超声成像引导下心内注射建立小鼠乳腺癌脑转移模型及后续纵向磁共振成像

本实验的总体目标是利用超声引导建立乳腺癌脑转移小鼠模型，并通过磁共振成像（MRI）对其进行监测。该目标通过收集具有脑趋向性的乳腺癌细胞并将其注射至左心室来实现。在超声引导的辅助下，可对颅内肿瘤的形成与发展进行实时监测。

通过 MRI 和苏木精-伊红染色确认转移灶。最终，影像引导下的精确注射可显著提高对乳腺癌脑转移监测、形成及发展的成功率。纵向 MRI 能够实现对乳腺癌形成与发展过程的无创监测。

本实验方案中所有动物操作均经德克萨斯大学西南医学中心机构动物护理与使用委员会批准。准备好在含10% FBS、1%谷氨酰胺和1%青霉素的DMEM培养基中培养的M-D-A-M-B-2-31-B-R-G-F-P细胞。始终监测细胞状态，并每两至三天更换一次培养基。当细胞达到80%融合度时，使用胰蛋白酶消化并收集细胞。

首先，用真空移液器彻底移除旧的培养基。然后加入 5 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）轻柔地洗涤细胞，直至所有细胞均被 PBS 覆盖。随后移除洗涤液。

接着，向培养皿中加入 1.5 毫升胰蛋白酶。轻轻倾斜培养皿，确保所有细胞均被胰蛋白酶覆盖。将培养皿放回 37 摄氏度的细胞培养箱中。

等待一分钟，在显微镜下观察细胞。若细胞呈圆形并漂浮，说明已脱落。加入三毫升培养基以终止消化，并用移液器将细胞混合液转移至离心管中。

将混合物在1,160 G条件下离心五分钟。然后使用真空移液器小心去除上清液。接着，用移液器将细胞轻轻重悬于五毫升无血清培养基中，直至观察不到明显的细胞沉淀，且溶液呈现均匀状态，细胞悬液以50微升为一份。

充分混匀后，加入50微升台盼蓝。取10微升等分试样加入多个细胞计数板中。然后根据细胞计数仪的数值进行细胞计数。

计算并使用所有计数的平均值。现在制备更精确的细胞悬液。再次离心，并将细胞重悬于不含血清的培养基中，浓度为每100微升含175,000个细胞。

然后将细胞置于冰上保存，以用于心内注射。本实验方案使用6至8周龄的雌性BC裸鼠。登录成像系统并初始化探头。

7 0 4，频率为 40 兆赫兹。启动一项新研究，并根据提示填写相关信息。接着，对小鼠进行麻醉，并通过鼻罩给予麻醉剂。

进行引导注射时，将成像台的温度设置为 37 摄氏度，并将小鼠以仰卧位固定在台面上。成像前将超声耦合剂保持在 37 摄氏度，并涂抹于小鼠胸部。随后将换能器安装至支架上，并将其下降至所需的成像深度。

接下来，移动载物台，直至以升主动脉为标志识别出左心室，并将载物台固定在视野最清晰的位置。现在，用带有22号针头的1毫升注射器吸取100微升冷藏的细胞混合液。将装有液体的注射器固定到注射器支架上。

然后将注射器向胸部移动。在进入小鼠体内之前，仔细左右移动，直到针尖进入成像视野。调整针头的高度和角度以对准左心室，当位置合适后，迅速将针头穿过皮肤和肌肉层插入左心室。

在超声图像的引导下，成功插入左心室的标志是鲜红色的动脉血反流进入注射器。随后缓慢注射细胞混合物，注射完成后拔出针头，抬起探头，并用湿润的纱布清洁超声耦合剂。然后解除动物的固定胶带，将其转移至配有预热垫的清洁笼中。

观察小鼠直至其完全恢复，之后几天内每天检查一次。使用78平方微米的普通分辨率，可在直径310微米处识别出MRI高信号病灶。由于本研究中的转移灶非常小，且坏死和水肿程度轻微，T2加权图像上的高信号病灶真实反映了肿瘤组织。

大规模纵向 MRI 研究可实现对肿瘤生长的活体无创评估。高分辨率 MRI 能够在第四周经心内注射后三周检测到多个微小病灶；在第四周扫描中观察到的所有病灶均较前增大。在T2加权图像上出现了更多新病灶。

苏木精和伊红染色显示弥漫性转移病灶，或苏木精和伊红染色显示簇状转移病灶。肿瘤周围常可见扩张的血管，提示发生了非出芽型血管生成。观看本视频后，您应充分了解如何在超声成像引导下将针头注射至小鼠心脏的左心室。