利用定量实时聚合酶链式反应进行脑脊液微小RNA谱分析

本实验的总体目标是通过定量 PCR 对脑脊液中的 microRNA 进行表达谱分析，并使用 Gen X 专业软件对数据进行分析。首先从脑脊液样本中分离总 RNA，然后通过逆转录反应将 RNA 转录为 cDNA。

接下来，将cDNA与含有Cyber Green的预混液混合，加入含有742个独特序列引物的384孔板中，并采用实时PCR进行扩增。最后一步是分析实时扩增所获得的数据。最终结果可以表示为相对于对照组的倍数变化（上调或下调），并以多种图形形式进行可视化展示。

因此，与现有的芯片阵列等方法相比，我们的技术主要优势在于灵敏度高，且所需的RNA量极少。通常，初次使用该方法的研究人员会因产生大量数据以及需要使用软件进行数据分析而遇到困难。首先，使用RNA Zap喷洒工作区域和移液器。

首先，将模板RNA样本用无核酸酶水稀释至浓度为5纳克/微升，进行cDNA合成。接着，将5×反应缓冲液轻轻置于冰上融化。然后，向RNA加标物中加入40微升无核酸酶水以重悬试剂，涡旋混匀后置于冰上15至20分钟。

接下来，从冷冻箱中取出酶，轻弹管壁，并将其置于冰上。此外，待所有试剂完全解冻后，迅速离心以收集管壁液体。在1.5毫升离心管中加入5倍反应缓冲液和酶，配制逆转录酶工作液。

根据表一中指示的比例，将无核酸酶水与RNA spike-in模板混合。接着，将工作液在最大速度下涡旋震荡1至2秒以混匀。短暂离心10秒使溶液沉降至管底，然后将工作液分装至无核酸酶的PCR管中。

然后将模板RNA直接加入PCR管中。轻轻涡旋反应液1到2秒，以确保所有试剂充分混匀，并离心10秒使液体沉降至管底。将样品放入PCR仪中，并输入此处所示的程序设置。

然后按照逆转录后的程序开始操作。cDNA 已可用于实时 PCR 扩增，可在负 20 摄氏度下保存长达五周。开始实时 PCR 扩增时，首先将 cDNA 和 PCR 预混液置于冰上。

解冻时，用铝箔覆盖 PCR 预混液小管以避光。解冻后，涡旋振荡 PCR 预混液 1 至 2 秒。接下来，将 2000 微升 2×PCR 预混液与 1980 微升水加入 15 毫升锥形管中混合。

向混合物中加入20 µL cDNA，并轻轻涡旋溶液1至2秒。然后将溶液在4°C下以1,500 ×g离心1分钟。接着将PCR反应混合液加入多通道移液器储液槽中。

将即用型反应板在4°C离心机中以1,500 × g短暂离心后，再移除板密封。然后，使用16通道移液器将含有CDNA的PCR预混液各10 µL加入384孔板的每个孔中，并用光学封板膜密封反应板。

加入预混液后，将酶标板在预冷的离心机中于1,500 × g短暂离心，使溶液沉降至各孔底部。混匀样品并去除气泡，以暂停实验。此时，可将反应体系置于避光环境中，于4 °C保存最多24小时。

接下来，按照表二中详述的参数进行实时 PCR 扩增和熔解曲线分析。开始分析时，在 Roche LightCycler 中选择二阶导数分析方法，然后计算定量循环（CQ）值。

将数据导出为表格并保存为文本文件。接下来，通过首先点击 gon 导入向导按钮，然后在下一个窗口中点击“开始”，选择格式化仪器和板布局文件，将数据导入 Gen X。板布局 Excel 文件可从 GON 网站下载。

然后导入第一个面板并点击下一步。文件导入后生成的表格包含预定义的列，可在此步骤编辑样本名称，并添加或删除分类列。完成后点击下一步并保存数据。

然后将其加载到数据编辑器中。首先，通过在预处理菜单中选择“板间校准”（INTERPLATE calibration）来校准各孔板之间的数据，以确保所有孔板均使用相同的参数进行计算。接下来，设定一个阈值，用于排除高于阈值循环数（ct）的数据。如果某个 microRNA 在三个重复样本中有一个的 CT 值偏高，则该读数将被其余两个探针 CT 值的平均数替代。

通过选择在所有样本中具有相似CQ值的一组microRNA来确定参考基因，并运行基因归一化。接着，使用所获得的参考基因对数据进行标准化处理。所得数值将对应于ΔCt。

通过打开预处理窗口并选择验证工作表，然后在下方的“删除空列”行中选择“应用”，以移除空列和几乎为空的列。选择所需的有效数据百分比，然后点击应用。如果您希望仅比较所有样本共有的微小RNA（microRNA），请选择100%。

将最终的 MDF 文件载入 Gen X，打开数据管理器以对聚类进行分类，并在热图和树状图上可视化 microRNA 及样本。然后选择并创建样本组，完成后点击应用。接下来，在控制面板窗口中，点击运行。

将热图以所需格式（如 TIFF 或位图）保存，然后根据需要复制并修改热图。该图条来自 Gen X 中的 G norm 应用程序，用于分析 10 个可能的 microRNA 参考基因。这些结果表明，MIR 622 和 MI 1,266 是表达最稳定的 microRNA。

此处显示的箱线图展示了HIVE组和无脑炎的HIV阳性组中11种具有统计学显著性的微小RNA（microRNA）各自的数据分布情况。在每一列中，该图示出了中位数、第一和第三四分位数，以及最大值和最小值。通过此方法，可对任何体液、组织样本和培养细胞进行矿物质谱分析。