Name: 子宫 - 输卵管胚胎移植和输精管结扎术在小鼠模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-28T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: 学习子宫输卵管胚胎移植技术在小鼠模型中的应用，通过输精管结扎术获得假孕受体，利用玻璃毛细管将胚胎送入子宫腔。该方法避免子宫壁穿刺，提高胚胎存活率，为生殖生物学研究提供可靠手段。

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本工作获得了动物与禽类科学系向 BT 提供的资金支持。

所有动物实验均经贝尔茨维尔地区动物护理与使用委员会（BAACUC 11-015）批准，符合美国农业部动物护理与使用指南的要求。
1. 麻醉与镇痛（两种外科手术通用）
<ol>
	<li>称重 小鼠并加载以下内容 麻醉剂 以及分别装有镇痛剂的两个1 ml注射器（27 G针头）：
	<ol>
		<li>氯胺酮（0.1 mg/g：10 mg/ml 溶液，0.01 ml/g）和赛拉嗪（0.01 mg/g：2 mg/ml 溶液，0.005 ml/g）。</li>
		<li>布托啡诺（0.1 &#956;g/g：0.01 ml 的 0.01 mg/ml 溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用拇指和食指尽可能靠近小鼠下颌处抓起其颈背部皮肤，同时用小指和无名指夹住尾巴，以固定小鼠。</li>
	<li>注射 氯胺酮-赛拉嗪 混合物 腹腔内为避免刺穿内脏器官，应将小鼠头部略低于其髋部进行固定图&#160;1A)</li>
	<li>注射 皮下注射布托啡诺 用拇指和食指捏住颈部后方的皮肤图&#160;1B).</li>
	<li>将小鼠置于笼中（笼子需清洁且无其他动物），放在加热台上。</li>
	<li>失去意识后，检查是否无 后足反射 （通过脚趾夹捏检测确认）。应用 眼膏 避免眼部干燥，并检查是否存在缺失 眼睑反射 (图&#160;1C).</li>
	<li>该方案可提供至少30分钟的手术麻醉水平，足以完成下述操作（方案&#160;2 和 3）。如果需要更长时间的麻醉，可在 30 分钟后追加注射一次剂量为 1.1.1 节所述剂量一半的氯胺酮 + 赛拉嗪。呼吸模式变为更快且不规则时，表明已失去适当的麻醉深度。</li>
</ol>
2. 输精管结扎术
<ol>
	<li>使用一只雄性 已验证的交配表现.</li>
	<li>灭菌 手术器械，清洁手术操作表面，并用70%乙醇擦拭。</li>
	<li>执行 麻醉 如前所述（方案1），检查反射是否消失。</li>
	<li>将小鼠置于温暖的载物台上， 去除毛发 使用电动剪刀从阴茎上方0.5 cm和2.5 cm处两条假想横线之间的腹侧区域进行剪毛图&#160;2A).</li>
	<li>消毒 用10%聚维酮碘和70%乙醇依次擦拭脱毛区域。</li>
	<li>将小鼠仰卧放置，尾部朝向术者，用无菌毛巾覆盖，留出暴露剃毛区域的开口。照亮手术区域。</li>
	<li>执行 10-15 毫米纵向皮肤切口 在腹部正中线，阴茎上方约1厘米处。用有齿镊夹住皮肤，然后用剪刀剪开（图示&#160;2A 和&#160;2B).</li>
	<li>执行 5-10 mm 纵向切口 白线用显微有齿镊夹住肌肉组织，用剪刀剪开图&#160;2C).</li>
	<li>用显微有齿镊夹住一侧的睾周脂肪垫并将其牵拉 暴露睾丸， 输精管 和附睾. 输精管 位于睾丸内侧，是一条清晰可辨的游离管道（不与睾丸壁相连，不同于附睾），其一侧有血管沿行。图&#160;二维).</li>
	<li>握住 输精管 使用带锯齿的微型解剖镊， 火焰 持镊子直至其变红（图&#160;2E），然后使用它们进行切割和 烧灼 输精管 同时在两个点图&#160;2F）。切割应去除约5 mm的一段组织，留下两个明显分离的灼烧末端（图&#160;2G).</li>
	<li>移动睾丸、附睾和 输精管 回到腹腔。</li>
	<li>从另一侧睾丸的第9步开始继续操作.</li>
	<li>缝合肌肉 使用5/0可吸收缝线进行一到两针水平褥式缝合（图&#160;2H).</li>
	<li>缝合皮肤 使用一到两个伤口剪（图&#160;2I).</li>
	<li>识别已进行输精管结扎的雄性个体（耳标，指部纹身）&#8230;），将其移至放置于预热载物台上的笼子中 观察直至其从麻醉中恢复 （保持清醒并维持胸卧位）。皮下注射0.5–1 ml温热的生理盐水溶液可促进恢复。记录输精管结扎术转移过程中可能出现的异常情况，并在饮水中添加抗生素。</li>
	<li>伤口 夹子 可以 已移除 术后10天使用伤口剪或齿状镊子拆除夹子。输精管结扎后的雄性动物在手术2周后即可进行交配。</li>
	<li>检测不孕症 通过与可育雌性交配，对已进行输精管结扎的雄性进行验证，然后再用于获取受体。</li>
</ol>
3. 子宫-输卵管胚胎移植
<ol>
	<li>小鼠的桑葚胚或囊胚可通过该技术移植至受体动物体内 假孕受体 雌性 2.5 天胚胎发育期（dpc）.</li>
