Name: 最快在西镇:对经典蛋白质印迹分析现代风味 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-05T18:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 43 s
Description: 学习优化蛋白质印迹技术以提高分辨率、灵敏度和准确性。本方案采用Bis-Tris凝胶系统和红外荧光成像，可在35分钟内完成电泳，7分钟内完成转膜，实现双抗原同时检测，大幅缩短实验时间并获得更精确的定性与定量数据。

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我们感谢McMahon实验室的所有成员提供的帮助与支持。&#160;本研究获得了美国国立卫生研究院/国家癌症研究所R01 CA176839-01（MM获得）以及机构研究与学术职业发展奖（IRACDA，JS获得）的资助。&#160;

1. 来自细胞培养的全细胞裂解液的制备
<ol>
	<li>将细胞培养皿置于冰上，加入含 5 mM EDTA 的冷 PBS例如 5 ml PBS 含 5 mM EDTA/10 cm2 培养皿）。使用细胞刮刀从培养皿上刮下贴壁细胞，然后将细胞悬液转移至预冷的15 ml锥形管中。</li>
	<li>在4 °C条件下，以1,000 rpm（230 × g）低速离心5 min，使细胞悬液沉淀。将锥形管置于冰上，小心吸除上清液，避免扰动沉淀。</li>
	<li>用含有 5 mM EDTA 的 1 ml PBS 洗涤沉淀，将细胞悬液转移至预冷的 1.5 ml 离心管中。在 13,000 rpm（13,226 × g）下短暂离心 10 秒以沉淀细胞。小心吸除上清液，避免扰动沉淀，将离心管置于冰上。</li>
	<li>将沉淀重悬于25-200 μl（根据沉淀物大小而定）； 即 3 × 10³6 细胞中加入约 150 μl 含蛋白酶和磷酸酶抑制剂（新鲜添加，终浓度为 2 倍）的 RIPA 裂解缓冲液（50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 10 mM NaF, 0.1% SDS, 0.5% 脱氧胆酸钠, 1% NP-40）。短暂涡旋振荡各管，并孵育裂解悬液&#160;在冰上孵育20-30分钟。注意：有多种裂解缓冲液可用于蛋白提取，它们在溶解蛋白的能力以及变性去垢剂的强度方面有所不同。即 SDS、Triton X-100 或 NP-40）。RIPA 裂解液适用于制备全细胞裂解物并破坏蛋白质-蛋白质相互作用。</li>
	<li>为制备去核上清组分，将裂解液在14,000 rpm（15,339 × g）条件下离心5分钟&#160;在4 °C下，将上清液转移至新管中，注意不要扰动富含细胞核的沉淀，并将离心管置于冰上。注意：在吸取上清液时，富含细胞核的沉淀可能从管壁脱落。为避免收集到富含细胞核的沉淀，可将移液器吸头直接插入黏稠的富含细胞核的沉淀中，用移液器将其吸出并弃去。</li>
	<li>根据制造商的说明，使用BCA或Bradford等蛋白质定量检测方法测定每个样品的蛋白质浓度。</li>
</ol>
2. 样品制备与电泳
<ol>
	<li>根据下表所示准备每个样品。作为替代方案，也可使用终浓度为 2.5% 的 β-巯基乙醇。然而，还原剂应在上样前不超过一小时内加入各样品中。总体积已考虑移液过程中的体积差异，每孔仅上样 20 μl 制备好的样品。
	<table border="1">
		<tbody>
			<tr>
				<td>试剂</td>
				<td>还原样品</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>蛋白样品</td>
				<td>X μl</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>4x LDS 样品缓冲液</td>
				<td>6 μl</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>500 nM DTT 还原剂</td>
				<td>2.4 μl</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>去离子水</td>
				<td>加至 15.6 μl</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>总体积</td>
				<td>24 μl</td>
			</tr>
		</tbody>
	</table>
	</li>
