Name: 测试果蝇用Y型迷宫测定嗅觉 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: 学习使用Y型迷宫测定果蝇嗅觉行为的简单方法。通过饥饿处理增强探索动机，利用滤纸上的气味源评估Drosophila melanogaster对不同气味剂的偏好反应。该方案为神经科学研究提供了可重复的行为学工具。

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感谢4位匿名审稿人对本文稿的改进所做出的贡献。感谢法国国家科学研究中心（CNRS）为MBG和YG提供的经费支持，感谢勃艮第大学和法国研究部对MMS的支持。YG实验室的研究工作由欧洲研究委员会（ERC启动基金，GliSFCo-311403）、法国国家科研署（ANR-JCJC，GGCB-2010）、勃艮第大区议会（Faber）以及法国国家科学研究中心（CNRS）资助。

1. 开始前准备
<ol>
	<li>使用具有稳定且显著行为表型的同源化参考品系。由于所有潜在的对照品系可能携带异质的背景等位基因，因此选择该品系并无通用规则。</li>
	<li>使用此对照品系对后续步骤所需的每一个品系进行回交。该回交步骤通常包括至少连续5代，将单只处女雌蝇（以允许同源染色体之间可能发生交换）与2–3只同源参考雄蝇进行交配5。此步骤对于使不同果蝇品系之间的遗传背景均一化至关重要。</li>
	<li>将Drosophila品系饲养于标准培养基中，培养基成分为玉米粉（9%）、酵母（10%）和琼脂（1.5%），并添加抗生素（0.4%对羟基苯甲酸甲酯），在25 °C、12小时光照/12小时黑暗循环条件下培养。</li>
	<li>在温度可控的房间（25 °C）内、远红光条件下进行化学感受实验（以消除视觉线索的干扰，专注于化学感受信号）。每次实验之间应定期更换室内空气，以确保实验区域通风。</li>
</ol>
2. 使用Y型迷宫实验检测嗅觉反应
<ol>
	<li>在测试前，将果蝇置于含有湿润纸巾的玻璃管中，在25 °C下饥饿处理16–18小时。</li>
	<li>将Y形连接器连接至两个玻璃小瓶和一个较小的塑料小瓶（上样瓶）。使用1 ml移液枪吸头穿过泡沫塞，将连接器与三个小瓶相连，形成密封良好的Y形迷宫。剪下两个移液枪吸头的细端（约2 mm直径，以防止果蝇做出选择后返回），制成两个“陷阱”小瓶；再剪下一个移液枪吸头的粗端，制成“上样”管图1A).</li>
	<li>连接“trap”瓶之前图1B），在每个小瓶中放入一片直径约6 mm的滤纸。在一片滤纸上加入40 μl气味物质溶液，在另一片滤纸上加入40 μl相应的溶剂。</li>
	<li>将10只4至9日龄的果蝇引入“装载”小瓶中。不要使用CO2 转移过程中的麻醉，因为它对行为有显著影响10。建议采用短暂冷却处理&#160;冰。正确操作麻醉后的果蝇对于尽可能减少实验对象的应激至关重要。
	<ol>
		<li>在25 °C下，使用远红光（采用LED灯泡以避免可能的热源干扰）进行一系列Y迷宫实验，尽可能减少视觉刺激。注意交替Y迷宫的方向（气味物质所在的管道置于左侧或右侧，进样管道置于前方或后方）； 图1C).</li>
		<li>让果蝇在含有气味物质或溶剂的诱捕小瓶中停留数小时。24小时后计数果蝇，以使参与率提高至80%以上，并获得最大的嗅觉指数值（Simonnet，个人通讯）。</li>
		<li>使用以下公式计算所得的嗅觉指数：（气味管中的果蝇数量 - 溶剂管中的果蝇数量）/ 加载的果蝇总数。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Y迷宫装置清洗步骤如下：将拆卸后的装置在RBS 35 MD中浸泡过夜，用自来水彻底冲洗，最后用去离子水冲洗并晾干。</li>
</ol>
3. 数据的统计分析
<ol>
	<li>根据数据和变量类型，进行 t 检验、单因素方差分析或双因素方差分析。</li>
</ol>

