Name: 有效生成荧光标记疫苗病毒蛋白的方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-17T14:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: 学习利用瞬时显性选择法快速生成表达荧光标记蛋白的重组痘苗病毒。该方法采用模块化设计，支持多种基因修饰，显著简化病毒筛选与分离流程，为病毒学及基因工程研究提供高效可靠的技术平台。

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本工作由澳大利亚研究理事会联邦发现项目基金（项目编号：1096623）资助。

1. 构建重组载体
<ol>
	<li>确定长度为150 bp的同源侧翼区域（称为左臂和右臂），用于对目标病毒基因的N端或C端进行标记（见图1b）。</li>
	<li>设计一条寡核苷酸序列，其中包含被一对选定限制性酶切位点分隔的150 bp左臂和右臂序列；该完整序列的两端还需被另一对不同的限制性酶切位点所包围&#160;，以便合成后能够插入TDS载体。在设计含限制性酶切位点的寡核苷酸时，需确保序列与目标插入位点的读码框一致。</li>
	<li>在设计用于合成的寡核苷酸时，应在左臂和右臂之间引入限制性酶切位点，这些位点必须与所选荧光标签开放阅读框两侧的限制性酶切位点相匹配（见图1b）。可使用NotI限制性酶切位点作为左臂与荧光标签起始端之间的三个氨基酸连接序列。</li>
	<li>通过PCR在荧光标签的两侧引入相同的限制性酶切位点（见图1c）。</li>
	<li>将合成的片段克隆至TDS载体中。</li>
	<li>利用同源左臂和右臂区域之间的限制性酶切位点，将荧光标签克隆至所得的重组载体中（见图1d）。</li>
</ol>
2. 重组病毒的制备
<ol>
	<li>如图2所示，在无血清培养基中以感染复数（MOI）&#62; 1的条件感染BS-C-1细胞单层。</li>
	<li>感染后1小时，用Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）复苏细胞，并在无血清培养基中以3:1的比例共转染重组载体质粒与转染试剂。</li>
	<li>24小时后，刮取细胞并用不含胎牛血清（FBS）的DMEM回收，进行三次冻融循环以裂解细胞并释放病毒颗粒。</li>
	<li>使用含10% FBS的DMEM液体覆盖层及GPT筛选试剂——霉酚酸（25 µg/ml）和黄嘌呤（250 µg/ml）进行噬斑分析，步骤如下：
	<ol>
		<li>在6孔板中接种形成单层的BS-C-1细胞。</li>
		<li>用含有病毒颗粒的冻融细胞液进行系列稀释后，感染100%汇合的细胞单层，以确保单个噬斑之间有足够的分离度。</li>
		<li>加入含GPT筛选试剂（终浓度分别为25 µg/ml的霉酚酸和250 µg/ml的黄嘌呤）的10% FBS DMEM液体覆盖层。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>孵育24&#160;小时后，移除液体覆盖层，使用荧光显微镜观察显示弥散性红色荧光的噬斑，该荧光表明TDS载体中的mCherry已整合入病毒基因组。根据目标基因和所选荧光标签的不同，也可能在同一红色噬斑中观察到标记基因的局部荧光。</li>
