Name: 超声成像引导下腔内注射到患乳腺癌脑转移其次是纵向的MRI的小鼠模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-06T13:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: 学习超声引导下心内注射MDA-MB231/Br-GFP细胞建立乳腺癌脑转移小鼠模型，并通过9.4 T高分辨率MRI进行纵向监测肿瘤发展。该方法为研究脑转移机制提供了可靠的实验工具。

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我们感谢美国国家癌症研究所（NCI）的Diane Palmieri博士和Patricia Steeg博士为我们提供了MDA-MB231Br细胞。感谢Ralph Mason博士、Jason Reneau先生和Ramona Lopes女士在技术上和合作方面给予的支持。本研究部分得到了美国国防部（DOD）IDEA项目资助（编号：W81XWH-08-1-0583 和 W81XWH-12-1-0317）。磁共振成像实验在先进影像研究中心（Advanced Imaging Research Center）完成，该中心为美国国立卫生研究院（NIH）生物技术研究资源项目（BTRP）资助的设施（项目编号：P41-RR02584）；超声引导下心脏内注射实验使用VisualSonics Vevo 770系统完成，项目编号为1S10RR02564801。

所有动物实验程序均经德克萨斯大学西南医学中心机构动物护理和使用委员会批准。
1. MDA-MB231/Br-GFP 细胞的制备
<ol>
	<li>取出并培养MDA-MB231/Br-GFP细胞（由美国国家癌症研究所NCl的Palmieri博士和Steeg博士惠赠），使用含10%胎牛血清（FBS）、1%谷氨酰胺和1%青霉素/链霉素的DMEM培养基。</li>
	<li>观察细胞状态及培养基颜色，每2–3天更换一次培养基。</li>
	<li>当细胞融合度达到80%时，按以下步骤1.3.1–1.3.5进行胰酶消化并收集细胞：
	<ol>
		<li>完全移除旧培养基，加入5 ml PBS（1×）轻柔洗涤细胞，随后从培养皿中移除PBS。</li>
		<li>向培养皿中加入1.5 ml胰酶溶液，轻轻倾斜培养皿以确保所有细胞均被胰酶覆盖。将培养皿放回细胞培养箱，在37 °C条件下孵育1分钟。</li>
		<li>从培养箱中取出培养皿，在光学显微镜下观察细胞，确认细胞已从培养皿表面脱落。</li>
		<li>加入3 ml培养基以终止胰酶作用。将细胞悬液收集至离心管中，在2,000 rpm&#160;条件下离心5分钟。</li>
		<li>小心移除上清液，将细胞沉淀重悬于5 ml无血清培养基中，直至混匀。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>计数适量细胞，并将其重悬于无血清DMEM培养基中，最终浓度为每100 µl含1.75 × 105个细胞。
	<ol>
		<li>取50 µl细胞悬液，加入50 µl台盼蓝染液。混匀后取10 µl混合液，小心滴加至细胞计数板。使用多个样本以确保细胞数量估算准确。</li>
		<li>将细胞计数板一端先插入细胞计数仪，仪器将自动开始计数。取所有计数结果的平均值，计算总细胞数。</li>
		<li>再次离心细胞，并将其重悬于适量无血清培养基中，使最终浓度达到每100 µl含1.75 × 105个细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在进行心内注射前，将细胞置于冰上保存。</li>
</ol>
2. 超声成像引导下的心内注射