	<li>准备 胚胎操作玻璃移液管:
	<ol>
		<li>打磨玻璃毛细管的尖端，以避免损坏移液器支架。</li>
		<li>软化 用细小火焰加热玻璃毛细管的中段，同时用双手同步轻微旋转毛细管。当毛细管段变软并具有可塑性（呈淡红色）时，迅速将其从火焰中移开 拉 两端收窄，使其外径变为130-150 &#956;m</li>
		<li>等待玻璃冷却后 切割 用金刚石笔、砂石或指甲锉在窄部轻轻划痕，然后从两端施力折断。断裂面应整齐且垂直。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>抛光 通过快速灼烧尖端，留下100-130 &#956;m孔径。移液器可保存以备后续使用。</li>
	<li>胚胎操作预热 培养基 （CZBH 或 M2，参见讨论部分）。</li>
	<li>灭菌 手术器械，清洁手术操作表面，并用70%乙醇擦拭。</li>
	<li>执行 麻醉 如前所述（方案1），检查反射消失情况。</li>
	<li>将小鼠置于温热的载物台上， 去除毛发 使用电动剪刀从膝盖至远端肋骨之间的背部区域进行剪毛（图3A 和&#160;3B).</li>
	<li>消毒 用10%聚维酮碘和70%乙醇依次擦拭脱毛区域。</li>
	<li>移动胚胎 从培养箱转移到预热的胚胎操作培养基中。</li>
	<li>将受体移至体视显微镜下的预热载物台上，使其侧向俯卧于手术者旁边（头部朝向手术者的左侧或右侧）。</li>
	<li>用一块中央开孔的无菌毛巾覆盖该区域，使剃毛区域暴露，并照亮手术区域。</li>
	<li>进行1 cm横向（垂直）切口 皮肤切口 位于颅侧的一个位置 &#8531; 最后肋骨与髋部之间连线的背侧 &#8531; 背部与腹部之间界线图3A 和&#160;3B）。用有齿镊夹住皮肤，用剪刀剪开（图&#160;3C).</li>
	<li>皮肤切开后，可通过体壁观察到卵巢（红色/橙色）或围绕卵巢的脂肪垫（白色）。进行0.3–0.5 cm横向（垂直）切口。 体壁切口 在卵巢或脂肪垫上方选择一个不会切断任何大血管的位置进行切口。用显微锯齿镊夹住肌肉组织，用剪刀剪开图&#160;3D).</li>
	<li>将小鼠移动至头部朝向手术者的位置。</li>
	<li>加载 胚胎操作 移液器 (图&#160;3E):
	<ol>
		<li>让CZBH培养基通过毛细作用沿操作移液管的狭窄部分上升，直至到达较宽部分约5 mm处。</li>
		<li>吸入一个小气泡（0.2–0.5 mm）。</li>
		<li>将胚胎（5-10个）置于少量培养基中（2-4 mm）。</li>
		<li>吸取另一个小气泡（0.2–0.5 mm）和少量培养基（0.5–1 mm）。</li>
		<li>将玻璃移液管保持连接在口吸管架上或手动装置上，以备步骤 3.17 使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用显微有齿镊夹住卵巢周围的脂肪垫，并将其向小鼠头部方向牵拉 暴露卵巢和输卵管， 以及上部的一小部分 子宫 腹腔外图3F 和&#160;3G).</li>
	<li>用嘴含住吸液管的吹吸端，准备使用，用显微解剖齿镊夹住脂肪垫以移动输卵管，暴露子宫-输卵管连接部即 输卵管与子宫连接处</li>
	<li>保持子宫-输卵管连接处通畅，用左手（如果是右利手）持轻微弯曲的显微解剖镊，将其置于子宫-输卵管连接处稍下方 抓取输卵管 约在该部分上方2 mm处。</li>
	<li>用微弯显微解剖镊夹住子宫-输卵管连接处， 穿刺输卵管 靠近镊子处用27 G针头进行切段图3H).</li>
	<li>插入 胚胎操作 移液器 用针进入孔口 推进 通过子宫-输卵管连接处进入子宫（图3I 和&#160;3J）。一旦移液管通过子宫-输卵管连接处（图&#160;3K）它应能轻松滑入。进入子宫时不可过深，以防损伤子宫内膜（不超过3 mm），并避免碎屑堵塞移液管。</li>
	<li>释放胚胎 通过轻轻吹气将子宫内图&#160;3L两个气泡都必须通过子宫。第一个气泡上方的部分培养基可能也会被注入子宫内，但应避免引入更多空气，以免影响胚胎着床。</li>
	<li>移除移液器 胚胎被释放到子宫后立即进行。</li>
	<li>通过抓取脂肪垫将输卵管和卵巢移回腹腔。</li>
	<li>缝合肌肉 使用5/0可吸收缝线进行水平褥式缝合（图&#160;3M).</li>
	<li>缝合皮肤 使用伤口剪（图&#160;3N).</li>
	<li>从第10步继续操作 必要时在另一侧进行.</li>
	<li>确定受体（耳标、指部纹身）&#8230;），将其转移至笼子中（笼子置于加热台上）并 观察直至其从麻醉状态恢复 （意识清醒并保持胸卧位）</li>
	<li>记录胚胎移植过程中可能发生的各种情况，并在饮水中添加抗生素。皮下注射0.5–1 ml温热的生理盐水溶液以促进恢复。</li>
	<li>伤口 夹子 可以 已移除 胚胎移植后10天，使用伤口剪或两把镊子取出夹钳图&#160;3O). 可在当天称量受体以评估是否妊娠，并估计产仔数量。胚胎移植后15天，为受体提供筑巢材料。</li>
</ol>