	<li>通过移液器吸头局部刮取多个噬斑，加入含5% FBS的DMEM 100 µl，将细胞转移至Eppendorf管中，随后对刮取的细胞进行三轮冻融处理，以释放重组病毒。</li>
	<li>将含有冻融后病毒的DMEM加入12孔板中的细胞单层，利用生长培养基中的GPT筛选试剂扩增重组病毒。感染后24小时&#160;刮取成功扩增的细胞。</li>
	<li>对表现出红色荧光的成功扩增噬斑再次进行噬斑分析，此次采用琼脂糖覆盖层并加入GPT筛选，步骤如下：
	<ol>
		<li>在6孔板中接种形成单层的BS-C-1细胞。</li>
		<li>对重组病毒进行系列稀释，并用不含FBS&#160;的DMEM以递增稀释度感染各孔。</li>
		<li>感染后1小时，移除液体培养基，每孔覆盖含2.5% FBS、292 µg/ml L-谷氨酰胺、100 U/ml青霉素和100 µg/ml链霉素的最小必需培养基（MEM）中配制的0.5%琼脂糖，并加入GPT筛选试剂。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>感染后2-3天，挑选同时显示红色荧光和所选荧光标签颜色的噬斑进行再次扩增，此次不再使用GPT筛选。</li>
	<li>下一次噬斑分析使用不含筛选试剂的琼脂糖覆盖层。</li>
	<li>挑选已失去弥散性红色荧光但保留与所选标签对应的局部荧光的噬斑。</li>
	<li>继续进行无筛选条件下的噬斑纯化，以获得纯化的重组病毒储备液，这些病毒已丢失mCherry和gpt筛选基因，但仍保留与所选标签对应的局部荧光。通过噬斑分析验证储备液的纯度，所有噬斑应具有相似的噬斑表型。</li>
	<li>通过基因组DNA的PCR筛选确保病毒储备液的纯度。
	<ol>
		<li>设计跨越荧光基因插入位点的引物以及扩增插入荧光基因本身的引物。这些引物的不同组合将产生可检测基因插入情况并指示纯度的PCR扩增片段。</li>
		<li>在12孔板的一个孔中接种BS-C-1细胞单层，扩增待进行PCR筛选的病毒储备液。</li>
		<li>感染后24小时&#160;，将感染细胞刮入250 µl DMEM中。</li>
		<li>离心收集感染细胞（18,000 × g，4 °C，10分钟），弃上清，将细胞沉淀重悬于500 µl TE缓冲液（10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，pH 8）中，加入0.1%（v/v）SDS，涡旋振荡以裂解细胞。</li>
		<li>加入500 µl 苯酚-氯仿-异戊醇，颠倒混匀。离心（18,000 × g，4 °C，4分钟），取上清并重复一次。</li>
		<li>向上清中加入1 ml预冷的100%乙醇和50 µl乙酸钠，颠倒混匀，进行乙醇沉淀。</li>
		<li>于-20 °C放置过夜或-80 °C放置1小时。离心（18,000 × g，4 °C，30分钟），弃去所有液体，让沉淀的DNA自然&#160;干燥。最后重悬于50 µl TE缓冲液中。</li>
		<li>将所得DNA用作基因组DNA PCR筛选的模板。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 产生携带多个标签的重组病毒
<ol>
	<li>用荧光重组病毒感染同一细胞单层，以产生双标记或三标记病毒，或重复方案1）的操作但使用不同的标签。</li>
	<li>根据噬斑表型或病毒分离株基因组DNA的PCR筛选结果纯化病毒。</li>
</ol>