<ol>
	<li>使用6至8周龄的雌性裸鼠（BALB/c nu/nu）。</li>
	<li>登录成像系统。初始化换能器 704（40 MHz）。</li>
	<li>开始一项新研究并填写相关信息。</li>
	<li>麻醉（3% 异氟烷/100% 氧气）2 在诱导室中使用异氟烷（2%）和100%氧气维持动物麻醉2 (1 立方分米3/min）通过鼻罩在整个过程中持续给予。&#160;当捏压脚趾未观察到回缩反射时，表明麻醉已生效。</li>
	<li>将成像台温度设置为 37 °C。将麻醉后的小鼠仰卧位固定于加热的成像台上。</li>
	<li>将超声耦合剂在成像前保持在 37 °C。将耦合剂涂抹于小鼠胸部。</li>
	<li>将换能器安装在支架中。降低换能器，直至达到所需的成像深度。移动载物台，直至以升主动脉为标志识别出左心室（图1A当清晰观察到左心室时，锁定图像。</li>
	<li>用22 G针头的1 ml注射器吸取100 µl细胞混合液。将注射器安装并固定在注射器支架上。</li>
	<li>将注射器向前移动至小鼠胸部，并小心地左右移动，直至针尖进入成像视野（进入小鼠之前）。</li>
	<li>调整针头高度和角度，使其对准左心室方向。</li>
	<li>在超声成像引导下，迅速将注射器针头穿过皮肤和肌肉层，经肋间穿刺进入左心室。 
	成功将针插入左心室的一个迹象是新鲜动脉血（呈粉红色，与暗红色的静脉血相对）反流入注射器</li>
	<li>缓慢注射细胞混合物（图1B).</li>
	<li>操作完成后，拔出针头，抬起探头，用浸湿的纱布擦去超声耦合剂，并移除胶带。</li>
	<li>准备一个干净的笼子，并放置预热好的垫板。</li>
	<li>将动物放置于垫子上，并观察直至其完全恢复。</li>
	<li>每24小时监测一次动物行为，持续两天。</li>
	<li>实验小鼠的一般状况及神经系统并发症体征需进行常规监测。</li>
</ol>
3. 脑内肿瘤发育的磁共振成像监测
<ol>
	<li>使用9.4特斯拉磁体监测脑转移瘤的颅内发展。</li>
	<li>在肿瘤植入后两周开始进行磁共振成像（MRI），之后每周重复一次，持续三周。</li>
	<li>使用3%异氟烷对动物进行镇静，并以1.5%异氟烷维持全身麻醉状态。</li>
	<li>在整个实验过程中持续监测并保持动物的体温和呼吸稳定。</li>
	<li>高分辨率多层扫描（14层，每层1&#160;毫米&#160;厚，无间隙1- 和 T2-加权冠状位图像，覆盖从额叶到后颅窝的区域，采用以下参数获取：T1加权图像：自旋回波多层扫描（SEMS），TR/TE = 400 msec/20 msec，矩阵：256 × 256，视野：20 × 20 mm，面内分辨率：78 × 78 µm2. T2加权图像：快速自旋回波多层（FSEMS）序列，TR/TE = 2500 msec/48 msec，8 个回波链，矩阵：256 × 256，视野 20 × 20 mm，平面内分辨率：78 × 78 µm&#160;28,9. 
	肿瘤病灶在T加权像上比正常脑组织更亮2加权图像</li>
	<li>肿瘤大小通过T加权成像确定2通过使用我们编写的 MATLAB 程序，在每幅图像上手动勾画病灶强化部分，获得加权图像8. 
	由于大多数肿瘤直径小于层厚（1 mm），因此肿瘤大小以平面面积表示，而非体积。</li>
</ol>
4. H&amp;E 染色证实转移灶
<ol>
	<li>在最后一次磁共振扫描后立即处死小鼠，解剖带有肿瘤的脑组织，并将其包埋于O.C.T.介质中，在-80 °C下冷冻保存。</li>
	<li>使用冷冻切片机对脑组织进行连续冠状切片，厚度为10 µm。</li>
	<li>对脑切片进行苏木精和伊红（H&E）染色。</li>
</ol>

