乳腺癌的一种新的转基因小鼠模型：转移性乳腺癌通过瞄准导管上皮与腺病毒Cre重组酶的启动

以下实验的总体目标是开发一种乳腺癌小鼠模型，该模型最终在健康免疫系统存在下转移。首先通过将表达 Cree 腺病毒的腺病毒注入实验动物的乳腺导管管来实现。然后定期触诊乳腺以监测肿瘤进展。

最终，可以通过流式细胞术分析评估肿瘤转移和白细胞浸润到腋窝淋巴结。与现有的乳腺肿瘤模型相比，该技术的主要优点是它允许在成熟免疫系统存在下发展的肿瘤精确启动，并且可以通过 YFP 表达进行跟踪。这种方法的视觉演示至关重要，因为介绍性注入步骤很难学习。

针的正确放置需要精确和练习。实验当天，将腺病毒 Cree 的第八个噬菌斑形成单位的 4 乘以 10 的 Eloqua 储存在干冰上，在设定的室温下解冻病毒，并在无菌水中与足够的 3% 蔗糖混合，使最终体积达到 10 微升。接下来，将 34 μL mem 和 4 μL 新鲜制备的氯化钙轻轻混合到病毒中，并在室温下孵育溶液。

15 到 20 分钟后，培养基会显得浑浊，表明腺病毒沉淀物的形成。轻轻轻弹试管，确保病毒颗粒均匀分布在整个悬浮液中，然后将病毒颗粒注入 10 μL 注射器中，吸取 3 μL 的病毒。接下来，将麻醉的小鼠仰卧在干净的解剖显微镜的照明台上。

用额外的光源照亮腹部，并通过每个周围的小白色皮毛斑块找到左第四或右第九腹股沟乳腺。现在用无菌浸有乙醇的棉签涂抹器轻轻擦拭。然后用细手术钳固定，轻轻拉起。

要取下角蛋白塞，请稳定镊子之间的奶嘴，然后轻轻地将针头插入尖端之间。以 90 度角插管导管以确保适当的注射深度，将针头插入导管腔后轻轻向上拉，在拉起时沿针头边缘向上拉。当针头放置正确时，轻轻地插入注射器的全部内容物。

加入液体时，奶嘴应略微充气。注射后，将鼠标放回加热垫上，直到它开始从麻醉中恢复。然后将动物放回干净的笼子中并对其进行监测，直到观察到完全恢复。

在第 30 天触诊注射的记忆腺，以评估腺体的扩大和肿胀。每 5 到 7 天监测一次肿瘤进展。一旦观察到肿胀和增大的乳腺，然后每 3 到 4 天测量一次肿瘤体积以了解肿瘤生长动力学。

一旦出现可触及的肿瘤，就可以通过在注射 trip 和 blue 后准备整个乳腺支架来观察乳腺导管树的靶向，以验证注射正确，或在注射表达 M cherry 的腺病毒后验证正确的病毒制备和韧性上皮细胞的感染。当在 F F流 P 53 LSLK RAs 转基因小鼠中诱导肿瘤时，初始肿瘤直到第 40 天左右乳腺变大和肿胀时才会变得明显。从第 56 天左右开始，肿瘤将开始呈指数级增长。

此时，每三天测量一次肿瘤体积至关重要。如果需要动力学研究，因为肿瘤进展会有一些正常的小鼠间变异性，到第 80 天时会出现较大的腹部肿块，之后如果肿瘤超过动物体重的 10%，则应对小鼠实施安乐死。对通量 P 53 LSL KRAS 转基因小鼠中来源于乳腺肿瘤的 3 个细胞系进行 CDNA 分析，发现肿瘤表达间皮素细胞角蛋白 8，HER 2 个新和雌激素受体 α，类似于人乳腺癌细胞微环境浸润 α、β 和 γδ T 细胞，以及髓系衍生的抑制细胞和巨噬细胞进入肿瘤。

引流到腋窝淋巴结的脉管系统将在肿瘤生长之前开始充血，并最终包含进行注射的整个记忆组织。腹股沟和腋窝淋巴结之间的浅表上腹静脉也会明显充血。7 到 8 周后，由于肿瘤细胞的淋巴血管浸润，腋窝淋巴结会变大。

通过将植绒 P 53 LSLK RAs 转基因小鼠与 L-S-L-E-Y-F-P 小鼠杂交，可以追踪肿瘤细胞的淋巴血管侵袭和转移。在预先介出的切除后，在肿瘤中检测到表达高水平和低水平 YFP 的细胞，并且它们的转移可以追溯到引流的腋窝淋巴结。一旦掌握，如果作得当，这项技术可以在 20 到 3 小时内对 20 只小鼠的实验队列进行。

在此程序之后，可以通过培育具有额外锁 p 转基因的小鼠来开发其他肿瘤模型，以回答不同的癌基因如何影响乳腺癌的病理学、免疫微环境和转移性侵袭等问题。