高效生成荧光标记的痘苗病毒蛋白的方法学

本实验通过基于瞬时显性筛选的模块化快速方法，生成带有荧光标记的重组痘苗病毒。首先，构建一个重组载体，其中包含被合成的最小同源区域包围的荧光标签，以及用于代谢筛选和荧光筛选的标记基因。将该重组载体转染至感染细胞中，并利用代谢筛选和荧光筛选扩增重组病毒。随后，去除代谢筛选压力以切除标记盒，并通过荧光标记筛选分离含有重组病毒的细胞。在细胞单层上观察病毒蚀斑的结果，可实现对携带荧光标记基因的单个病毒颗粒的可视化。

我们开发该方法旨在利用一种可重复且通用的筛选策略，生成携带多种遗传修饰的重组病毒，而无需考虑标签的类型。尽管瞬时显性筛选的原理此前已有描述，但我们希望将其更广泛地、模块化地加以应用，以提高基因组修饰的灵活性。该方法的可视化演示至关重要，因为重组病毒空斑的筛选与分离较为困难。由于其出现频率可能较低，因此需要采用一些独特的方法才能高效回收病毒。

因此，将感兴趣的病毒基因标记在蛋白的N端或C端。相应地，确定长度为150个碱基对的同源侧翼区域。然后设计一条寡核苷酸序列，包含由一对选定的限制性酶切位点分隔的150碱基对左臂和右臂。同时，用另一对不同于前一对的限制性酶切位点侧接该区域，以便合成后插入TDS载体。现在验证带有限制性酶切位点的寡核苷酸是否与目标插入位点保持正确的阅读框。在寡核苷酸合成过程中，确保位于左臂和右臂之间的插入限制性酶切位点与所选荧光标签开放阅读框两侧的限制性酶切位点相匹配。通过PCR在荧光标签的两侧引入相同的限制性酶切位点。将合成的片段克隆至TDS载体中。同时，利用同源左臂和右臂区域之间的限制性酶切位点，将荧光标签克隆至所得的重组载体中。用痘苗病毒在无血清培养基中感染一层BS-C-1细胞。

感染后一小时，使用 Dulbecco 改良 Eagle 培养基拯救细胞，并在无血清培养基中转染重组载体质粒与转染试剂按 3:1 比例组成的混合物。24 小时后，刮取细胞并回收至不含胎牛血清的 DMEM 培养基中。对细胞进行三次冻融循环，以裂解细胞并释放病毒颗粒。接下来，为获得足够分离的单个噬斑，将病毒颗粒制备物进行系列稀释后感染 100% 汇合的 BS-C-1 细胞单层。加入含 10% FBS 的液体覆盖层及 DMEM，并添加 GPT 筛选试剂，孵育 24 小时。

吸去液体覆盖层，使用荧光显微镜观察是否出现呈现弥散性红色荧光的噬斑，该荧光表明TDS载体中的M-cherry已整合入病毒。根据目标基因和所选的荧光标签，标签基因的局部荧光也可能在同一红色噬斑中被观察到。

现在，为每种重组病毒挑选多个噬斑，用移液枪头刮取细胞，并加入含有5%FBS的DMEM培养基100微升，将细胞转移至EP管中。对刮取的细胞进行三轮冻融处理，以释放重组病毒。

将含有冻融病毒的DMEM加入12孔板中的细胞单层，使用含GPT筛选试剂的培养基扩增重组病毒。随后在感染后24小时刮取成功扩增的细胞。对于表现出红色荧光的成功扩增噬斑，进行噬斑试验时，将BS-C-1细胞以单层接种于6孔板中。

对重组病毒进行系列稀释，并用含病毒量递增的无FBS DMEM感染各孔。感染后1小时，吸去液体培养基，每孔覆盖含有0.5%琼脂糖的完全最低必需培养基。感染后三天，挑取同时显示红色和所选荧光标签颜色的荧光噬斑。

再次扩增，但不进行GPT筛选。挑选那些失去弥散性红色荧光，但仍保留与所选标签相对应的局部荧光的噬斑。继续进行噬斑纯化，不加筛选，以获得纯化的重组病毒株，这些病毒已丢失M-cherry和GPT筛选基因，但仍保留与所选标签相对应的局部荧光。

通过空斑实验评估毒株的纯度，确保所有空斑具有相似的空斑表型。在BS-C-1细胞单层中扩增待测病毒毒株。感染后24小时，将感染细胞刮入250微升DMEM中。离心收集感染细胞，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于500微升含0.1% SDS的TE缓冲液中。涡旋振荡以裂解细胞。然后加入500微升苯酚、氯仿、异戊醇，颠倒混匀。离心后收集上层液相，并重复提取一次。

然后，为了从水相中沉淀DNA，加入1毫升预冷的100%乙醇和50微升乙酸钠。颠倒混匀后，将样品置于负20摄氏度过夜。离心收集DNA沉淀后，吸除所有液体，将DNA沉淀空气干燥，并重悬于50微升TE缓冲液中。使用该基因组DNA作为模板进行PCR筛选病毒插入。按照文本方案中所述方法，构建带有多个标签的重组病毒。

这些重组痘苗病毒表达的蛋白质带有荧光标记，靶向病毒结构蛋白A3和F13，分别位于病毒内核心和外膜。选择编码病毒粒定位蛋白的基因以实现对病毒颗粒的可视化。A3是痘苗病毒颗粒的核心蛋白，F13是一种病毒包膜蛋白。

还展示了一种双重标记病毒，同时带有荧光标记的A3和F13。可利用双标记病毒进行实时荧光显微镜观察。在此情况下，痘苗病毒的内层核心蛋白A3标记为红色，外层包膜蛋白F13标记为绿色。

病毒工厂中未包裹的病毒颗粒以红色显示，而包裹的病毒颗粒则通过红色和绿色通道的共定位来表示。采用定量分析方法测定重组载体与痘苗病毒基因组之间的重组效率。当同源区域低至70个碱基对时，仍可检测到载体与痘苗病毒基因组之间的同源重组效率。

该方法已被用于构建携带多个荧光标签和/或多个基因缺失的病毒。这些病毒已被应用于研究病毒感染生命周期、病毒蛋白在抑制宿主防御系统中的作用，以及与宿主信号通路的相互作用。观看本视频后，您应能够充分理解如何采用一种模块化标签设计、精确筛选目标重组体并适用于多种研究场景的方法来制备重组痘苗病毒。