脑脊液的microRNA分析采用实时定量PCR技术
2014年1月22日
我们描述了实时PCR的协议来分析小分子RNA在脑脊液（CSF）。除的RNA提取的协议，该过程可以扩展到从其它体液，细胞培养，或组织标本中提取的RNA。
该程序的总体目标是通过定量 PCR 分析脑脊髓液中的 microRNA，并使用 X Gen 专业软件分析数据。这是通过首先从脑脊液样本中分离总 RNA 来实现的。第二步是进行逆转录，以便将 RNA 转录成 CDNA。
接下来，将 CDNA 与加载到 384 孔板中的网络绿色预混液混合，该预混液含有 742 个独特序列的引物，并使用实时 PCR 扩增。最后一步是分析从实时扩增中获得的数据。最终，结果可以表示为控件的折叠变化、增加或减少，并以各种图形表示形式可视化。
因此，与芯片阵列等现有方法相比，我们的技术的主要优势在于我们的方法高度敏感，并且需要最少的 RNA。通常，由于生成的大量数据和使用该软件进行数据分析，刚接触这种方法的人会遇到困难。首先，用 RNA Zap 喷洒工作区域和移液器。
首先，CDNA 合成用不含核酸酶的水将模板 RNA 样品稀释至每微升 5 ng 的浓度。接下来，将 5 x 反应缓冲液轻轻置于冰上解冻。然后向 RNA 加标中加入 40 μL 不含核酸酶的水以重悬试剂，涡旋试管并将其置于冰上 15 至 20 分钟。
接下来，从冰箱中取出酶，轻弹试管并将它们放在冰上。此外，一旦所有试剂都解冻，请快速将其旋转。通过添加 5 x 反应缓冲酶，在 1.5 mL EPH 管中制备逆转录酶工作溶液。
使用表 1 中所示的比例在模板中混合不含核酸酶的水和 RNA 加标。接下来，以最大速度涡旋 1 至 2 秒，混合工作溶液。将溶液短暂离心 10 秒钟，然后将工作溶液分配到无核酸酶的 PCR 管中。
然后将模板 RNA 直接添加到 PCR 管中。轻轻涡旋反应 1 到 2 秒，以确保所有试剂都充分混合，然后沿试管旋转 10 秒。将样品放入 PCR 机器中，然后输入此处显示的设置。
然后按照逆转录启动程序。CDNA 可直接用于实时 PCR 扩增，可在零下 20 摄氏度下储存长达 5 周。要开始实时 PCR 扩增，首先将 CDNA 和 PCR 预混液置于冰上。
要解冻，请在解冻时用铝箔覆盖 PCR 预混液样品瓶，以保护其避光。解冻后涡旋，将 PCR 预混液浸泡 1 至 2 秒。接下来，将 2000 微升两种 XPCR 预混液和 1， 980 微升水混合在一个 15 毫升锥形管中。
向混合物中加入 20 微升 CDNA，轻轻涡旋溶液 1 至 2 秒。然后在冷冻离心机中以 1， 500 倍 G 的速度在 4 摄氏度下旋转 1 分钟。接下来，将 PCR 反应混合物放入多通道移液器储液槽中。
在去除板密封之前，在冷冻离心机中以 1， 500 倍 G 的速度短暂旋转即用型板。然后将 10 微升含有 CD NA 的 PCR 预混液分配到 384 孔板的每个孔中。使用 16 通道移液器并用光学密封膜密封板。
加入预混液后，在冷冻离心机中以 1， 500 倍 G 的时间短暂旋转板，以将溶液拉到孔的底部。混合样品并去除气泡以暂停实验。此时，将反应物储存在 4 摄氏度的避光区域长达 24 小时。
接下来，按照表 2 中详述的参数进行实时荧光定量 PCR 扩增和熔解曲线分析。要开始分析，请在 Roche light Cycler 中选择第二种导数分析方法。然后计算定量循环或 CQ 值。
将数据导出为表并将其另存为文本文件。接下来，通过首先单击 gon 导入向导按钮，然后在下一个窗口中单击开始，选择格式化仪器和板布局文件，将数据导入 X 代。板布局 Excel 文件可以从 GON 网站下载。
然后导入面板 1 并单击 下一步。在此步骤中，文件导入后生成的表格包含预定义列、编辑样品名称以及添加或删除分类列。完成后单击 下一步 并保存数据。
然后将其加载到数据编辑器首先，通过从预处理菜单中选择 INTERPLATE calibration 来校准板之间的数据，以确保所有板都使用相同的参数进行计算。接下来，定义一个截止值，该值将丢弃高于阈值 cycle 或 ct 的数据。如果 micro RNA 的 CT 在三个副本中只有一个更大，则该读数将被其他两个探针的 CT 平均值替换。
通过选择在所有样品中具有相似 CQ 值的 microRNA 列表来定义参考基因，并运行 gene norm。接下来，使用获得的参考基因对数据进行标准化。结果值将对应于 delta ct。
通过打开预处理窗口并选择 validate sheet，然后选择 Apply 在下面行的 remove empty columns 行上。选择所需的有效数据百分比，然后单击 Apply。如果您只想比较所有样品共有的 microRNA，请选择 100%。
将最终的 MDF 文件加载到 Gen X 中，然后打开数据管理器，在热图和 Dendro gram 上对 microRNA 和样品进行分类、聚类和可视化。然后选择并创建样本组，完成后单击 Apply。接下来，在控制面板窗口中，单击 run。
以所需的格式（如 TIFF 或位图）保存热图，然后根据需要复制和修改热图。该图形条是从 X 代的 G 规范应用程序中获得的，用于分析 10 个可能的 micro RNA 参考基因。这些结果表明 MIR 622 和 MI 1， 266 是表达最稳定的 microRNA。
此处显示的箱形图显示了 HIVE 和 HIV 组内 11 种具有统计学意义的 microRNAs 中每一种的数据分布，并且没有脑炎。在每列中，该图指示中位数、第一个和第三个四分位数，以及最大值和最小值。按照此程序，可以对任何体液、组织样本和培养的细胞进行矿物分析。
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概述
本协议描述了使用实时PCR对脑脊液（CSF）中的microRNA进行分析。该方法也可以适用于从其他体液、培养细胞或组织样本中提取的RNA。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 分子生物学
- 基因组学
背景
- MicroRNA在调节基因表达中起着关键作用。
- 脑脊液是研究神经生物学过程的宝贵来源。
- 实时PCR允许对RNA进行定量分析。
- 了解microRNA分析可帮助诊断神经系统疾病。
研究目的
- 使用定量PCR对CSF中的microRNA进行分析。
- 提供一种可靠的方法用于各种生物样本的RNA分析。
- 使用Gen X专业软件促进数据分析。
所用方法
- 从CSF样本中分离总RNA。
- 逆转录将RNA转化为cDNA。
- 使用cyber green master mix在384孔板中扩增cDNAs。
- 分析实时PCR结果以确定倍数变化。
主要结果
- 成功分析了742个独特的microRNA序列。
- 定量结果以对照组的倍数变化表示。
- 数据可视化提供了各种图形表示。
- 方法表现出适用于其他样本类型的能力。
结论
- 该协议有效用于CSF中的microRNA分析。
- 实时PCR可应用于其他生物样本。