<ol><li>Fernandez-Gonzalez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+effect+of+in+vitro+culture+of+mouse+embryos+with+serum+on+mRNA+expression+of+imprinting+genes%2C+development%2C+and+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Long-term effect of in vitro culture of mouse embryos with serum on mRNA expression of imprinting genes, development, and behavior.</a> Proc. Natl. Acad. Sci USA. 101, 5880-5885 (2004).</li>
<li>Bermejo-Alvarez, P., Roberts, R. M., Rosenfeld, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+glucose+concentration+during+in+vitro+culture+of+mouse+embryos+on+development+to+blastocyst%2C+success+of+embryo+transfer%2C+and+litter+sex+ratio%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Effect of glucose concentration during in vitro culture of mouse embryos on development to blastocyst, success of embryo transfer, and litter sex ratio.</a> 79, 329-336 (2012).</li>
<li>Tarkowski, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experiments+on+the+development+of+isolated+blastomers+of+mouse+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Experiments on the development of isolated blastomers of mouse eggs.</a> Nature. 184, 1286-1287 (1959).</li>
<li>Whittingham, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertilization+of+mouse+eggs+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fertilization of mouse eggs in vitro.</a> Nature. 220, 592-593 (1968).</li>
<li>McLaren, A., Biggers, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+development+and+birth+of+mice+cultivated+in+vitro+as+early+as+early+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Successful development and birth of mice cultivated in vitro as early as early embryos.</a> Nature. 182, 877-878 (1958).</li>
<li>McLaren, A., Michie, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+transfer+of+fertilized+mouse+eggs+to+uterine+foster-mothers.+I.+Factors+affecting+the+implantation+and+survival+of+native+and+transferred+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Studies on the transfer of fertilized mouse eggs to uterine foster-mothers. I. Factors affecting the implantation and survival of native and transferred eggs.</a> J. Exp. Biol. 33, 394-416 (1956).</li>
<li>Goto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fate+of+embryos+transferred+into+the+uterus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Assist.+Reprod.+Gen%22%5BJournal%5D)">The fate of embryos transferred into the uterus.</a> J. Assist. Reprod. Gen. 10, 197-201 (1993).</li>
<li>Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNagy%2C+A+%22Manipulating+the+Mouse+Embryo%3A+A+Laboratory+Manual%22">Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2003).</li>
<li>Chin, H. J., Wang, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utero-tubal+transfer+of+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Utero-tubal transfer of mouse embryos.</a> Genesis. 30, 77-81 (2001).</li>
<li>Ramirez, M. A., Fernandez-Gonzalez, R., Perez-Crespo, M., Pericuesta, E., Gutierrez-Adan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+stem+cell+activation%2C+culture+media+of+manipulated+embryos%2C+and+site+of+embryo+transfer+in+the+production+of+F0+embryonic+stem+cell+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Effect of stem cell activation, culture media of manipulated embryos, and site of embryo transfer in the production of F0 embryonic stem cell mice.</a> Biol. Reprod. 80, 1216-1222 (2009).</li>
<li>Miller, A. M., Wright-Williams, S. L., Flecknell, P. A., Roughan, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+abdominal+and+scrotal+approach+methods+of+vasectomy+and+the+influence+of+analgesic+treatment+in+laboratory+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Anim%22%5BJournal%5D)">A comparison of abdominal and scrotal approach methods of vasectomy and the influence of analgesic treatment in laboratory mice.</a> Lab. Anim. 46, 304-310 (2012).</li>
