多光束扫描。移动Y轴扫描镜，使其垂直于光束照射的直线方向。

通过移动此处称为块偏移的 X 扫描镜，重复生成由块数指示的图案，以产生矩形条纹图像。将异质样品重新放置，并使用扫描仪作为主触发器。将相机与扫描仪同步，以自动获取并保存条纹图像，从而重复获取条纹图像。

通过在此处选择足够的重复步数、位移次数以及适当的步长，将X扫描镜移动到不同位置。在两张连续的条纹图像之间设置位移步长，以覆盖两个相邻光束宽度之间的距离。将X方向的位移设置为小于给定激发波长下横向分辨率极限的值。

例如，X轴扫描镜每次移动使用10步，并进行12或13次移位，可获得最佳空间分辨率。通过调整这两个数值，观察卷积区域图像，直至其达到最清晰的状态。在常规CCD图像和计算得到的条纹照明图像上使用线轮廓工具进行分析。

比较本示例中线条轮廓的宽度，即来自共焦细胞壁的荧光信号。在扫描仪移动过程中同步采集每幅原始条带图像，并将其单独保存，例如保存为TIFF或二进制文件。为生成高分辨率条带照明图像的二维矩阵，在评估程序中将一组完整的原始条带图像作为矩阵打开。

采用最小最大算法或基于傅里叶变换的算法（如前所述详细方法），在深层组织中实现条纹照明、多光束、多光子显微成像。在活体生物中，随时间获取不同组织深度的条纹图像，并按前述方法进行分析，以生成生发中心、B细胞与滤泡树突状细胞之间动态相互作用的高分辨率三维影像。有效点扩散函数的尺寸对应显微镜的空间分辨率。

我们通过获取小鼠淋巴结中胶原纤维的二次谐波信号或发射波长为515纳米的100纳米聚苯乙烯微球的荧光信号，测量了这一三维函数。将我们的多光束条纹照明三光子层析显微镜（T-P-L-S-M）与现有的双光子激光扫描显微技术进行比较，后者包括基于CCD相机的面探测T-P-L-S-M和点探测T-P-L-S-M。从这些测量结果可以看出，在样品表面，横向和轴向分辨率均与衍射理论预测的预期值相符。

然而，随着成像深度的增加，激发光和发射光穿过折射率高度不均的介质的光程也随之增加，导致空间分辨率显著下降，这一现象与所使用的装置无关。采用M-B-S-I-T-P-L-S-M技术，无论成像深度如何，我们实现了约20%更优的横向分辨率和220%更优的轴向分辨率，相较于标准的T-P-L-S-M方法。

成年小鼠次级淋巴器官在免疫应答过程中B细胞的克隆选择，是其分化为记忆B细胞或浆细胞的第一步。在此过程中，生发中心内滤泡树突状细胞与B细胞在免疫复合物结构水平上的高度动态相互作用被认为发挥着核心作用。只有借助高分辨率的活体显微成像技术，才能解析这种细胞间通讯及其对免疫应答的影响，此处通过抗CD21/35 FAB ATO590标记滤泡树突状细胞来实现可视化。

M-B-S-I-T-P-L-S-M 首次实现了在活体状态下对淋巴结生发中心内免疫复合物沉积簇的尺寸进行可视化和定量分析，深度可达120微米。这些图像展示了传统基于PMT技术与M-B-S-I-T-P-L-S-M技术所获取的生发中心内免疫复合物沉积的三维荧光图像的直接对比。此外，免疫复合物沉积与生发中心B细胞之间的相互作用 now 可以被高分辨率地解析，并可结合活体功能探针，用于增殖、分化或凋亡等过程的联合研究。

在尝试该操作时，需要注意的是，基于相机检测的技术其采集速度大约比标准的光电倍增管多光子显微镜高出八倍，而最大成像深度则大约低25%。观看本视频后，您应能够充分理解如何设置多光子显微镜以配合条纹照明方法使用，包括调整显微镜光路、校准光束光栅、计算扫描参数，以及最终高分辨率图像的计算方法。适用于活体深层组织实验。