<ol><li>Schouten, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+of+brain+metastases+in+a+cohort+of+patients+with+carcinoma+of+the+breast%2C+colon%2C+kidney%2C+and+lung+and+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Incidence of brain metastases in a cohort of patients with carcinoma of the breast, colon, kidney, and lung and melanoma.</a> Cancer. 94, 2698-2705 (2002).</li>
<li>Lin, N. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CNS+metastases+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">CNS metastases in breast cancer.</a> J. Clin. Oncol. 22, 3608-3617 (2004).</li>
<li>Eichler, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+brain+metastases-translation+to+new+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">The biology of brain metastases-translation to new therapies.</a> Nat. Rev. Clin. Oncol. , (2011).</li>
<li>Lockman, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneous+blood-tumor+barrier+permeability+determines+drug+efficacy+in+experimental+brain+metastases+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Heterogeneous blood-tumor barrier permeability determines drug efficacy in experimental brain metastases of breast cancer.</a> Clin. Cancer Res. 16, 5664-5678 (2010).</li>
<li>Yoneda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bone-seeking+clone+exhibits+different+biological+properties+from+the+MDA-MB-231+parental+human+breast+cancer+cells+and+a+brain-seeking+clone+in+vivo+and+in%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">A bone-seeking clone exhibits different biological properties from the MDA-MB-231 parental human breast cancer cells and a brain-seeking clone in vivo and in.</a> 16, 1486-1495 (2001).</li>
<li>Palmieri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Her-2+overexpression+increases+the+metastatic+outgrowth+of+breast+cancer+cells+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Her-2 overexpression increases the metastatic outgrowth of breast cancer cells in the brain.</a> Cancer Res. 67, 4190-4198 (2007).</li>
<li>Percy, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+characterization+of+changing+blood-tumor+barrier+permeability+in+a+mouse+model+of+breast+cancer+metastasis%3A+a+complementary+magnetic+resonance+imaging+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Radiol%22%5BJournal%5D)">In vivo characterization of changing blood-tumor barrier permeability in a mouse model of breast cancer metastasis: a complementary magnetic resonance imaging approach.</a> Invest. Radiol. 46, 718-725 (2011).</li>
<li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+MRI+evaluation+of+intracranial+development+and+vascular+characteristics+of+breast+cancer+brain+metastases+in+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Longitudinal MRI evaluation of intracranial development and vascular characteristics of breast cancer brain metastases in a mouse model.</a> PLoS One. 8, (2013).</li>
<li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+near-infrared+optical+imaging+of+2-deoxyglucose+uptake+by+intracranial+glioma+of+athymic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Dynamic near-infrared optical imaging of 2-deoxyglucose uptake by intracranial glioma of athymic mice.</a> PLoS One. 4, (2009).</li>
<li>Zhang, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+permeability+of+the+blood-brain+barrier+in+experimental+brain+metastases+produced+by+human+neoplasms+implanted+into+nude+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Differential permeability of the blood-brain barrier in experimental brain metastases produced by human neoplasms implanted into nude mice.</a> Am. J. Pathol. 141, 1115-1124 (1992).</li>
<li>Mason, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+oximetry%3A+comparison+of+19F+MR+EPI+and+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Exp.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Tumor oximetry: comparison of 19F MR EPI and electrodes.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 530, 19-27 (2003).</li>
<li>Gril, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pazopanib+reveals+a+role+for+tumor+cell+B-Raf+in+the+prevention+of+HER2%2B+breast+cancer+brain+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Pazopanib reveals a role for tumor cell B-Raf in the prevention of HER2+ breast cancer brain metastasis.</a> Clin. Cancer Res. 17, 142-153 (2010).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

在本研究中，我们已证明，超声成像引导下的左心室注射可确保准确性，使得本研究中每只动物均成功形成脑转移灶，且未观察到动物死亡。&#160;图像引导注射的优势在于，可在影像下实时监测并调整穿刺针穿透皮肤并最终进入左心室的路径，这与依赖严格解剖标志的手动操作方法截然不同。
目前对脑转移瘤颅内发育过程的认识在很大程度上依赖于对动物模型的组织学研究4,10。然而，组织学研究通常需要在肿瘤植入后的不同时间点处死大量小鼠。更重要的是，组织学研究无法提供关于单个病灶时间动态发展的信息。
体内成像具有更高的效率，因为每只动物均可作为自身的对照，并可连续观察多个时间点7,11。高分辨率T2加权图像能够在极早期检测到多灶性肿瘤的发生（可观察到直径小至310 µm的病灶）。纵向MRI可对单个脑转移病灶进行随时间推移的观察。此外，体内无创MRI在治疗反应的纵向研究中尤其有价值，例如&#160;全脑放疗。
<p class="j...