	<li>将样品在 70 °C 加热 10 分钟。在样品加热的同时，配制 1,000 ml 的 1x MES 或 MOPS 电泳缓冲液（50 ml 20x MES 或 MOPS 电泳缓冲液加 950 ml 去离子水）。MOPS 电泳缓冲液适用于分离分子量在 14–200 kDa 范围内的中等大小蛋白，而 MES 电泳缓冲液因具有较低的 pKa，可更有效地分离分子量在 2–200 kDa 范围内的较小蛋白，并且其电泳速度比 MOPS 缓冲液更快4。因此，这两种缓冲液对浓缩胶中离子迁移的影响不同，从而导致蛋白条带分离效果的差异4。另取 200 ml 1x MES 或 MOPS 电泳缓冲液与 500 μl 抗氧化剂混合，用于填充 Mini-Cell 电泳装置的上层缓冲液室。</li>
	<li>样品加热完成后，短暂离心后立即置于冰上。</li>
	<li>按照制造商说明，将预制的 Bis-Tris 凝胶组装至 Mini-Cell 电泳装置中。注意：确保每块凝胶的方向正确，即每块凝胶较短（较小）的一侧朝内面向缓冲液核心，并且凝胶应保持水平并紧密贴合缓冲液核心，以防止上层缓冲液室发生泄漏。</li>
	<li>用含抗氧化剂的 200 ml 1x MES 或 MOPS 电泳缓冲液填充上层缓冲液室，下层缓冲液室则加入约 600 ml 的 1x MES 或 MOPS 电泳缓冲液。多余的 200–300 ml 电泳缓冲液可保存以备后续使用。但不建议回收电泳过程中使用过的缓冲液，因为其 pH 值和质量可能已发生变化。</li>
	<li>向每个加样孔中加入 20 μl 蛋白样品。若计划将膜切割成多个条带以检测多种抗体（即 多于两种），强烈建议在每块凝胶的第一孔和最后一孔中各加入 2–5 μl 预染蛋白标准品，以便作为切割膜时的参考标记，从而在不影响蛋白条带成像的前提下准确分离膜的不同区域。</li>
	<li>以 200 V 恒压电泳 35 分钟，初始电流预计为每块凝胶 110–125 mA，结束时电流降至每块凝胶 70–80 mA。当示踪染料迁移至缓冲液核心的铂丝处时，电泳完成。</li>
</ol>
3. 使用iBlot干转印系统进行蛋白质转移
<ol>
	<li>通过折断胶板夹的粘合边缘将小型凝胶完全分离（此操作可能产生噼啪声）。弃去较短（较小）的玻璃板，小心地将凝胶从较长（带槽）的玻璃板转移至盛有去离子水的容器中，并切除位于底部的厚脚部分。&#160;注意：极少数情况下，凝胶可能附着在较短的玻璃板上而非较长的带槽玻璃板上。&#160;此时应弃去较长的带槽玻璃板，并切除底部的厚脚部分。&#160;然后，小心地将凝胶从较短的玻璃板转移至去离子水中。</li>
	<li>根据制造商说明书组装阳极和阴极转膜夹心结构。注意：硝酸纤维素膜（nitrocellulose）和聚偏二氟乙烯膜（PVDF）均可实现高质量、高效率的蛋白质转膜，并适用于荧光检测8。然而，PVDF膜的结合容量（240 μg/cm3）高于硝酸纤维素膜（200 μg/cm3）8。</li>
	<li>仔细去除凝胶与膜之间夹带的气泡或空气，以防止转膜过程中蛋白质条带发生扭曲。注意：不要修剪膜或转膜夹心结构以适应凝胶尺寸，否则会导致阳极和阴极夹心结构直接接触。</li>
	<li>在干式转膜装置上正确组装转膜夹心结构后，选择合适的电压程序（即 程序3：20 V，7分钟），并开始转膜。注意：分子量大于150 kDa的蛋白质迁移较慢，可能需要8–10分钟的更长转膜时间。此外，转膜前将凝胶在20%乙醇中孵育5–10分钟，也有助于提高这些大分子蛋白质的转膜效率。转膜程序完成后，仪器将自动切断电流。建议立即取出膜并进行封闭处理，以确保更好的蛋白质检测效果，并避免膜干燥。</li>
</ol>
4. 红外荧光蛋白检测
<ol>
	<li>以每平方厘米至少0.8毫升的封闭液封闭膜2 使用 Odyssey 封闭缓冲液（勿添加 Tween-20）在 4 °C 下封闭 1 小时或过夜。也可使用脱脂奶粉封闭膜，但可能导致背景升高并干扰蛋白检测。</li>
	<li>在 Odyssey 封闭缓冲液（含 0.1% Tween-20）中，按所需浓度加入一抗，4 °C 过夜孵育膜。对于双色检测（在同一印迹膜上同时显示两种不同抗原），两种一抗必须来源于不同宿主物种，并同时加入至膜中。&#160;注意：在将膜与一抗孵育之前，可将膜切割成多个片段，以便用多种一抗进行检测即 同一膜上大于2个</li>
	<li>用含0.1% Tween-20的TBS缓冲液轻轻振荡洗涤膜3次，每次10分钟。</li>
	<li>将膜与荧光标记的二抗在含0.1% Tween-20的Odyssey封闭缓冲液中孵育，700 nm通道按1:20,000稀释，800 nm通道按1:6,000–1:10,000稀释，孵育时间为30–60分钟（孵育时间超过1小时可能会增加背景信号）。孵育过程中需避光。&#160;注意：二抗必须与各一抗的宿主物种相同，并标记不同的荧光染料。</li>
	<li>用含0.1% Tween-20的TBS缓冲液轻轻振荡洗涤膜3次，每次10分钟。避免光照。</li>
	<li>膜可干燥或保存于不含Tween-20的TBS或PBS中，4 °C避光保存，直至使用红外成像系统进行扫描和成像。若妥善避光，荧光信号可稳定维持数月。</li>
</ol>