<ol><li>Mombaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+and+ligands+for+odorant%2C+vomeronasal+and+taste+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors.</a> Nat. Rev. Neurosci. 5, 263-278 (2004).</li>
<li>Silbering, A. F., Benton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionotropic+and+metabotropic+mechanisms+in+chemoreception%3A+%27chance+or+design%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Ionotropic and metabotropic mechanisms in chemoreception: 'chance or design.</a> EMBO Rep. 11, 173-179 (2010).</li>
<li>Ziegler, A. B., Berthelot-Grosjean, M., Grosjean, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+smell+of+love+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The smell of love in Drosophila.</a> Front. Physiol. 4, (2013).</li>
<li>Silbering, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementary+function+and+integrated+wiring+of+the+evolutionarily+distinct+Drosophila+olfactory+subsystems%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Complementary function and integrated wiring of the evolutionarily distinct Drosophila olfactory subsystems.</a> J. Neurosci. 31, 13357-13375 (2011).</li>
<li>Grosjean, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+olfactory+receptor+for+food-derived+odours+promotes+male+courtship+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An olfactory receptor for food-derived odours promotes male courtship in Drosophila.</a> Nature. 478, 236-240 (2011).</li>
<li>Woodard, C., Huang, T., Sun, H., Helfand, S. L., Carlson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+olfactory+behavior+in+Drosophila%3A+a+new+screen+yields+the+ota+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of olfactory behavior in Drosophila: a new screen yields the ota mutants.</a> Genetics. 123, 315-326 (1989).</li>
<li>Semmelhack, J. L., Wang, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Select+Drosophila+glomeruli+mediate+innate+olfactory+attraction+and+aversion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Select Drosophila glomeruli mediate innate olfactory attraction and aversion.</a> Nature. 459, 218-223 (2009).</li>
<li>Budick, S. A., Dickinson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free-flight+responses+of+Drosophila+melanogaster+to+attractive+odors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Free-flight responses of Drosophila melanogaster to attractive odors.</a> The Journal of Experimental Biology. 209, 3001-3017 (2006).</li>
<li>Martin, F., Charro, M. J., Alcorta, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+affecting+the+cAMP+transduction+pathway+modify+olfaction+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol.+A%22%5BJournal%5D)">Mutations affecting the cAMP transduction pathway modify olfaction in Drosophila.</a> J. Comp. Physiol. A. 187, 359-370 (2001).</li>
<li>Barron, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anaesthetising+Drosophila+for+behavioural+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Anaesthetising Drosophila for behavioural studies.</a> Journal of Insect Physiology. 46, 439-442 (2000).</li>
<li>Ai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acid+sensing+by+the+Drosophila+olfactory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Acid sensing by the Drosophila olfactory system.</a> Nature. 468, 691-695 (2010).</li>
<li>Becher, P. G., Bengtsson, M., Hansson, B. S., Witzgall, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flying+the+fly%3A+long-range+flight+behavior+of+Drosophila+melanogaster+to+attractive+odors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Flying the fly: long-range flight behavior of Drosophila melanogaster to attractive odors.</a> J. Chem. Ecol. 36, 599-607 (2010).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

我们的Y型迷宫实验方案基于先前描述的方案9，但引入了两个主要改进。首先，我们使用细口移液吸头，以防止果蝇在进入装有溶剂或溶剂加气味物质的试剂瓶后折返。这些细口吸头还有助于限制气味物质在Y型迷宫中的扩散。其次，我们采用较小的装载试剂瓶，迫使果蝇进入Y型迷宫。确保这些果蝇的高参与率至关重要（24小时后达到80%至100%；Simonnet，个人通讯）。
这种Y迷宫实验是一种评估果蝇化学感受反应的有效方法。Drosophila在测试过程中所处的环境因素（例如气流对果蝇造成的应激、加样步骤中对果蝇的操作等）可能会影响其嗅觉反应。这些环境因素至关重要，至少在一定程度上可以解释为何不同研究会得到不同的行为结果。例如，乙酸在某些条件下表现为驱避性&#160;4,11，而在其他条件下则表现为吸引性12。因此，尽可能严格控制这些参数十分关键。
该Y型迷宫实验的一个可能局限性在于其实验环境对果蝇而言较为人为化，因为果蝇被限制在固定的装置中。此外，果蝇必须进入狭窄的...