脑转移是成人最常见的颅内恶性肿瘤。即使采取积极治疗，预后仍然极差，中位生存期仅为4至6个月。乳腺癌是三种脑转移高发的主要原发性肿瘤之一1-3。已有多种嗜神经性乳腺癌细胞系被证实可在心内或颈动脉注射后形成脑转移灶4。将肿瘤细胞直接注射至左心室可绕过肺毛细血管床，从而提高脑转移的发生率，同时减少内脏转移的发生。&#160;MDA-MB231Br细胞系是目前在啮齿类动物模型中用于建立脑转移研究应用最广泛的乳腺癌细胞系之一5,6。
与其他许多研究4,7类似，我们在先前的研究中采用了手动方式进行心内注射。然而，手动注射的成功率仅为50%，且若前期操作失败，部分小鼠会因反复侵入性操作而死亡。在此，我们介绍一种影像引导技术，用于将趋向脑部的乳腺癌细胞准确注入裸鼠的左心室。通过纵向高分辨率磁共振成像（MRI）追踪脑转移瘤的颅内发展过程。

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>HyClone</td><td>SH30022.01</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Mediatech</td><td>25-051-C1</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>自动细胞计数仪</td><td>BioRad</td><td>TC10</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Baxter International Inc.</td><td>1001936060</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>VisualSonics Vevo 770 高分辨率成像系统&amp;nbsp;</td><td>Visual Sonics Inc.</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>配备 Varian INOVA Unity 系统的 9.4 T 水平腔磁体&amp;nbsp;</td><td>Agilent</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>O.C.T. 包埋剂</td><td>Sakura Finetek USA</td><td>4583</td><td>&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

超声成像引导下心内注射建立小鼠乳腺癌脑转移模型及后续纵向磁共振成像

Ultrasound Imaging-guided Intracardiac Injection to Develop a Mouse Model of Breast Cancer Brain Metastases Followed by Longitudinal MRI

乳腺癌脑转移在Ⅳ期乳腺癌患者中的发生率为30%，与高死亡率相关，中位生存期仅为6个月。建立合适的动物模型以模拟临床情况下转移细胞的血流动力学扩散过程至关重要。本文介绍采用小动物超声成像技术，引导将脑嗜性乳腺癌细胞准确注射至裸鼠左心室的方法。通过纵向磁共振成像（MRI）评估颅内脑转移灶的起始与生长情况。与既往人工操作相比，超声引导下心内注射不仅可确保注射的准确性，从而提高实验成功率，还显著降低了动物死亡率。体内高分辨率MRI可在注射后3周的T2加权图像上检测到直径小至310 µm的高信号多灶性病灶。后续MRI显示颅内肿瘤持续生长，转移灶数量增加，并分布于全脑。

利用MRI的高空间分辨率（平面内分辨率为78 µm），可识别直径小至310 µm的高信号病灶（图2）。由于本研究中的转移灶非常小，且坏死和水肿的形成极轻微，T2加权图像上的高信号病灶真实反映了肿瘤组织本身。
纵向 MRI 研究可对肿瘤生长进行体内无创评估。如图3所示，高分辨率 MRI 在心内注射后3周即可检测到多个微小病灶（图3A）。第4周时，此前扫描中发现的病灶均有所增大；在T2-加权图像上还出现了更多新病灶（图3B）。
H&amp;E 染色显示弥散型或簇状转移病灶（图 4）。肿瘤周围常可见扩张的血管，提示非出芽型血管生成（图 4D）。
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="always...