- 结果可以增强对神经生物学机制的理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantitative real-time PCR profiling of cerebrospinal fluid microRNAs enables sensitive detection of disease-associated molecular signatures, supporting early-stage biomarker discovery in neurodegenerative and complex disorders. This workflow enhances predictive confidence in translational research by providing robust, quantitative data on extracellular miRNA expression. Integration of high-throughput miRNA profiling informs portfolio decisions at the biomarker validation and preclinical inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of miRNA-mediated regulatory pathways relevant to disease mechanisms.
- Supports functional target validation by quantifying miRNA expression changes in disease versus control CSF samples.
- Facilitates biological de-risking through identification of stable reference miRNAs for normalization.
- Provides quantitative evidence to prioritize candidate biomarkers for further validation.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, reproducible miRNA quantification across 742 unique targets using validated PCR panels.
- Generates high-content, quantitative outputs suitable for downstream screening and comparative analyses.
- Enables assay scalability and platform reuse across diverse sample types, including CSF, plasma, and tissue.
- Supports robust compound evaluation by ensuring sensitive detection of low-abundance miRNAs.
Translational & Preclinical Research
- Aligns miRNA profiling with disease-relevant biomarker discovery in neurological and oncological indications.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by enabling cross-sample and cross-cohort comparisons.
- Provides risk-adjusted data to inform advancement of biomarker candidates into translational studies.
- Strengthens predictive de-risking by quantifying miRNA signatures associated with disease phenotypes.
Pipeline & Workflow Integration
This quantitative PCR-based miRNA profiling method fits within the biomarker discovery and validation continuum, bridging early discovery, assay development, and translational research workflows.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying miRNA expression changes in CSF.
- Screening: Provides reproducible, high-throughput assay readiness for large-scale miRNA profiling.
- Analytics: Delivers quantitative fold-change data and statistical outputs for robust condition comparisons.
- Translational Research: Enables biomarker alignment and continuity across preclinical and clinical sample types.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, adaptable platform for miRNA profiling in multiple biological matrices.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in biomarker discovery.
- Operational Value: Standardizes miRNA quantification with high sensitivity and minimal RNA input requirements.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust, quantitative biomarker evaluation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of biomarker candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in RNA handling, qPCR setup, and data analysis using specialized software.
- Demands access to high-throughput qPCR instrumentation and validated primer panels.
- Necessitates rigorous cross-team standardization for data normalization and reference gene selection.
- Adaptable to various sample types but may require optimization for low-abundance or degraded RNA.
- Data analysis complexity and software proficiency are critical for accurate interpretation and visualization.