通过味觉或嗅觉进行的化学感受是动物生存的关键感觉方式。它为动物探测危险或食物来源以及进行社会交往提供了必要的关键线索，同时也帮助动物寻找繁殖所需的配偶。二十多年来，科研人员开展了大量研究，包括理查德·阿克塞尔（Richard Axel）和琳达·巴克（Linda Buck）在2004年因“发现气味受体和嗅觉系统的组织方式”而获得诺贝尔奖的工作&#34;for their discoveries of odorant receptors and the organization of the olfactory system&#34;，以揭示嗅觉的分子与细胞基础1,2。
科学家研究嗅觉感知时最常用的动物模型之一是黑腹果蝇（D. melanogaster）。这种昆虫在气味编码的细胞和分子机制方面与哺乳动物具有相似性。科学界采用多种行为范式来研究气味物质在该果蝇中的作用，其中包括多模态检测方法，例如求偶试验，在该试验中包括嗅觉在内的多种感觉模态对诱发雄性求偶行为至关重要3。此外，还开发了其他一些更特异性地探究气味物质作用的检测方法，包括T型迷宫、Y型迷宫、陷阱试验、四区实验 arena 及风洞装置4,5,6,7,8。
本文介绍了一种简单的改良Y型迷宫实验方法，该方法可利用可靠的嗅觉反应 D. melanogaster我们的装置采用末端尖端，与之前描述的方法相反。9因此，我们的Y型迷宫具有两个优点。首先，果蝇一旦做出选择，系统可避免其折返。其次，它限制了Y型迷宫各区域之间气味分子的交换。最后这一优点至关重要，因为 果蝇 对气流非常敏感，而气流常被用于避免气味分子饱和。若调整实验装置以引入气流，将耗费较多时间和成本。因此，我们的Y型迷宫实验提供了一种高效且快速检测嗅觉功能的方法 果蝇.

<table><tbody><tr><td>果蝇聚苯乙烯管</td><td>VWR europe</td><td>734-2255</td><td>30 x 25 mm&amp;nbsp;&lt;br/&gt; Y型迷宫</td></tr><tr><td>果蝇硼硅酸盐玻璃管</td><td>Dijon verre</td><td></td><td>95 X 25 mm&lt;br/&gt; Y型迷宫</td></tr><tr><td>泡沫塞</td><td>Dutscher</td><td>999038</td><td>&lt;br/&gt; Y型迷宫</td></tr><tr><td>Y型连接器</td><td>Europrix</td><td>11020605</td><td>&lt;br/&gt; Y型迷宫</td></tr><tr><td>100-1,000 &amp;micro;l 移液器吸头</td><td>Corning</td><td>4868</td><td>将以下移液器吸头连接至Y型连接器。从宽端起截取2个移液器吸头，长度为65 mm，并将窄端（开口约&amp;sim;2 mm）连接至2个测试小瓶。这些开口可限制果蝇进入含气味物质的管道后发生U型转弯。另取1个移液器吸头，从宽端起截取35 mm，并将其连接至加样小瓶。&lt;br/&gt; Y型迷宫</td></tr><tr><td>远红光LED灯泡</td><td>Rubin-Lacaque</td><td>0RB180238</td><td>625-630 nm</td></tr><tr><td>乙酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>45725</td><td></td></tr><tr><td>苯乙酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P16621</td><td></td></tr><tr><td>酵母</td><td>Sensient Flavors Strasbourg</td><td>1018880464</td><td></td></tr><tr><td>玉米粉</td><td>eurogerm</td><td>Farine de ma&amp;iuml;s</td><td></td></tr><tr><td>琼脂</td><td>Kalys</td><td>HP-697-25</td><td></td></tr><tr><td>对羟基苯甲酸甲酯</td><td>VWR international</td><td>25605293</td><td></td></tr></tbody></table>