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</ol>

无利益冲突声明。

本技术描述了一种高效且模块化的方案，用于构建表达荧光标记病毒蛋白的重组病毒。该方法确保对病毒基因组的唯一改变是添加一个标签或标记，而不留下任何筛选标记。由于同源重组所需的臂长较短，可直接合成，从而省去了多轮耗时的PCR扩增和克隆步骤；同时利用mCherry的荧光信号和代谢型GPT筛选来分离病毒重组中间体。这些中间体在去除筛选压力后，可进一步解析为带有标记基因的病毒，或恢复为亲本型病毒。此前已有研究报道过类似方法，即同时使用荧光筛选和代谢筛选27，但本研究所采用的方法利用更短的合成同源区域，使得可通过成像目标标记基因的荧光信号来鉴定所需的重组病毒。这种二次筛选仅适用于标记高表达的病毒基因，这些基因在空斑实验中能产生足够强的荧光信号。 alternatively，也可设想插入一个完整的表达盒，例如在强病毒启动子控制下的荧光蛋白基因。在这种情况下，左右同源臂将决定插入位点，而非用于标记特定的病毒基因。
在实验过程中，有一些关键步骤被证明非常有帮助。第2.3.3步中的液体覆盖层&#160;如上所述，该方法对于红色/绿色荧光斑的检测与分离至关重要。我们认为，GPT筛选试剂与琼脂糖覆盖层可能会抑制重组病毒的生长，因此在转染后的病毒扩增第一步中改用液体覆盖层。在富集和纯化过程中，选择显示局部标签荧光颜色的荧光斑同样重要，因为若左臂含有启动子序列，左臂发生重组所产生的中间产物可能导致斑内出现弥散性荧光。 mCherry TDS 载体中的标记基因也可被替换为 gfp，例如，便于轻松整合和筛选 mCherry 作为荧光标签。
上述描述的某些技术与已建立的重组痘苗病毒制备方法略有不同。例如，通常用于产生重组体的病毒感染复数（MOI）应小于128，但本方法中使用较高的MOI也足以成功获得重组痘苗病毒。通常情况下，使用GPT选择试剂需要在感染前对细胞进行选择试剂的预孵育18，然而在感染后的拯救阶段加入这些试剂仍能实现充分的选择效果，尤其是同时存在荧光选择标记的情况下。
如前所述，该技术的一个局限性在于，二次荧光筛选步骤依赖于目标蛋白的高表达水平，即其表达量需足以在噬斑实验中通过肉眼观察到。若无法满足此条件，则可能纯化出仅表达mCherry荧光的病毒，其中至少50%会含有目标重组病毒，这些可通过上述步骤2.12中所述的PCR等分子策略进行鉴定。另一个局限性可能是蛋白在标记后发生失活。荧光标签在连续传代过程中可能发生突变，或被重组病毒切除。因此，建议定期通过显微镜观察和PCR对重组病毒储备株进行取样检测。最后，单个病毒中可整合的荧光标记蛋白数量可能存在上限。一方面，需考虑能否同时清晰观察所有标记蛋白；鉴于现有荧光标签的发射光谱存在重叠，应谨慎选择标签组合，以尽量减少光谱串扰。此外，使用GFP和Cerulean等序列相近的标签时，根据其在重组基因组中的位置，可能引发两者之间的重组事件。
该技术的模块化特性使得可根据其他染色方法和/或标签选择的兼容性，简便地替换荧光标签。通过切除可筛选标记，TDS 方法能够连续添加多种荧光蛋白，或将基于 TDS 的标记技术与基于 TDS 的基因敲除相结合，用于表型分析29。作为该方法应用实例，已构建出一种双标记荧光病毒，可同时标记病毒核心和 WV 膜。利用该病毒进行的成像研究可用于观察病毒复制过程中的病毒运动、形态发生及包裹过程。此外，目前尚未表征的痘苗病毒蛋白也可通过该技术进行标记和研究。
由于痘苗病毒具有许多有利于活细胞显微镜观察的特性，它已被广泛应用于成像研究中。荧光标记可直接由病毒基因组表达，无需转染步骤，因此可方便地分析来自感染动物的原代细胞或难以转染的细胞。最初，荧光标记的痘苗病毒（VACV）仅用于简单的亚细胞水平病毒运动追踪30，但近年来的研究已将其应用拓展至FRET研究31、单个病毒颗粒的FRAP分析32、启动子报告系统33、活体成像34以及结构研究35-37。结合本研究中构建重组荧光病毒的方法，这些技术将更易于实现并更具可及性。

