相关的mRNA分离与酵母线粒体研究本地化翻译的机制

该程序的总体目标是分离与翻译 mRNA 相关的线粒体。这是通过首先收获在线粒体富集条件下生长的酵母细胞来实现的。第二步是在 cyclo heide 存在下轻轻地虱子细胞。

接下来通过差速离心将线粒体与可溶性成分分离。最后一步是从线粒体和对照样品中提取 RNA。最终，Northern 分析用于显示线粒体相关 RNA 的纯度和质量。

该技术的主要优点是可以在一次制备中分离多种类型的 RNA。因此，可以进行比较分析。这种方法可以帮助回答细胞生物学中的关键问题，例如细胞内靶向和器官功能。

在此过程中，线粒体将从 100 到 150 处纯化。在不可发酵的生长中，毫升酵母细胞在 30 摄氏度下生长到 1 到 1.5 的 OD 600 到 1.5。中等。在室温下以 3000 倍重力离心细胞 5 分钟，弃去上清液，再次用双蒸水离心机洗涤沉淀。

弃去上清液后，称量细胞沉淀。通常从 100 毫升细胞中获得约 0.6 克。Resus 将沉淀悬浮在每 0.5 克细胞 1 毫升 DTT 缓冲液中。

重要的是用还原剂处理细胞，以打破细胞壁内的二硫化键，从而提高水解效果。将细胞在 30 摄氏度下轻轻摇动孵育 10 分钟。接下来，在室温下以 3000 倍重力离心细胞 5 分钟。弃去上清液并重悬沉淀。

每 0.15 克细胞在 1 毫升 xmal liase 缓冲液中不要涡旋。在 990 微升水中测量 10 微升等分试样细胞的 OD 600 并记录该值。将新鲜制备的 xmal 连接酶添加到细胞中，以在 β 1 3 葡聚糖键处水解葡萄糖聚合物并生成球形塑料。

从这里开始，Sphero 塑料应保存在等渗溶液中以避免裂解，将细胞在 15 摄氏度下孵育 30 分钟，轻轻摇动。为了验证细胞壁和质体生成的球体的水解，将 10 微升细胞与 990 微升水混合并测量 OD 600 球形平台由于渗透差异而预计会虱子，OD 600 应至少比添加 xmal 连接酶之前确定的值小十倍。如果没有，请继续与 xmal 连接酶一起孵育 15 分钟。

用 100 毫升回收培养基重新悬浮 Plast 的 PHE，并将塑料球转移到 Helen Meyer 烧瓶中。在 30 摄氏度下振荡孵育 1 小时。这个恢复步骤是必要的，因为在 XYs 治疗期间翻译被停滞并且 mRNA 定位被破坏。

1 小时后，加入 0.1 毫克/毫升，环状 heide，并将球状塑料转移到预冷的 50 毫升锥形管中。Cyclo Heide 版对于冻结核糖体与 mRNA 的结合很重要。因此，核糖体依赖性 mRNA 与线粒体的关联得以维持。

离心，将球体在 3000 倍重力下在 4 摄氏度下离心 5 分钟。弃去上清液，用冷甘露醇洗涤两次。Buffer reus 的 Buffer reus 中。

用 4 毫升冷马尼托尔缓冲液悬浮 plass 球体，并将悬浮液转移到配备紧密贴合杵的 15 毫升容量的羽绒均质器中。轻轻敲打 15 次 plass 球体，然后将裂解物转移到 13 毫升试管中。将裂解物以 1， 500 倍重力在 4 摄氏度下离心 6 分钟。

沉淀细胞核和未破碎的细胞。小心地将 super natin 转移到新试管中。留出 1 毫升或 25% 的样品作为未分级或总样品。

将 50 μL 的该样品转移到新试管中，并加入 15 μL 的 4 个 XLSB。对于蛋白质血液分析，将从总样品的其余部分沉淀 RNA，用于 Northern 和微阵列分析。将超级纳丁离心 10， 000 倍。

在 4 摄氏度的重力下 10 分钟。要沉淀线粒体，请将 super natin 转移到新管中并保持在冰上。这是胞质部分。

将 50 μL 的该样品转移到新试管中，并加入 15 μL 的 4 个 XLSB。对于蛋白质印迹分析，将从胞质样品的其余部分沉淀 RNA，用于 Northern 和微阵列分析。用 3 毫升甘露醇洗涤沉淀，缓冲并再次离心 10， 000 倍。

在 4 摄氏度的重力下 10 分钟。Reus 用 3 毫升甘露醇缓冲液悬浮沉淀。该样品包含线粒体，称为线粒体分数。

将 50 μL 该样品转移到新试管中，并加入 15 μL 的 4 XLSB 用于 Western 印迹分析。要开始此过程，请向每个样品中加入 1 体积的 8 摩尔 guad dium、HCEL 和 2 体积的 100% 乙醇涡旋，并在零下 20 摄氏度下孵育至少 2 小时。将样品在 4 摄氏度下以 10， 000 倍重力离心 20 分钟。