<ol><li>Burnette, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blotting%3A+electrophoretic+transfer+of+proteins+from+sodium+dodecyl+sulfate--polyacrylamide+gels+to+unmodified+nitrocellulose+and+radiographic+detection+with+antibody+and+radioiodinated+protein+A%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Western blotting: electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A.</a> Anal. Biochem. 112, 195-203 (1981).</li>
<li>Renart, J., Reiser, J., Stark, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+proteins+from+gels+to+diazobenzyloxymethyl-paper+and+detection+with+antisera%3A+a+method+for+studying+antibody+specificity+and+antigen+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 3116-3120 (1979).</li>
<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 4350-4354 (1979).</li>
<li>NuPAGE Technical Guide. Life Technologies Corporation. IM-1001. 60, (2010).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li>
<li>Kubo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+incubation+of+solutions+of+proteins+containing+dodecyl+sulfate+on+the+cleavage+of+peptide+bonds+by+boiling%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Effect of incubation of solutions of proteins containing dodecyl sulfate on the cleavage of peptide bonds by boiling.</a> Anal. Biochem. 225, 351-353 (1995).</li>
<li>Moos, M., Nguyen, N. Y., Liu, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducible+high+yield+sequencing+of+proteins+electrophoretically+separated+and+transferred+to+an+inert+support%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Reproducible high yield sequencing of proteins electrophoretically separated and transferred to an inert support.</a> J. Biol. Chem. 263, 6005-6008 (1988).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iBlot+Dry+Blotting+System%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Technologies+Corporation%22%5BJournal%5D)">iBlot Dry Blotting System.</a> Life Technologies Corporation. 25-0911, 84 (2012).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+Blot+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22LI-COR+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Western Blot Analysis.</a> LI-COR Biosciences. 988-12622, (2012).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odyssey+Infrared+Imaging+System+Application+Software+Version+3.030%5BTitle%5D)+AND+%22LI-COR+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Odyssey Infrared Imaging System Application Software Version 3.030.</a> LI-COR Biosciences. , (2007).</li>
<li>Hambaeus, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Milk+Composition%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Nutr%22%5BJournal%5D)">Human Milk Composition.</a> Clin. Nutr. 54, 219-236 (1984).</li>
<li>DenHollander, N., Befus, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+antigens+from+immunoblotting+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Loss of antigens from immunoblotting membranes.</a> J. Immunol. Methods. 122, 129-135 (1989).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

根据本方案生成高质量、定量 Western 印迹的关键步骤如下：1）测定蛋白质浓度；2）样品制备；3）封闭膜；4）一抗的质量与性能。
测量总蛋白浓度的准确性会对蛋白条带的定量产生重大影响，因为红外荧光检测具有极高的灵敏度，会放大样品中蛋白浓度的任何微小差异。为了避免蛋白浓度测定中的偏差，建立标准曲线时应获得尽可能接近1的线性回归相关系数（R2≥0.99 或更高），这对于精确计算每个样品的蛋白浓度至关重要。例如，如果R2值低于0.99，可尝试使用超纯水新鲜配制BSA标准品，并仔细重复蛋白定量实验，以提高R2值。此外，应尽量避免使用多通道移液器，因其可能导致移液操作不一致，进而降低R2值，并影响样品蛋白浓度的准确性。
样品制备在决定蛋白条带质量方面起着重要作用，同时也可能直接影响这些条带的定量结果。使用 Bis-Tris 凝胶系统时，强烈建议使用 LDS 样品缓冲液制备样品，因为该缓冲液的弱碱性 pH 值（8.5）为二硫键的还原和蛋白变性提供了...