痘苗病毒（VACV）是痘病毒的典型代表，与引起天花的病原体——天花病毒高度相关。这两种病毒均属于正痘病毒属，该属还包括其他一些重要病原体，如猴痘病毒和鼠痘病毒（小鼠痘）1。正痘病毒具有较大的双链DNA基因组（180–220 kb），可编码超过200个预测的开放阅读框2,3。这些病毒的复制过程涉及在核周形成病毒工厂，在其中产生成熟病毒（MV）；此外，部分MV在反式高尔基网络中获得两层额外的膜结构，从而形成包被病毒（WV）（Roberts 和 Smith 综述4）。由于VACV基因组复制过程中具有高效的遗传重组特性，且该过程由病毒DNA聚合酶介导，因此正痘病毒基因组非常易于进行遗传操作5。重组病毒的构建依赖于同源重组机制，即使同源序列短至12个碱基对，也足以在感染痘苗病毒的细胞中介导重组事件6。由于正痘病毒颗粒体积较大，每个病毒粒子可容纳大量荧光蛋白，因此对痘苗病毒进行荧光标记可获得极为明亮的病毒颗粒7。痘苗病毒能够携带大片段的外源DNA8，并且由于其缺乏刚性的衣壳对称结构，可能在从内源位点表达病毒蛋白融合基因时具有一定的灵活性9。对VACV蛋白进行荧光标记已被证明在研究宿主-病原体相互作用的亚细胞水平机制方面极具价值，尤其在病毒入侵10、运输11–13以及包被病毒颗粒的形态发生过程中的研究中发挥了重要作用7。
可通过拯救减弱的生长表型来筛选重组病毒14,15，代谢筛选16-18，或通过标记基因的表达（例如 X-gal19 或荧光蛋白13,20）。本文中，我们描述了一种利用荧光与代谢筛选相结合的强有力方法来筛选荧光病毒。该方法基于Faulkner和Moss（1990年）开发的瞬时显性筛选（TDS）载体。21，可使标记基因与目的荧光标记基因一同整合。当去除代谢筛选条件后，可发生二次重组事件，从而切除筛选基因，但保留荧光标记的病毒蛋白完整。 图2 下文概述了实验流程。本研究中使用的筛选基因是 mCherry 以及 大肠杆菌 鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶（gpt) 基因，两者均由合成的早期/晚期病毒启动子表达，并已被 Cordeiro 之前的研究使用过 等22&#160;此外，目标融合蛋白的标签也显示出荧光。当撤去代谢筛选条件时，筛选标记基因（mCherry 和 gpt)被切除，仅保留标记基因的荧光信号，从而能够识别正确的重组病毒。通过切除筛选标记，可实现多个荧光标签的组合，使我们能够构建可同时荧光标记多种病毒蛋白的病毒。先前的研究已确定了线性和环状DNA分子在转染痘苗病毒感染细胞后发生痘苗病毒同源重组所需的最小同源序列长度要求。6我们希望确定不同长度同源侧翼臂的重组效率 gpt-mCherry 通过将TDS载体整合到痘苗病毒基因组中实现。确定TDS载体中100 bp的同源区域足以通过同源重组靶向并介导重组DNA插入VACV基因组。图4尽管较短的同源序列长度也能实现重组，但100 bp的同源序列长度已能提供足够数量的重组病毒，可通过代谢和荧光筛选轻松鉴定。此类大小的DNA片段可商业合成，成本相对较低，且极大地方便了多种载体的制备，用于重组病毒的构建。我们选择将同源序列长度增加至150 bp，以提高重组频率，同时控制侧翼区域寡核苷酸序列合成的成本。

<table><tbody><tr><td>霉酚酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3536-50MG</td><td>溶于 0.1 N NaOH</td></tr><tr><td>黄嘌呤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X0626-5G</td><td>溶于 0.1 N NaOH</td></tr><tr><td>FuGENE HD 转染试剂</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>配备 Chroma 滤光片 31001、31002 的荧光显微镜</td><td>Olympus, Chroma</td><td>BX51 (Olympus); 31001, 31002 (Chroma)</td><td>&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

高效生成荧光标记的痘苗病毒蛋白的方法学

Methodology for the Efficient Generation of Fluorescently Tagged Vaccinia Virus Proteins

用荧光蛋白标记病毒蛋白已被证明是深入研究病毒与宿主相互作用不可或缺的方法。痘苗病毒（VACV）作为根除天花所使用的活疫苗，尤其适用于荧光活细胞显微镜观察，因其病毒粒子较大，且易于在基因组水平上进行改造。本文报道了一种优化的重组病毒构建方案。我们确定了痘苗病毒复制过程中实现靶向同源重组的最低要求，从而简化了重组载体的构建。这使得瞬时显性筛选（TDS）可与荧光报告基因和代谢筛选相结合，提供一种快速、模块化的病毒蛋白荧光标记方法。通过优化荧光重组病毒的制备流程，我们能够促进多种下游应用，例如对病毒复制过程中发生的病毒-宿主相互作用的多个方面进行高级成像分析。