采用超声成像引导下将MDA-MB231/Br-GFP细胞经心内注射，建立乳腺癌脑转移小鼠模型。通过高分辨率9.4 T磁共振成像对多灶性颅内转移灶的发展进行纵向监测。

乳腺癌脑转移在Ⅳ期乳腺癌患者中发生率为30%，与高死亡率相关。中位生存期仅为6……

本实验的总体目标是利用超声引导建立乳腺癌脑转移小鼠模型，并通过磁共振成像（MRI）对其进行监测。该目标通过收集具有脑趋向性的乳腺癌细胞并将其注射至左心室来实现。在超声引导的辅助下，可对颅内肿瘤的形成与发展进行实时监测。通过 MRI 和苏木精-伊红染色确认转移灶。最终，影像引导下的精确注射可显著提高对乳腺癌脑转移监测、形成及发展的成功率。纵向 MRI 能够实现对乳腺癌形成与发展过程的无创监测。本实验方案中所有动物操作均经德克萨斯大学西南医学中心机构动物护理与使用委员会批准。准备好在含10% FBS、1%谷氨酰胺和1%青霉素的DMEM培养基中培养的M-D-A-M-B-2-31-B-R-G-F-P细胞。始终监测细胞状态，并每两至三天更换一次培养基。当细胞达到80%融合度时，使用胰蛋白酶消化并收集细胞。首先，用真空移液器彻底移除旧的培养基。然后加入 5 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）轻柔地洗涤细胞，直至所有细胞均被 PBS 覆盖。随后移除洗涤液。接着，向培养皿中加入 1.5 毫升胰蛋白酶。轻轻倾斜培养皿，确保所有细胞均被胰蛋白酶覆盖。将培养皿放回 37 摄氏度的细胞培养箱中。等待一分钟，在显微镜下观察细胞。若细胞呈圆形并漂浮，说明已脱落。加入三毫升培养基以终止消化，并用移液器将细胞混合液转移至离心管中。将混合物在1,160 G条件下离心五分钟。然后使用真空移液器小心去除上清液。接着，用移液器将细胞轻轻重悬于五毫升无血清培养基中，直至观察不到明显的细胞沉淀，且溶液呈现均匀状态，细胞悬液以50微升为一份。充分混匀后，加入50微升台盼蓝。取10微升等分试样加入多个细胞计数板中。然后根据细胞计数仪的数值进行细胞计数。计算并使用所有计数的平均值。现在制备更精确的细胞悬液。再次离心，并将细胞重悬于不含血清的培养基中，浓度为每100微升含175,000个细胞。然后将细胞置于冰上保存，以用于心内注射。本实验方案使用6至8周龄的雌性BC裸鼠。登录成像系统并初始化探头。7 0 4，频率为 40 兆赫兹。启动一项新研究，并根据提示填写相关信息。接着，对小鼠进行麻醉，并通过鼻罩给予麻醉剂。进行引导注射时，将成像台的温度设置为 37 摄氏度，并将小鼠以仰卧位固定在台面上。成像前将超声耦合剂保持在 37 摄氏度，并涂抹于小鼠胸部。随后将换能器安装至支架上，并将其下降至所需的成像深度。接下来，移动载物台，直至以升主动脉为标志识别出左心室，并将载物台固定在视野最清晰的位置。现在，用带有22号针头的1毫升注射器吸取100微升冷藏的细胞混合液。将装有液体的注射器固定到注射器支架上。然后将注射器向胸部移动。在进入小鼠体内之前，仔细左右移动，直到针尖进入成像视野。调整针头的高度和角度以对准左心室，当位置合适后，迅速将针头穿过皮肤和肌肉层插入左心室。在超声图像的引导下，成功插入左心室的标志是鲜红色的动脉血反流

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