蛋白质印迹技术于1977年至1979年间首次开发，旨在建立一种利用抗体更有效地检测蛋白质的方法1-3。该方法通过将SDS-PAGE凝胶中的蛋白质电泳转移至膜上，再利用二抗结合靶蛋白，并通过放射自显影、紫外光或过氧化物酶反应产物进行检测3。因此，这些基本原理至今仍广泛应用于当前的蛋白质印迹实验方案中。然而，传统的蛋白质印迹技术存在诸多缺点，例如电泳运行时间较长、分辨率较低、出现人为假象的蛋白条带、易受蛋白质降解影响，以及灵敏度有限和数据质量较差等问题4。因此，本实验方案描述了对标准蛋白质印迹流程的重要改进与优化，可获得更为准确的定性和定量数据。
使用SDS-PAGE分离多种蛋白质的Laemmli体系是Western印迹法中最广泛使用的凝胶体系5。尽管该Western印迹体系应用广泛，但该方法可能导致条带扭曲、分辨率下降以及出现非特异性条带4。这可能是由于分离胶的高pH值（9.5）引起蛋白质的脱氨和烷基化、凝胶氧化还原状态变化导致还原的二硫键重新氧化，以及在Laemmli缓冲液（pH 5.2）中加热蛋白时发生天冬氨酰-脯氨酰肽键断裂所致4,6。Bis-Tris凝胶体系在中性pH值（7.0）下运行，相较于Laemmli体系具有显著优势。该体系可提高蛋白质稳定性，最大限度减少蛋白质修饰，保持蛋白质的还原状态，防止电泳过程中天冬氨酰-脯氨酰键的断裂，更重要的是，电泳运行时间仅为35分钟4,6,7。此外，Bis-Tris凝胶体系还能产生更清晰的条带、更高的分辨率和分离度，以及更高的灵敏度，从而获得更可靠的数据4。
结合 Bis-Tris 凝胶系统，iBlot 干式转印系统利用高电场强度和电流，可在 7 分钟内显著缩短蛋白质从凝胶转移到膜上的时间8。该转印系统基于干式转印方法，可实现更高效且可靠的蛋白质转移8。有关 iBlot 转印系统与传统转印系统效能的详细比较，请访问以下网站：<a href="http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Western-Blotting/Western-Blot-Transfer/iBlot-Dry-Blotting-System/iBlot-Dry-Blotting-Comparison-to-Semi-Dry-and-Wet.html">http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Western-Blotting/Western-Blot-Transfer/iBlot-Dry-Blotting-System/iBlot-Dry-Blotting-Comparison-to-Semi-Dry-and-Wet.html</a>。该系统采用阳极和阴极堆栈结构，其中包含含有适当转印缓冲液的凝胶基质，可作为离子储库8。在转印过程中，水电解有助于防止铜阳极产生氧气，从而实现更一致的蛋白质转印，避免条带变形8。此外，该转印系统还通过缩短电极间距离来提高转印速度8。
尽管化学发光是蛋白质印迹分析中最常见且传统的蛋白质检测技术，但双色红外荧光检测可显著提高蛋白质印迹数据的灵敏度、质量和准确性。该检测方法采用两种最佳波长（700 nm 和 800 nm）的红外激光激发，能够生成信噪比最高、灵敏度最高的清晰数据图像9。因此，可在同一张膜上利用 700 nm 和 800 nm 荧光检测通道同时可视化两种目标蛋白。更重要的是，红外荧光的线性关系和宽动态范围使得对强信号和弱信号蛋白条带均能进行精确的定量分析9。此外，与传统的蛋白质印迹技术相比，本实验方案具有显著优势和改进：在不降低电泳和转膜效率的前提下缩短了电泳和转膜时间，并采用红外荧光蛋白检测技术，获得了更高质量的定性和定量蛋白质印迹数据。