<li>Flecknell, P. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFlecknell%2C+PA+%22Laboratory+Animal+Anaesthesia%22">Laboratory Animal Anaesthesia</a>. , Academic Press. Oxford, UK. (2009).</li>
<li>Erhardt, W., Hebestedt, A., Aschenbrenner, G., Pichotka, B., Blumel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+with+various+anesthetics+in+mice+%28pentobarbitone+ketamine-xylazine%2Ccarfentanyl-etomidate%29%5BTitle%5D)+AND+%22Res.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">A comparative study with various anesthetics in mice (pentobarbitone ketamine-xylazine,carfentanyl-etomidate).</a> Res. Exp. Med. 184, 159-169 (1984).</li>
<li>Tarin, D., Sturdee, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+anaesthesia+of+mice%3A+evaluation+of+tribromo-ethanol%2C+ether%2C+halothane+and+methoxyflurane+and+development+of+a+reliable+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Anim%22%5BJournal%5D)">Surgical anaesthesia of mice: evaluation of tribromo-ethanol, ether, halothane and methoxyflurane and development of a reliable technique.</a> Lab. Anim. 6, 79-84 (1972).</li>
<li>Zeller, W., Meier, G., Burki, K., Panoussis, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adverse+effects+of+tribromoethanol+as+used+in+the+production+of+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Anim%22%5BJournal%5D)">Adverse effects of tribromoethanol as used in the production of transgenic mice.</a> Lab. Anim. 32, 407-413 (1998).</li>
<li>Lieggi, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+and+safety+of+stored+and+newly+prepared+tribromoethanol+in+ICR+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Contemp.+Top.+Lab.+Anim.+Sci%22%5BJournal%5D)">Efficacy and safety of stored and newly prepared tribromoethanol in ICR mice.</a> Contemp. Top. Lab. Anim. Sci. 44, 17-22 (2005).</li>
<li>Lieggi, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+preparation+methods+and+storage+conditions+of+tribromoethanol%5BTitle%5D)+AND+%22Contemp.+Top.+Lab.+Anim.+Sci%22%5BJournal%5D)">An evaluation of preparation methods and storage conditions of tribromoethanol.</a> Contemp. Top. Lab. Anim. Sci. 44, 11-16 (2005).</li>
<li>Meyer, R. E., Fish, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+tribromoethanol+anesthesia+for+production+of+genetically+engineered+mice+and+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Anim%22%5BJournal%5D)">A review of tribromoethanol anesthesia for production of genetically engineered mice and rats.</a> Lab. Anim. 34, 47-52 (2005).</li>
<li>Chatot, C. L., Lewis, J. L., Torres, I., Ziomek, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+1-cell+embryos+from+different+strains+of+mice+in+CZB+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Development of 1-cell embryos from different strains of mice in CZB medium.</a> Biol. Reprod. 42, 432-440 (1990).</li>
<li>Quinn, P., Barros, C., Whittingham, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+of+hamster+oocytes+to+assay+the+fertilizing+capacity+of+human+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Fertil%22%5BJournal%5D)">Preservation of hamster oocytes to assay the fertilizing capacity of human spermatozoa.</a> J. Reprod. Fertil. 66, 161-168 (1982).</li>
<li>Dios Hourcade, de, Perez-Crespo, J., Serrano, M., Gutierrez-Adan, A., A,, Pintado, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+development+of+mice+morulae+after+storage+in+non-frozen+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod.+Biol.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo development of mice morulae after storage in non-frozen conditions.</a> Reprod. Biol. Endocrinol. 10, 62 (2012).</li>
</ol>