图1列出了本实验所需的各种构建体，这些构建体通过化学合成（图1b 和 1c）或克隆步骤（图1d）获得。图2概述了实验流程，并展示了A3-GFP重组VACV在筛选各阶段的代表性荧光蚀斑图像。图3展示了表达荧光标记蛋白的重组痘苗病毒，这些蛋白分别靶向病毒结构蛋白A3和F13，其中A3属于病毒内核心23，F13属于外膜24。图中还展示了每种所构建的重组病毒的病毒蚀斑及感染细胞的观察结果。同源重组效率通过载体与VACV基因组之间仅含低至70 bp同源区域的实验进行测试，结果如图4所示。由于含100 bp同源序列的载体在重组后识别病毒蚀斑的相对成功率较高，因此选择合成长度为150 bp的左右同源臂以靶向目标基因。
<img alt="基因编辑过程示意图；质粒载体构建、连接、TDS载体的重组。" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig1.jpg" width="400px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1. 瞬时显性筛选（TDS）重组载体。 (a) 含有 gpt 和 mCherry 筛选标记的 TDS 载体。(b) 同源左臂和右臂设计时在两者之间及同源臂外侧包含特定的限制性酶切位点。本方法中在左臂和右臂之间使用的限制性酶切位点为 NotI 和 BamHI，其中 NotI 位点还可用作基因与荧光标签之间的连接子。(c) 该方法兼容的荧光标签两侧带有相应的限制性酶切位点。所使用的部分标签包括 GFP（绿色荧光蛋白）、RFP（红色荧光蛋白）、Cerulean（通过定点诱变对 ECFP（青色荧光蛋白）的改进版本25）以及 mini-SOG（一种由 GFP 改造而来的荧光蛋白，在光照下可产生可在电镜下分辨的产物26）。(d) 构建最终 TDS 重组载体所涉及的克隆步骤。首先将含有同源左、右侧翼臂的合成寡核苷酸克隆至 TDS 载体中。由此获得的重组载体可通过克隆至左臂与右臂之间引入的限制性酶切位点，实现任意选择的标签的插入与替换。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig1highres.jpg" target="_blank">点击此处查看高清图像</a>。
<img alt="Vaccinia virus plaque assay process, diagram with GFP, mCherry selection; genetic recombination method." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig2.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
图2. 构建重组痘苗病毒的实验流程示意图。 在遗传和细胞水平上发生的事件被展示出来，并附有代表性斑块图像，概述了构建A3-GFP标记的荧光痘苗病毒后所经历的各个步骤。A接种痘苗病毒的细胞转染TDS重组载体。B) 在本图中，仅展示了左侧同源重组的结果，示例中使用 GFP 作为所选的荧光标签。右侧同源重组将以类似方式导致整个 TDS 质粒插入基因组，唯一的区别是在中间步骤中，标签将与目标基因的全长序列发生融合。 即 步骤C：将重组混合物接种于细胞单层进行噬斑试验，并进行GPT筛选。C) 挑取显示红色和绿色荧光的噬斑，分别对应 mCherry 和 GFP 的表达，并进行扩增。一旦撤去筛选压力，将出现红色荧光的丢失，对应于 gpt 和 mCherry 基因D）并挑选仅表现出绿色荧光的噬菌斑进行扩增（E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig2highres.jpg" target="_blank">单击此处查看大图</a>.
<img alt="荧光显微镜图像，GFP/RFP标记，DAPI染色，蛋白质表达分析，100-10 μm比例尺。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig3.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. TDS重组系统的代表性结果。 图像显示了重组VACV感染细胞48小时后的完整斑块（a、c、e；比例尺100 µm），以及相应重组病毒感染单个细胞8小时后的图像（b、d、f；比例尺10 µm）。选择编码病毒颗粒定位蛋白的基因以可视化病毒颗粒。A3是痘苗病毒颗粒的核心蛋白（a、b），F13（c、d）是病毒包膜蛋白。图中还展示了一种同时荧光标记A3和F13的双标签病毒（e、f）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig3highres.jpg" target="_blank">点击此处查看高分辨率图像</a>。
<img alt="柱状图：重组载体同源序列长度与成功重组事件（对数尺度）的关系。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig4.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
图 4. 重组载体与痘苗病毒（VACV）基因组合并效率的定量分析。 BS-C-1 单层细胞感染 VACV 后 1 小时，转染三种重组载体，这些载体分别含有与 VACV 基因组同源的 500 bp、100 bp 或 70 bp 区域。每种载体还包含由 gpt 和 mCherry 筛选基因组成的 TDS 筛选盒。感染后 24 小时收集细胞并裂解，以释放形成的重组病毒。对细胞裂解液进行噬斑分析，使用 GPT 筛选培养基，并将显示 mCherry 荧光的噬斑计为成功重组子。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig4highres.jpg" target="_blank">点击此处查看高清大图</a>。
<img alt="gpt-mCherry TDS 载体的质粒图谱，4393 bp，显示限制性酶切位点 HindIII、ClaI、SalI。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig5.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 5"> 
图 5. gpt-mCherry TDS 载体图谱，显示多克隆位点。该载体此前已有描述22，载体图谱由 SCU 张实验室小组提供的 EZ Plasmid Map v1.9 软件协助绘制。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig5highres.jpg" target="_blank">点击此处查看大图</a>。