丢弃上清液。小心，因为颗粒可能不稳定。用 70% 乙醇混合物洗涤沉淀后，用 400 μL 不含 RNA 的水悬浮沉淀，并将样品转移到新的潜入管中。

通过加入 0.1 体积的 3 摩尔乙酸钠 pH 5.2 和两个体积的 100% 乙醇涡旋，再次沉淀 RNA，并在零下 20 摄氏度下孵育至少两个小时。将样品离心 20， 000 次。在 4 摄氏度的重力下 20 分钟。

弃去上清液，用 70% 乙醇洗涤。风干沉淀并复苏，悬浮有 RNA，不含水，储存 RNA。零下 80 摄氏度的样品。

样品随后可用于 Northern 或微阵列分析。为了制备用于微阵列分析的 RNA，首先用 650 微升 RNA 游离水悬浮从 guin HCL 和乙醇沉淀中获得的每个 mRNA 沉淀，并转移到螺旋盖孤儿管中。然后加入 650 微升酸性苯酚氯仿，并以最大速度剧烈涡旋离心 2 分钟。

将 500 μL 的上层水相转移到新试管中。避免服用间期，因为它含有 DNA。还要注意避免服用苯酚，苯酚会抑制逆转录反应。

通过氯化锂沉淀从 RNA 样品中去除肝素。加入氯化锂至终浓度为 2 摩尔，并在第二天在零下 20 摄氏度下孵育样品过夜。在 4 摄氏度下解冻样品，并在 20， 000 次下离心。

在 4 摄氏度的重力下 20 分钟。小心弃去上清液，用 80% 乙醇离心机洗涤沉淀。再次弃去上清液风干并重新悬浮沉淀在 150 微升不含 RNA 的水中以去除任何残留的氯化锂沉淀物，再次用 0.1 体积的三摩尔乙酸钠 pH 5.3 和三个体积的 100% 乙醇在零下 20 摄氏度孵育至少两个小时。

在 4 摄氏度下以最高速度离心 20 分钟。用 80% 乙醇小心洗涤透明沉淀并风干。最后，用 25 微升不含 RNA 的水重悬沉淀，并将样品保持在零下 80 摄氏度。

该方案在从胞质成分中分离含有线粒体的分数方面的成功最好通过对来自不同分离步骤的样品进行 Northern 分析和 Western 分析来测试。在这个例子中，样品来自分级分离前或总分数、胞质分数和线粒体分数。对以下 mRNA、COB 和 RNA 进行了 Northern 分析。

这是在线粒体内转录的，A CO 和 MRNA 编码输入到线粒体的蛋白质。一个 CT 测试，一个编码胞质肌动蛋白的 Mr.Nna，一个编码 ER 驻留蛋白的 SEC 61 一个 M nna。下图是北膜的亚甲蓝染色，其中检测到两个突出的 RNA 25 s 和 18 s 条带。

由于 COB 在线粒体内转录，因此其信号应仅在线粒体内。正如在这项研究中观察到的那样。胞质组分中 COB 的出现将表明制备过程中线粒体裂解。

ACO 1 编码一种输入到线粒体的蛋白质，主要出现在线粒体部分中。CT 编码胞质蛋白，因此主要出现在胞质部分。线粒体组分中存在 SEC 61 表明该组分中存在 ER 组分。

RNA 的信号出现在两个组分中，表明核糖体的存在。对以下蛋白进行蛋白质免疫学分析，POR one A 线粒体、外膜蛋白 hx 、 K one A 、 胞质蛋白 CUE one 和 ER 蛋白和 RPL 39。正如预期的那样，核糖体蛋白 POR 1 信号仅在线粒体部分检测到。

如果在胞质组分中检测到 POR one 信号，则表明在制备过程中线粒体成分解离。此外，正如预期的那样，仅在胞质部分检测到 hx K one。线粒体部分的强 CUE 1 信号表明在线粒体部分共分离了大量的 ER 相关物质。

这可能是 ER 和线粒体之间已知物理接触的结果。RPL 39 信号出现在两个级分中，再次确认两个级分中存在核糖体，排除程序中的恢复步骤导致核糖体从 M 级分中消失，这将影响 mRNA 与线粒体的结合。除了验证线粒体和胞质成分之间的分离质量外，还必须确认样品中的 RNA 或蛋白质是完整的，并且在样品制备过程中没有 RNA 或蛋白质的严重损失。

完整、RNA 和蛋白质应在分析中检测为不同的条带，如下所示。对于 c CCP one mRNA，它编码输入到线粒体的蛋白质，出现额外的较短条带或弥散条带将表明降解。严重的损失将导致信号的总量和相对量之间存在显著差异，而这些信号是没有观察到的。

这些结果验证了该方案是在单个程序中分离 mRNA、核糖体和蛋白质的有效方法。按照此程序，可以执行 RNA-Seq 或蛋白质组学分析等全基因组方法，以确定器官功能的关键和独特特征。看完这个视频，你应该对如何分离与线粒体相关的 RNA 有了很好的了解。