作者声明不存在竞争性财务利益。

输精管结扎术是一种相对简单的外科手术技术，不涉及重大操作困难。使用聚维酮碘和乙醇进行消毒时，需确保最后一次乙醇冲洗彻底清除聚维酮碘，因其可能刺激腹膜。手术入路的暴露需 输精管 也可以通过阴囊或在腹部做横向切口来实现8与横腹切口相比，阴囊切口因所需切口较小且术后行为略优，已被推荐使用11然而，我们更倾向于采用腹部切口而非阴囊切口，因为它能更方便、更清晰地暴露手术视野 输精管 来自双侧睾丸，避免初学者外科医生对同一部位重复电凝 输精管 并留下一个功能性 输精管在两种腹部手术技术之间，我们更倾向于采用纵行切口 白线 横切口不切断任何腹肌纤维，因此可避免腹疝的发生。然而，输精管结扎术和子宫输卵管胚胎移植操作步骤可根据现有设备或研究者的个人偏好进行调整。例如，可使用玻璃珠灭菌器加热用于烧灼的镊子 输精管在任何情况下，都必须遵循无菌操作技术，提供适当的麻醉和镇痛，以最大程度地保障动物福利，并遵守当地法规。
另一个可进行修改的方面是麻醉方案。如果...

胚胎移植可能是小鼠模型中最常见的外科手术操作。该技术对于获得经过特定处理的胚胎所产生的后代至关重要 体外 操作技术，因此成为通过原核显微注射、慢病毒转导或嵌合体形成构建转基因模型所必需的步骤。此外，该技术可用于研究植入前发育期间各种损伤对胚胎发育的影响。人工生殖技术的应用1 或暴露于不同物质或代谢物的异常浓度2 可能影响胚胎发育，导致着床或胎盘形成失败，并对子代产生长期影响。一种可靠且可重复的胚胎移植技术对于以一致的方式检测实验处理对着床和胎儿发育可能产生的负面影响至关重要。
小鼠着床前胚胎可根据其发育阶段，移植到假孕受体雌鼠的输卵管中（通过0.5天交配后（dpc）受体的壶腹部进行输卵管移植）3,4，或移植到2.5 dpc假孕受体雌鼠的子宫内（子宫移植）5,6。囊胚阶段的胚胎（例如通过注射胚胎干细胞或诱导多能干细胞制备嵌合小鼠所用的胚胎）通常采用子宫移植。囊胚也可移植至0.5 dpc受体的输卵管，但这种方法对发育干扰因素的检测生理相关性较低，因为胚胎会经历植入前的滞育期，并在着床前有2天时间从损伤中恢复。子宫移植需要使用细针穿刺子宫壁，以形成一个开口，使胚胎操作移液管能够进入子宫腔。尽管该技术可能获得一定成功，但胚胎发育至出生后代的存活率（即移植胚胎中最终发育为仔鼠的比例）通常较低且难以预测7,8。
穿刺子宫壁会带来一些不利的副作用。首先，子宫肌层是一种高度血管化的组织，穿刺常导致少量出血。血液可能堵塞胚胎移植移液管，或侵入子宫腔，引起胚胎死亡和/或着床失败。当移植无透明带的胚胎时，这一问题尤为突出，因为血细胞和碎片可能附着于卵裂球上。其次，穿刺形成的开口在胚胎移植后无法自行封闭，因此当注入子宫的体积过大时，胚胎可能通过该开口反流并被排出至腹腔。本文所述的经子宫-输卵管连接部胚胎移植技术，利用子宫-输卵管交界处将胚胎送入子宫，无需穿刺子宫壁，从而避免了上述不良后果9。
用于胚胎移植的假孕受体雌性小鼠通过与输精管结扎的雄性小鼠自然交配获得8。无生育能力的雄性小鼠产生的精液分泌物可使子宫对移植的胚胎产生接受性。为获得受体小鼠，可在下午将最多2只年龄在8周至6个月之间的雌性小鼠与一只输精管结扎的雄性小鼠合笼。次日早晨检查雌鼠阴道内是否存在交配栓，即来自雄性精液的凝固蛋白团块。由于交配通常发生在午夜，因此检测到阴道栓的当天记为0.5 dpc（受孕后天数）。尽管输精管结扎的雄性小鼠可从某些供应商处购买，但本文所述的手术操作相对简单，且所需器械不超出胚胎移植操作的基本要求。