一种快速且模块化的方案，用于生成表达荧光蛋白的重组痘苗病毒&#160;此处描述了使用瞬时显性选择方法同时标记蛋白质的技术。

用荧光蛋白标记病毒蛋白已被证明是深入研究病毒与宿主相互作用不可或缺的方法。

本实验通过基于瞬时显性筛选的模块化快速方法，生成带有荧光标记的重组痘苗病毒。首先，构建一个重组载体，其中包含被合成的最小同源区域包围的荧光标签，以及用于代谢筛选和荧光筛选的标记基因。将该重组载体转染至感染细胞中，并利用代谢筛选和荧光筛选扩增重组病毒。随后，去除代谢筛选压力以切除标记盒，并通过荧光标记筛选分离含有重组病毒的细胞。在细胞单层上观察病毒蚀斑的结果，可实现对携带荧光标记基因的单个病毒颗粒的可视化。我们开发该方法旨在利用一种可重复且通用的筛选策略，生成携带多种遗传修饰的重组病毒，而无需考虑标签的类型。尽管瞬时显性筛选的原理此前已有描述，但我们希望将其更广泛地、模块化地加以应用，以提高基因组修饰的灵活性。该方法的可视化演示至关重要，因为重组病毒空斑的筛选与分离较为困难。由于其出现频率可能较低，因此需要采用一些独特的方法才能高效回收病毒。因此，将感兴趣的病毒基因标记在蛋白的N端或C端。相应地，确定长度为150个碱基对的同源侧翼区域。然后设计一条寡核苷酸序列，包含由一对选定的限制性酶切位点分隔的150碱基对左臂和右臂。同时，用另一对不同于前一对的限制性酶切位点侧接该区域，以便合成后插入TDS载体。现在验证带有限制性酶切位点的寡核苷酸是否与目标插入位点保持正确的阅读框。在寡核苷酸合成过程中，确保位于左臂和右臂之间的插入限制性酶切位点与所选荧光标签开放阅读框两侧的限制性酶切位点相匹配。通过PCR在荧光标签的两侧引入相同的限制性酶切位点。将合成的片段克隆至TDS载体中。同时，利用同源左臂和右臂区域之间的限制性酶切位点，将荧光标签克隆至所得的重组载体中。用痘苗病毒在无血清培养基中感染一层BS-C-1细胞。感染后一小时，使用 Dulbecco 改良 Eagle 培养基拯救细胞，并在无血清培养基中转染重组载体质粒与转染试剂按 3:1 比例组成的混合物。24 小时后，刮取细胞并回收至不含胎牛血清的 DMEM 培养基中。对细胞进行三次冻融循环，以裂解细胞并释放病毒颗粒。接下来，为获得足够分离的单个噬斑，将病毒颗粒制备物进行系列稀释后感染 100% 汇合的 BS-C-1 细胞单层。加入含 10% FBS 的液体覆盖层及 DMEM，并添加 GPT 筛选试剂，孵育 24 小时。吸去液体覆盖层，使用荧光显微镜观察是否出现呈现弥散性红色荧光的噬斑，该荧光表明TDS载体中的M-cherry已整合入病毒。根据目标基因和所选的荧光标签，标签基因的局部荧光也可能在同一红色噬斑中被观察到。现在，为每种重组病毒挑选多个噬斑，用移液枪头刮取细胞，并加入含有5%FBS的DMEM培养基100微升，将细胞转移至EP管中。对刮取的细胞进行三轮冻融处理，以释放重组病毒。将含有冻融病毒的DMEM加入12孔板中的细胞单层，使用含GPT筛选试剂的培养基扩增重组病毒。