测试 果蝇 使用y迷宫实验进行嗅觉测试

Testing Drosophila Olfaction with a Y-maze Assay

感知环境中的信号对于动物的生存至关重要。为此，动物会利用多种环境线索，例如视觉、机械感受、听觉，以及通过直接接触或味觉进行的化学感知，或通过嗅觉感知远距离作用的挥发性分子。挥发性化学分子对大多数动物而言是极为重要的信号，可用于探测危险、寻找食物来源，或实现个体间的交流。Drosophila melanogaster 是科学家研究嗅觉细胞与分子基础时最常用的生物模型之一。为了突出这种小型昆虫的嗅觉能力，本文介绍了一种基于经典小鼠Y型迷宫实验改进的选择性行为检测方法。利用Y型迷宫所获得的数据，能够为理解动物如何应对持续变化的环境提供重要信息。本文将逐步介绍使用该Y型迷宫实验研究气味物质对果蝇探索行为影响的实验方案。

图1D展示了使用该Y型迷宫实验的两个代表性反应。Canton-S品系雄性果蝇对用蒸馏水稀释的10%乙酸表现出强烈回避，而对10%苯乙酸则无明显回避行为。这些实验每组重复使用10只雄性果蝇，共同置于加样小瓶中。该方案有时会导致平均值的标准误较大。如有需要，可通过将每组重复的果蝇数量从10只增加至20只来减少这一缺陷。从数学角度而言，个体选择在较大样本量下对指数值的影响权重更低。
<img alt="Y型迷宫选择实验，嗅觉反应；实验装置，数据分析，显著性指数图。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51241/51241fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51241/51241fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 利用Y型迷宫装...

我们介绍了一种利用Y型迷宫实验揭示气味物质对Drosophila行为影响的选择实验。

测试 果蝇 使用Y迷宫实验进行嗅觉测试

检测来自环境的信号对于动物确保其生存至关重要。为此，它们利用视觉等环境线索，……

本实验的总体目标是提供一种简单的Y迷宫检测方法，用于测试黑腹果蝇（Drosophila melon Gaster）的嗅觉功能。首先，将果蝇饥饿处理16至18小时，以增强其探索含有挥发性刺激物新环境的动机。实验的第二步是组装Y迷宫装置，其中包含置于滤纸上的气味源，例如溶剂中的乙酸与单独溶剂的对比。第三步是快速而轻柔地将果蝇引入上样管中。数小时后，最后一步是记录果蝇在迷宫中的位置。最终，根据Y型迷宫获得的数据可以显示出果蝇对气味物质的反应。 当我们决定开发一种简单且低成本的方法来检测不同动物门类的嗅觉反应时，首次提出了该方法的设想。与其它可选方法相比，该技术的一个优势在于，它允许果蝇在无过度应激的情况下自主做出选择。演示本实验操作的是我实验室的博士研究生 Megan Simon。在进行本方案前，需准备一个经过近交纯化、具有稳定且显著行为表型的果蝇品系。在嗅觉测试中，任何此类品系均可作为各实验所用遗传品系的参照对照；为确保遗传背景一致，需将待测品系与参照品系回交五代。每次回交时，将单个实验品系的雌蝇与几只同基因型雄蝇配对。用于嗅觉实验时，在标准玉米粉培养基中饲养果蝇，并添加抗生素，光照周期为12小时光照:12小时黑暗，温度保持在25摄氏度。实验应在 25 摄氏度下进行，并在果蝇不可见的远红光光谱下光照。每次实验之间必须能够完全通风，以便在次日早晨进行检测前保持环境稳定。每天结束时，将包含 10 至 20 个实验品系的群体转移至玻璃小瓶中，并通过湿毛巾提供湿度。必须在16至18小时内对果蝇进行测试，否则它们可能因脱水或饥饿而在次日死亡。组装Y型迷宫。首先使用带有修剪过移液管尖端的泡沫连接器将Y形连接器与两个玻璃小瓶连接，其锥形结构使导管形成单向通道。Y形结构的第三分支连接一根由移液枪头较大部分制成的加样管，使样品可从加样瓶通向迷宫的选择点。每条逐渐变细的通道末端均连接一个玻璃小瓶，其中一瓶必须加入有气味的物质。这些物质为40 µL的液体，被吸收在28 mm见方的滤纸片上。进行测试时，应随机交替选择两个含有气味剂的容器。将果蝇短暂置于冰上，使其活动减缓。操作应在LED灯发出的远红光下、25摄氏度条件下进行，轻柔地将一群果蝇倒入加载管中，并将测试用果蝇装入Y型迷宫。不要使用气体麻醉。将果蝇快速且轻柔地转移到上样管中非常关键。这实际上是本实验中最困难的步骤，因为果蝇必须在Y型装置中的其他果蝇扩散之前迅速苏醒。应让果蝇在迷宫中探索24小时，以便尽可能多的果蝇移动至其中一个玻璃小瓶中。不同管中果蝇的数量用于计算嗅觉指数。应对从最多10只果蝇行为中获得的该数值应用标准统计学方法。如果10组果蝇群体未能提供一致的结果，可使用20组果蝇群体重复实验。为清洁迷宫组件，需将其拆卸后浸泡于RBS 35 MD溶液中过夜。随后用自来水冲洗，再用去离子水进行最终冲洗，然后自然晾干。对气味物质的标准反应。利用Y型迷宫可观察到趋近、无动于衷或回避等行为。例如，果蝇对10%乙酸表现出强烈的回避反应，而对10%苯乙酸则不回避。在尝试该实验流程时，重要的是要认识到，这种波阵列检测方法为果蝇提供了一个人工环境。可采用类似团队协作完成的竞技场实验或体内检测等方法，进一步验证果蝇在不同条件下的嗅觉反应。观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用SW波阵列检测方法简便地测试果蝇的嗅觉反应。