<table><tbody><tr><td>氯胺酮</td><td>VEDCO</td><td>Ketaved ANADA 200-257</td><td>须由持证兽医订购。</td></tr><tr><td>赛拉嗪</td><td>Lloyd Laboratories</td><td>Anased NADA #139-236</td><td>须由持证兽医订购。</td></tr><tr><td>丁丙诺啡</td><td>通用</td><td>NDC 400-42-010-01</td><td>须由持证兽医订购。</td></tr><tr><td>眼膏</td><td>诺华</td><td>Genteal</td><td></td></tr><tr><td>抗生素</td><td>辉瑞</td><td>Clavamox NADA #55-101.</td><td>加入饮用水中（每毫升含0.3 mg三水合阿莫西林和0.075 mg克拉维酸钾）。将15 ml重悬后的药瓶取1.5 ml加入250 ml水中。</td></tr><tr><td>持针齿镊（直型）</td><td>ROBOZ</td><td>RS-8120</td><td>任何中等尺寸的外科级不锈钢直镊均可使用。</td></tr><tr><td>显微齿镊（带锯齿）</td><td>ROBOZ</td><td>RS-5137</td><td>此类镊子呈90&amp;ordm;弯曲。如需要，也可使用直型镊子。</td></tr><tr><td>微细弯头显微解剖镊</td><td>ROBOZ</td><td>RS-5136</td><td>该型号特别适用于夹持输卵管。</td></tr><tr><td>剪刀</td><td>ROBOZ</td><td>RS-5880</td><td>任何常规的小型外科级不锈钢直剪均可使用。</td></tr><tr><td>27 G针头</td><td>贝克顿-迪金森</td><td>305136</td><td>也可使用更细的针头（30 G）；25 G可能略粗。</td></tr><tr><td>夹钳施加器</td><td>MiKRon</td><td>42763</td><td></td></tr><tr><td>9 mm夹钳</td><td>MiKRon</td><td>427631</td><td></td></tr><tr><td>夹钳移除器</td><td>MiKRon</td><td>7637</td><td>可用两把带齿镊（ROBOZ RS-8160）替代。</td></tr><tr><td>缝合针持</td><td>ROBOZ</td><td>RS-7820</td><td></td></tr><tr><td>缝合线</td><td>Dowist Gell</td><td>5-0 Dexon S 7204-21</td><td>可替换为任何4-0至6-0的可吸收缝线，配细小弯针。</td></tr><tr><td>玻璃毛细管</td><td>VWR</td><td>100 ul校准移液器 53432-921</td><td>包含口吸系统，仅需在管路中连接一个0.22 &amp;#181;m滤器即可使用。更多信息可参见Nagy &lt;em&gt;et al&lt;/em&gt;.&lt;sup&gt;8&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>燃气灯</td><td>KISAG AG</td><td>Typ 2002</td><td>气体驱动的燃气灯，可使用同厂家提供的Kigas气体（CH-4512）。也可使用酒精灯，但燃气灯温度更高，且此型号可提供小而精确的火焰。</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>徕卡</td><td>MZFLIII</td><td>这是一台带荧光功能的高端体视显微镜，也可用于其他用途。也有更经济的选择，例如徕卡MZ8、尼康SMZ-10或SMZ-2B等。建议使用两台体视显微镜，一台用于胚胎操作（无需高端型号），另一台用于受体操作。用于受体的显微镜应具备较长的工作距离，即载物台到物镜之间的距离应足够长，以便能对焦于载物台上方3-4 cm处（输卵管放置位置），同时为手术操作留出空间；大多数体视显微镜具备此功能，但部分型号不能。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>光纤照明系统</td><td>Dolan Jenner</td><td>Fiber lite</td><td>用于照亮手术区域。市面上有多种系统可供选择。</td></tr><tr><td>加热载物台</td><td>American scope</td><td>&lt;a href=&quot;https://exch.mail.umd.edu/owa/redir.aspx?C=1qTJKejamUSfudeYG_MlZHvTY3dsJM9Iaqr2SnwGD4ECWGzB8e8Rpg--_L7u0vJmyatXQJzGQ0k.&amp;URL=http%3a%2f%2fstore.amscope.com%2ftcs-100.html&quot; target=&quot;_blank">http://store.amscope.com/tcs-100.html&lt;/a&gt;</td><td>可放置于体视显微镜的载物台上。若加热台过短，可能需要进行一些改装（如插入支撑杆以调平）。如有条件，可使用较大的加热台为笼盒保温；若无，也可使用普通加热垫，但必须监测温度。</td></tr><tr><td>胚胎操作用培养皿</td><td> Falcon</td><td>353001</td><td>也可使用351008型号；后者形成的液滴更窄。</td></tr></tbody></table>