随后在感染后24小时刮取成功扩增的细胞。对于表现出红色荧光的成功扩增噬斑，进行噬斑试验时，将BS-C-1细胞以单层接种于6孔板中。对重组病毒进行系列稀释，并用含病毒量递增的无FBS DMEM感染各孔。感染后1小时，吸去液体培养基，每孔覆盖含有0.5%琼脂糖的完全最低必需培养基。感染后三天，挑取同时显示红色和所选荧光标签颜色的荧光噬斑。再次扩增，但不进行GPT筛选。挑选那些失去弥散性红色荧光，但仍保留与所选标签相对应的局部荧光的噬斑。继续进行噬斑纯化，不加筛选，以获得纯化的重组病毒株，这些病毒已丢失M-cherry和GPT筛选基因，但仍保留与所选标签相对应的局部荧光。通过空斑实验评估毒株的纯度，确保所有空斑具有相似的空斑表型。在BS-C-1细胞单层中扩增待测病毒毒株。感染后24小时，将感染细胞刮入250微升DMEM中。离心收集感染细胞，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于500微升含0.1% SDS的TE缓冲液中。涡旋振荡以裂解细胞。然后加入500微升苯酚、氯仿、异戊醇，颠倒混匀。离心后收集上层液相，并重复提取一次。然后，为了从水相中沉淀DNA，加入1毫升预冷的100%乙醇和50微升乙酸钠。颠倒混匀后，将样品置于负20摄氏度过夜。离心收集DNA沉淀后，吸除所有液体，将DNA沉淀空气干燥，并重悬于50微升TE缓冲液中。使用该基因组DNA作为模板进行PCR筛选病毒插入。按照文本方案中所述方法，构建带有多个标签的重组病毒。这些重组痘苗病毒表达的蛋白质带有荧光标记，靶向病毒结构蛋白A3和F13，分别位于病毒内核心和外膜。选择编码病毒粒定位蛋白的基因以实现对病毒颗粒的可视化。A3是痘苗病毒颗粒的核心蛋白，F13是一种病毒包膜蛋白。还展示了一种双重标记病毒，同时带有荧光标记的A3和F13。可利用双标记病毒进行实时荧光显微镜观察。在此情况下，痘苗病毒的内层核心蛋白A3标记为红色，外层包膜蛋白F13标记为绿色。病毒工厂中未包裹的病毒颗粒以红色显示，而包裹的病毒颗粒则通过红色和绿色通道的共定位来表示。采用定量分析方法测定重组载体与痘苗病毒基因组之间的重组效率。当同源区域低至70个碱基对时，仍可检测到载体与痘苗病毒基因组之间的同源重组效率。该方法已被用于构建携带多个荧光标签和/或多个基因缺失的病毒。这些病毒已被应用于研究病毒感染生命周期、病毒蛋白在抑制宿主防御系统中的作用，以及与宿主信号通路的相互作用。观看本视频后，您应能够充分理解如何采用一种模块化标签设计、精确筛选目标重组体并适用于多种研究场景的方法来制备重组痘苗病毒。

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Research

科研

JoVE Journal

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