<table><tbody><tr><td>BCA 蛋白质检测试剂盒</td><td>Thermo Scientific/Pierce</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>4x NuPAGE LDS 样品缓冲液&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>10x NuPAGE 样品还原剂&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>NP0004</td><td></td></tr><tr><td>20x NuPAGE&amp;reg; MES SDS 电泳缓冲液</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>NP0002</td><td></td></tr><tr><td>20x NuPAGE MOPS SDS 电泳缓冲液</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 抗氧化剂</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>NP0005</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris 凝胶 1.5 mm，10 孔&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>NP0335BOX</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris 凝胶 1.5 mm，15 孔</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>NP0336BOX</td><td></td></tr><tr><td>SeeBlue Plus2 预染标准蛋白&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>LC5925</td><td></td></tr><tr><td>XCell SureLock Mini-Cell&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>EI0001</td><td></td></tr><tr><td>iBlot 转膜叠层，PVDF 常规型</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>IB4010-01</td><td></td></tr><tr><td>iBlot 转膜叠层，PVDF 小型</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>IB4010-02</td><td></td></tr><tr><td>iBlot 转膜叠层，硝酸纤维素常规型</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>IB3010-01</td><td></td></tr><tr><td>iBlot 转膜叠层，硝酸纤维素小型</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>IB3010-02</td><td></td></tr><tr><td>iBlot 凝胶转膜仪&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>IB1001</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-肌动蛋白</td><td>Sigma</td><td>A2228</td><td></td></tr><tr><td>磷酸化 BIM (S69)</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>总 BIM</td><td>Epitomics</td><td>1036-1</td><td></td></tr><tr><td>磷酸化 ERK1/2 (T202/Y204)</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>4370</td><td></td></tr><tr><td>总 ERK1/2</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9107</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey 封闭缓冲液&amp;nbsp;</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>927-40000</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800CW 山羊抗兔 IgG</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>926-32211</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680LT 山羊抗小鼠 IgG&amp;nbsp;</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>926-68020</td><td></td></tr><tr><td>Western 孵育盒，中号&amp;nbsp;</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>929-97205</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Classic 成像系统</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey 应用软件 V3.0.30</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

最快的蛋白印迹法：经典蛋白质印迹分析的现代革新

The Fastest Western in Town: A Contemporary Twist on the Classic Western Blot Analysis

Western blot 技术最初建立于20世纪70年代末，至今仍被广泛使用。然而，这种传统的 Western blot 方法存在若干缺点，包括分辨率低、出现非特异性条带、灵敏度降低以及蛋白质完整性差等问题。近年来的技术进步已显著改进了标准 Western blot 实验方案的多个方面，从而获得更高质量的定性和定量数据。Bis-Tris 凝胶系统作为传统 Laemmli 系统的替代方案，能够实现更优的蛋白质分离效果和分辨率，保持蛋白质的完整性，并将电泳时间缩短至35分钟。此外，iBlot 干式转膜系统将蛋白质转移至膜上的效率和速度显著提升，仅需7分钟即可完成，相比之下，传统的蛋白质转移方法通常效率较低且耗时较长。结合这些高度创新的改进，利用红外荧光成像进行蛋白质检测，相较于化学发光法这一标准 Western blot 检测技术，可获得质量更高、更准确且更一致的数据。该技术可通过使用两种可在不同荧光通道中被识别的近红外荧光染料，在同一张膜上同时检测两种不同的抗原。此外，荧光成像所具备的线性关系和宽动态范围，使得对强信号和弱信号蛋白质条带均能实现精确的定量分析。因此，本实验方案描述了对经典 Western blot 方法的关键改进，这些技术进步在显著提高数据质量的同时，大幅缩短了实验操作时间。

双色红外荧光技术可同时在一张膜上检测强信号和弱信号条带，具有更高的灵敏度和最高的信噪比，从而获得清晰的Western印迹图像。通过双色Western印迹检测在700 nm和800 nm两个荧光通道中所获得的典型结果如图1和图2所示。图1最上方的Western印迹显示了人源黑色素瘤细胞系WM793裂解液连续两倍稀释样品中总ERK1/2在800 nm通道（绿色）和β-Actin在700 nm通道（红色）的同步（叠加）检测结果。此外，该膜还根据目标蛋白的分子量被切割成多个区段，以便在同一张印迹膜上检测两种以上的抗体。例如，用于图1分析的膜被切成两半，以便使用第三种抗体——总BIM（700 nm通道-红色）对膜的下半部分进行孵育，而不会干扰总ERK1/2和β-Actin的检测。图2的第一个图板进一步展示了在存在或不存在MEK1/2抑制剂PD0325901（MEKi）处理条件下，WM793黑色素瘤细胞中磷酸化ERK1/2（800 nm通道-绿色）与总ERK1/2（700 nm通道...