小鼠模型中的子宫-输卵管胚胎移植与输精管结扎术

Utero-tubal Embryo Transfer and Vasectomy in the Mouse Model

将植入前胚胎移植到代孕雌性个体是生产基因修饰小鼠或研究植入前发育期间表观遗传改变对后续胎儿发育及成年健康影响的必要步骤。采用一种高效且稳定的胚胎移植技术，对于提高基因修饰动物的制备效率、确定不同处理对胚胎着床率及足月存活率的影响至关重要。囊胚阶段的胚胎通常通过子宫移植方式进行移植，即在子宫壁上打孔以插入胚胎操作移液管。然而，移液管撤出后子宫上的穿刺孔无法闭合，由于子宫内正压的存在，胚胎可能流入腹腔。此外，穿刺还可能引起出血，从而影响胚胎着床、堵塞移植移液管，并可能损害胚胎发育，尤其是在移植无透明带（zona）胚胎时更为明显。因此，该技术常导致胚胎存活率总体偏低且结果变异较大。为避免上述不利影响，子宫-输卵管胚胎移植技术利用子宫-输卵管连接处作为天然屏障，防止胚胎外流，并避免对子宫壁进行穿刺。该方法需要使用输精管结扎的雄性小鼠以获得假孕受体。本文还描述了一种输精管结扎术的操作方法，作为子宫-输卵管胚胎移植的配套技术。

子宫-输卵管胚胎移植提供了一种将胚胎移植至子宫的方法，可避免与子宫内胚胎移植相关的一些并发症2,9,10在 表1 我们展示了一些代表性结果，这些结果是通过将经历不同操作处理的CD1囊胚按照所述方案移植到CD1受体小鼠体内获得的。仅进行培养的胚胎与经慢病毒处理的胚胎在存活至出生（发育为仔鼠的胚胎百分比）或存活至E15阶段的比率上相似。 体外 从受精卵阶段（IVC）开始，将胚胎进行iPSC注射以产生嵌合幼崽，以及那些已对其 透明带 移除后暴露于慢病毒中7小时，再进行胚胎移植。因此，子宫-输卵管胚胎移植是一种可靠的胚胎转移技术，尤其适用于较复杂的胚胎，例如那些缺失特定成分的胚胎 透明带 并与慢病毒共孵育。
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子宫-输卵管胚胎移植利用子宫-输卵管连接处作为屏障，防止胚胎在进行子宫移植时发生外流。获取用于胚胎移植的假孕受体需要使用输精管结扎的雄性动物。本文讨论了这两种技术。