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Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

测试<em&gt;果蝇</em&gt;用Y型迷宫测定嗅觉

在本视频文章中，我们介绍了一种构建具有稳定且可控几何形状的气味梯度的新方法。我们简要说明了如何利用这些梯度来筛查嗅觉缺陷（完全性与部分性嗅觉丧失），并研究趋化行为中更为细微的特征。...

高分辨率测量果蝇幼虫的嗅觉驱动行为

用于测量运动功能、学习和记忆能力的行为学实验 果蝇.

评估运动、学习和记忆功能障碍 果蝇 神经退行性疾病模型

Drosophila melanogaster 是一种遗传和行为上易于操作的模式生物系统，一个多世纪以来已被用于研究许多重要生命过程的分子与细胞基础1。Drosophila...

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果蝇具有复杂的嗅觉系统，能够区分数百种气味分子，并利用嗅觉来指导其行为决策。本视频介绍了四通道嗅觉仪检测法，这是一种研究果蝇嗅觉行为反应的方法。视频重点展示了如何处理待测果蝇，以及在实施检测过程中的关键步骤。...

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本视频介绍了一种用于检测果蝇嗅觉探索行为的方法，称为Y型迷宫法。所展示的实验方案片段演示了如何搭建并实施该检测。...

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Drosophila 成年果蝇嗅觉休克学习

本文描述了一种用于检测节肢动物行为反应的垂直T型迷宫嗅觉仪。该嗅觉仪可使实验者测量受试对象在两种潜在气味场作用下的选择行为。利用此装置可测定动物对气味物质的趋性及避性反应。...

垂直T型迷宫选择实验用于节肢动物对气味物质的反应分析

在本视频文章中，我们描述了一种自动化检测方法，用于测量饥饿或饱腹状态对成年果蝇Drosophila...

一种用于果蝇觅食行为的单体检测方法 果蝇

本文介绍了一种用于量化受胁迫个体回避行为的实验方案。该范式具有强大功能且操作简便，可用于评估基因和环境对黑腹果蝇（Drosophila...

社会回避定量检测的简易实验方法 黑腹果蝇

本文介绍了一种用于检测多达100只醋蝇（Drosophila...

通过计算机追踪检测的嗅觉行为 果蝇 四象限嗅觉仪中

自闭症谱系障碍（ASD）与社交和沟通行为受损以及重复性行为的出现相关。本文描述了在黑腹果蝇（Drosophila）模型中研究ASD相关基因与行为缺陷之间相互关系的五种行为范式，用于检测社会间距、攻击性、求偶、理毛以及习惯化行为。...

自闭症谱系障碍的Drosophila模型中的行为评估范式

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