用于从未处理全血中测量中性粒细胞趋化性的微流控平台

这种微流控技术旨在直接从一滴血液中测量人类中性粒细胞的功能，且该平台可实现多重检测。中央加样室既作为全血来源，又作为16个局部趋化室所产生的趋化因子梯度的汇点。独特的红细胞机械过滤机制使得能够在血液的天然环境中，对其细胞和生化组分背景下的中性粒细胞功能进行检测。

通向局部趋化腔室的通道与从装置流出的通道之间的分叉，可实现对迁移中性粒细胞方向性的定量分析与调控。因此，实验结果能够展示活跃迁移的中性粒细胞如何轻易穿过被截留的红细胞，并随时间推移不断积聚。我们微流控装置的一个独特优势在于其制造和设置过程极为简便。

它们由一层浇铸在微加工晶圆上的PDMS构成，我们将该晶圆键合在玻璃底的单孔或多孔板上。该技术的主要优势在于仅需一滴全血。这些装置可与标准移液器配合使用，无活动部件，无需管路或外接注射泵。

与传统技术相比，该技术的应用前景已延伸至临床领域。我们的方法从采血到中性粒细胞迁移实验仅需数分钟。新型红细胞过滤梳可防止红细胞阻塞中性粒细胞的主动迁移，使本方法区别于其他微流控技术。

这需要在进行化疗检测之前去除血液。红细胞与通道之间的机械性阻塞是本技术的独特之处，使我们能够在包含血清和血小板的全血生理环境中对中性粒细胞进行检测。该技术精确且易于使用，可显著增进我们对中性粒细胞及固有免疫系统在健康与疾病中作用的理解。

根据First pattern制造商的说明，制备主模具晶圆以定义迁移通道。首先，图案化一层3微米厚的基于环氧树脂的负性光刻胶，然后图案化第二层50微米厚的光刻胶，以定义细胞加载腔和趋化因子腔。接下来，为了浇铸聚二甲基硅氧烷（PDMS）装置，将20克PDMS与2克引发剂剧烈混合5分钟。

将PDMS小心地倾倒到带有图案的晶圆上，并在真空干燥器中脱气一小时。然后将PDMS微流控器件置于65°C的烘箱中加热固化至少三小时。为确保PDMS在正确温度下烘烤，请务必使用温度计监测烘箱内部温度。

使用直径为1.5毫米的打孔器取出中央全血加样腔。同时使用直径为5.0毫米的打孔器取出完整的环形装置。使用粘性胶带去除环形装置中的颗粒。

接下来，将多孔板放入60摄氏度的烘箱中加热五分钟，然后用去离子水冲洗多孔板，并用氮气吹干。进行35秒的氧气等离子体处理。随后加入环形装置并进行氧气等离子体处理。

再次处理35秒。小心将器件转移至孔板的孔中，并将带有键合器件的孔板置于80摄氏度的加热板上烘烤10分钟。经过氧气等离子体处理后，器件表面具有亲水性，毛细作用可促进器件内微小通道的预润湿。

对于趋化因子溶液，将5微升10微摩尔的FMLP与5微升1毫克/毫升的纤连蛋白以及490微升HBSS混合。用移液器缓慢将趋化因子溶液加入全血加样室的移液管中，并在装置外周再加入20微升趋化因子溶液。将培养板置于干燥器中15分钟。

对装置施加真空，以使趋化因子溶液充分填充装置。将培养板从干燥器中取出，通过观察气泡逐渐缩小来确认装置通道已被润湿。随后彻底清洗全血加样室及装置外部，以去除多余的趋化因子溶液。

接下来，从每个中心趋化室向装置中心产生趋化剂浓度梯度。轻轻将100 µL PBS注入孔中，使PBS液滴形成于装置表面。倾斜培养板，并用移液器将1 mL PBS沿装置周围加入，使其汇集于孔底，吸去液体，并重复PBS洗涤三次。

接下来，向每个孔中加入培养基以浸没装置，并静置15分钟使浓度梯度稳定。然后缓慢地将2 µL全血通过移液器加入每个全血加样室中。对于指尖采血，需先用肥皂和水洗手。

将皮肤干燥后作为抗凝剂染色液使用。加入一毫升0.2%人血清白蛋白（HSA）和10微升32.4微摩尔的钩状物。染色后，用肝素抗凝采血管刺破健康供体的手指，并擦去第一滴血液。

将50微升血液收集至抗凝染色液中，轻轻混匀。设置生物培养箱为37摄氏度、80%湿度和5% CO2。立即开始延时成像，放大倍数为10倍或更高，为获得有意义的统计分析结果，需手动追踪每份样本中至少50个中性粒细胞。

随时间计数进入局灶性趋化室的细胞。然后使用 ImageJ 计算中性粒细胞在白细胞通道（WBLC）与局灶性趋化室（FCC）之间通道内的迁移速度。为量化中性粒细胞的定向性，计数通过分叉点的细胞数量，并计算转向局灶性趋化室的细胞数与离开装置的细胞数之间的比值。

非定向细胞不遵循趋化梯度，因此会以相等数量向FCC和出口通道迁移。在本实验中，通过检测中性粒细胞向FMLP梯度的聚集情况，验证了全血中性粒细胞趋化实验的有效性。结果证实，红细胞被过滤梳捕获，而中性粒细胞能够主动从全血中迁移出来。

通过使用FSE标记的葡聚糖，确认了全血微流控装置形成的稳定线性趋化因子梯度，并随时间测量了荧光水平。利用新型全血趋化迁移平台获得的结果显示，来自各种血液来源的中性粒细胞均以一致的速度迁移，且总迁移细胞数量相似。重要的是，该系统能够对中性粒细胞进行定量，从而可区分趋化性与趋化运动。一旦掌握，若操作得当，该技术可在不到10分钟内完成。

采用标准的洁净室技术与设备，可将我们的装置整合至12孔或24孔板中，从而实现多种条件的同步筛选。利用该技术，我们能够在单细胞水平上测量中性粒细胞的迁移速度和方向性。与传统的测量群体细胞终末迁移量的方法不同，需注意仔细预润微流控装置，并缓慢加载两种样品，以防止红细胞被推过装置的通道中心。

该方案特别适用于检测中性粒细胞趋化功能的短暂缺陷，可实现多个时间点的重复取样，也可经调整后用于测量其他模式生物中不同类型细胞的迁移。该方法有助于了解多种易发生感染疾病的患者中性粒细胞功能的暂时性改变，包括创伤患者、重大手术后患者以及接受化疗的癌症患者。