利用可连接荧光探针评估实验性脑卒中中的细胞死亡吞噬清除作用

本实验的总体目标是选择性地标记在脑卒中过程中清除细胞碎片的活化吞噬细胞。首先，需要制备基于Tite的信号放大反应所需的组分；第二步是制备组织切片。

接下来，使用痘苗病毒酶、拓扑异构酶和可裂解的荧光探针进行标记反应。最后一步是基于IDE的荧光信号增强。最终，采用荧光显微镜检测局灶性脑缺血组织切片中死亡细胞的吞噬清除情况。

吞噬细胞清除死亡细胞在脑缺血后的恢复过程中起着重要作用。本方法通过仅标记那些主动清除死亡细胞的巨噬细胞，来测定该过程的效率。尽管该方法可用于研究缺血性脑损伤，也可用于研究其他器官和组织中的缺血性损伤。

在FA中，酸性清除死亡细胞的过程非常重要。尽管IDE信号放大或TSA步骤发生在标记的最后阶段，但准备该反应可能需要一个多小时。因此，首先制备TSA试剂更为方便。

第一步是制备荧光素四 TYROM 储存液，将 300 微升 DMSO 加入 TSA 标记试剂盒中包含的 tyrom 试剂瓶中。接下来，配制 TNT 洗涤缓冲液以完全溶解封闭试剂。在配制 TNB 封闭缓冲液时，需在搅拌的同时缓慢分次少量加入，并将溶液逐渐加热至 55 摄氏度。

持续搅拌下，溶液将呈现乳白色，使用前应恢复至室温，并分装后于负20摄氏度长期保存。本实验所用载玻片需预先制备，将甲醛固定组织切成5 µm厚切片并贴附于载玻片上。首先，用二甲苯处理切片15分钟，然后通过一系列乙醇洗涤使切片复水，再用蒸馏水洗涤两次。

接下来，通过将蛋白酶K的贮存液用PBS稀释至50微克/毫升，配制蛋白酶K工作液。本实验中最困难的部分是确定蛋白酶K消化的最佳时间，可能需要设置较短和较长的消化时间对照，以确保实验成功，具体时间取决于组织的大小和类型。向切片中加入适量的蛋白酶K工作液，在23°C下孵育15分钟。

孵育结束后，用蒸馏水洗涤切片两次，每次五分钟。在切片浸泡的同时，准备含有活性探针的标记混合液。制备活性探针溶液时，将寡核苷酸与水、1 M Tris-HCl以及试剂盒提供的痘苗病毒拓扑异构酶混合，用移液器轻轻吹打混匀，室温孵育15分钟以完成探针活化。

第二次洗涤后，从染色缸中取出切片，并吸去残留的水分。准备好后，加入先前配制的活性探针溶液覆盖切片，放入切片并置于23°C孵育15分钟。

孵育结束后，将载玻片浸入水中，轻轻取下盖玻片。用水洗涤载玻片三次，每次五分钟。最后一次洗涤后，用 TNB 封闭缓冲液覆盖组织切片，并在湿盒中室温孵育 30 分钟。

在此期间，用TNB封闭缓冲液配制链霉亲和素-辣根过氧化物酶结合物（S-A-H-R-P）的一比一百稀释液，取出玻片并吸除TNB封闭缓冲液。在加入S-A-H-R-P溶液前，需使用足量试剂完全覆盖整个组织切片。

覆盖后，将载玻片在室温下孵育30分钟。孵育结束后，在室温下用TNT洗涤缓冲液将载玻片洗涤三次，每次五分钟。使用前立即用1×扩增稀释液将Fluoro Four TY IDE原液按1:50比例稀释，混匀。用移液器将该溶液加至载玻片上，确保完全覆盖组织切片。

由于溶液不能重复使用，需丢弃任何剩余未用的部分。将载玻片在室温下孵育3至10分钟，并观察荧光情况。

在显微镜下继续增加放大倍数，直到此时首次出现结构的迹象。立即进入洗涤步骤。将玻片洗涤三次，每次五分钟。

在室温下用TNT洗涤缓冲液振荡洗涤。洗涤后，加入含DPI的抗荧光淬灭剂，并加盖盖玻片。在荧光显微镜下观察结果。

这些图像展示了PHA酸性清除的两个示例。细胞核染色dappy显示为蓝色荧光，而可溶性vac topo探针显示为绿色荧光。这些图像中所示事件的图示显示了吞噬细胞的细胞核，以及处于不同消化阶段的被吞噬的额外细胞核。一旦掌握，该技术若操作得当，约需三小时即可完成。

观看本视频后，您将了解如何在组织切片中使用可靠的荧光探针。您还将能够选择性地标记在缺血性脑组织中清除死亡细胞的活化小胶质细胞。