本实验方案探讨了进行蛋白质印迹分析的最新进展。&#160;这些新改进采用 Bis-Tris 凝胶系统，电泳运行时间为 35&#160;min，干转印系统转膜时间为 7&#160;min，并结合红外荧光蛋白检测与成像技术，可获得更高分辨率、更高质量、更高灵敏度以及更准确的蛋白质印迹数据。

Western blot 技术于20世纪70年代末期首次建立，至今仍被广泛使用。然而，这种传统方法……

本实验的总体目标是确定对经典蛋白质印迹（Western blotting）技术的关键改进，以提高 Western 检测结果的分辨率、质量、灵敏度和准确性。首先，使用含有锂 ESAL 硫酸盐的缓冲液制备样品，为蛋白质的还原和烷基化提供最佳条件，同时保持蛋白质的完整性。第二步是采用 BIS tris 凝胶系统分离蛋白质，该系统可在 35 分钟内完成电泳。接下来，使用 EyeBlot 干式转膜系统在七分钟内将蛋白质转移至膜上。最后一步是利用近红外荧光染料通过红外荧光成像检测蛋白质，该方法在两个不同的荧光通道中同时可视化同一膜上的两种不同抗原。最终，这些对传统 Western 印迹法的创新性改进不仅显著缩短了实验操作时间，还提高了定性和定量数据的准确性。与现有的蛋白质印迹方法相比，该技术的主要优势在于提高了蛋白质印迹数据的效率、一致性和灵敏度，能够在同一张膜上对多种目标蛋白进行准确定量，同时显著缩短实验操作所需时间。开始时，将15毫升锥形管和接近融合的10厘米方形细胞培养皿置于冰上。然后使用细胞刮刀，向每个培养皿中加入含有5毫摩尔EDTA的5毫升冰冻PBS。从培养皿中收集贴壁细胞，并将细胞悬液转移至预冷的15毫升圆锥形离心管中。接着，在4°C下以230 ×g低速离心5分钟，使细胞沉淀。离心结束后，将离心管置于冰上，小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀。用1毫升含5毫摩尔EDTA的预冷PBS洗涤沉淀，将细胞悬液转移至预冷的1.5毫升离心管中。然后以约13,000 G离心10秒，使细胞沉淀。离心后，小心移除上清液，避免扰动沉淀，将离心管置于冰上。接下来，向Ripa缓冲液中加入新鲜的蛋白酶和磷酸酶抑制剂，使其终浓度为2倍。然后用Rippa缓冲液重悬细胞，细胞浓度为每毫升2000万个。短暂涡旋振荡每支试管，并将悬液置于冰上孵育20至30分钟。通过在约15,000 G下离心裂解物5分钟，制备核周质组分。在4摄氏度条件下，将上清液转移至新管中，并将新管置于冰上。此时，可弃去富含细胞核的沉淀物。然后通过BCA法测定每个样品的蛋白质浓度。按照此处列出的比例制备电泳样品。每个样品上样量为20 µL，总体积已考虑移液误差。接下来，将样品在 70 °C 下加热 10 分钟。样品加热的同时，配制 1 升 1× MES 电泳缓冲液。样品加热完成后，迅速离心样品并置于冰上。然后在微型电泳装置中准备预制的 bis tris 胶用于电泳。从预制胶中取出梳子，并将凝胶方向调整为每块凝胶的短玻璃板朝内，面向缓冲液核心。确保凝胶处于水平状态，并紧密贴合缓冲液核心。为避免上层缓冲液室产生串连效应，先向上层缓冲液室中加入 200 毫升含 0.25% 抗氧化剂的 1× MES 电泳缓冲液，然后向迷你电泳槽的下层缓冲液室中加入约 600 毫升 1× MES 电泳缓冲液。在两侧的加样孔中加入 2 至 5 微升合适的蛋

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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