将植入前胚胎移植到代孕雌性动物体内是制备基因修饰小鼠或研究相关效应所必需的步骤……

本实验的总体目标是将植入前胚胎移植到2.5天假孕受体小鼠的子宫中。首先暴露卵巢、输卵管和子宫的起始段，然后用针穿刺输卵管。 接着，将一根玻璃毛细移液管穿过孔洞并推进至子宫腔内。最后，将胚胎释放到子宫中。最终，通过出生的仔鼠数量来评估所移植的着床前胚胎的存活情况。与子宫胚胎移植等16种方法相比，该技术的主要优势在于不会穿刺子宫壁，从而避免了出血和胚胎流失。所有动物实验均经贝尔茨维尔地区动物护理与使用委员会批准，符合美国农业部动物护理与使用指南。对一只经证实具有交配能力的雄性小鼠给予麻醉剂和镇痛剂，并确认动物已适当镇静后，将小鼠置于加热台上，使用电动剪毛器去除阴茎上方两条假想横线之间腹侧区域的毛发，这两条线分别位于阴茎上方0.5厘米和2.5厘米处。使用10%聚维酮碘和70%乙醇对剃毛区域进行消毒。接着，用敷料齿镊夹住腹部正中线处的皮肤，在阴茎上方约1厘米处做一个10至15毫米的纵向皮肤切口。然后用解剖齿镊夹住白线，并用显微剪刀剪开肌肉。使用有齿镊夹住一侧睾丸及周围脂肪垫并牵拉，以暴露睾丸、输出小管和附睾。输出小管位于睾丸内侧，呈清晰可辨的游离细管状。用持针器夹持输出小管，同时用灼烧钳夹闭并加热至发红，然后在同一时间点对输出小管进行两点灼烧切断，切断部分长度约为5毫米，并留下两个明显分离的灼烧端。将睾丸、附睾及输精管复位至腹腔内，并对另一侧睾丸重复上述操作。随后，使用5-0可吸收缝线在肌肉层间作一至两针水平褥式缝合，并使用一至两枚伤口夹闭器缝合皮肤。确定雄性小鼠后，将其转移至置于加热载台上的笼子中，并观察至其从麻醉状态恢复。记录输精管切除术转移过程中可能出现的任何情况，并在饮水中添加抗生素。为准备胚胎操作用的玻璃移液管，首先需对玻璃毛细管的尖端进行抛光处理。为避免损坏移液器支架，使用微小火焰加热玻璃毛细管的中部，同时用双手轻轻旋转毛细管，使其局部软化。当毛细管部分变软并具有可塑性时，迅速将其从火焰中移开，并向两端拉伸，使外径缩小至130至150微米。待玻璃冷却后，使用金刚石笔、砂石或指甲锉在细端轻轻划痕，然后从两侧轻轻拉断即可切断。断裂处应整齐且垂直。通过快速火焰灼烧法对尖端进行抛光处理，形成直径为100至130微米的开口，移液管可保存以供后续使用。按照本视频前述步骤完成手术区域准备并评估麻醉效果后，将动物置于加热平台上，使用电动剪毛器去除膝盖至远端肋骨之间背部区域的毛发。将受体移至体视显微镜下的预热载物台上，置于术者侧方的俯卧位。用带孔的无菌毛巾覆盖手术区域，暴露已剃毛的部位，并照亮手术区域。接着，使用敷料镊夹住皮肤，夹持位置位于最后肋骨与髋部连线的前三分之一处，以及背部与腹部连线的背侧三分之一处。使用剪刀在皮肤上做一个一厘米长的横向切口。通过腹壁可看到卵巢或围绕卵巢的脂肪垫。在卵巢或脂肪垫上方的腹壁处做一个0.3至0.5厘米长的横向切口，切口位置应避开较大的血

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

子宫 - 输卵管胚胎移植和输精管结扎术在小鼠模型

一种小鼠模型 在子宫内 移植

通过将子宫组织自体移植至肠系膜动脉级联，对小鼠和大鼠进行子宫内膜异位症手术诱导的描述。...

通过子宫组织自体移植建立手术诱导型子宫内膜异位症小鼠模型

来源： Lutz, D., et al. 在子宫内转导发育中小鼠脑和脊髓后超微结构神经可塑性参数的评估。 J. Vis. Exp.

子宫内小鼠病毒转导

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静脉内和羊膜腔内 子宫内 小鼠模型中的移植

辅助生殖技术（ARTs）正处于持续评估中，以提高治疗效果并降低相关风险。本文描述了一种微创胚胎移植方法，并结合高效的冷冻保存方案，使得兔子可作为人类生殖研究的理想动物模型。...

兔模型中最佳胚胎阶段的微创胚胎移植与胚胎玻璃化冷冻

关于先天性膈疝和胎儿气管阻塞的各种动物模型，在伦理问题、成本、手术难度、体型、存活率以及遗传工具的可获得性方面各有优缺点。该模型为研究气管阻塞及管腔内压力升高对肺发育的影响提供了一种新工具。...

小鼠经子宫胎儿气管阻塞模型

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本文介绍的宫颈操作方法可诱导小鼠假孕，无需使用输精管结扎雄鼠与雌鼠交配。假孕的诱导对于非手术胚胎移植和非手术人工授精的成功至关重要，这两种技术在本文中均有介绍。...

无需使用输精管结扎雄鼠诱导雌鼠假孕以进行非手术胚胎移植或人工授精

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小鼠圆头精子细胞注射

本文介绍了一种建立卵胞浆内单精子注射（ICSI）-胚胎移植（ET）小鼠模型的方案，可用于观察与年龄相关的葡萄糖代谢变化，这些变化可能归因于ICSI技术，从而为该技术对人类发育潜在的长期影响提供见解。...

监测小鼠子代经胞浆内精子注射后的血糖水平

学习子宫输卵管胚胎移植技术在小鼠模型中的应用，通过输精管结扎术获得假孕受体，利用玻璃毛细管将胚胎送入子宫腔。该方法避免子宫壁穿刺，提高胚胎存活率，为生殖生物学研究提供可靠手段。

小鼠模型中的子宫-输卵管胚胎移植与输精管结扎术

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