分离与酵母线粒体相关的mRNAs以研究局部翻译机制

本实验的总体目标是分离与正在翻译的 mRNA 相关的线粒体。首先，在促进线粒体富集的条件下培养酵母细胞并收集细胞；第二步是在环己酰亚胺存在下轻柔地裂解细胞。

接下来通过差速离心将线粒体与可溶性组分分离。最后一步是从线粒体和对照样品中提取RNA。最终通过Northern分析来检测线粒体相关RNA的纯度和质量。

该技术的主要优势在于，可在一次制备过程中分离出多种类型的 RNA，从而能够进行比较分析。该方法有助于回答细胞生物学中的关键问题，例如细胞内定位和细胞器功能。

在此步骤中，将从 100 至 150 毫升酵母细胞中纯化线粒体，这些细胞在 30 摄氏度下于非发酵性培养基中培养至 OD 600 为 1 至 1.5。在室温下以 3000 × g 离心 5 分钟，弃去上清液，并用双蒸水重悬沉淀后再次离心。

弃去上清液后，称量细胞沉淀。通常从 100 毫升细胞中可获得约 0.6 克。每 0.5 克细胞用 1 毫升 DTT 缓冲液重悬沉淀。

使用还原剂处理细胞非常重要，以破坏细胞壁内的二硫键，从而提高水解效率。将细胞在30摄氏度下轻轻振荡孵育10分钟。随后在室温下以3000 × g离心5分钟。弃去上清液，并将沉淀重新悬浮。

每0.15克细胞加入1毫升xmal liase缓冲液，切勿涡旋。取10微升细胞样品加入990微升水中，测定OD 600并记录该数值。向细胞中加入 freshly prepared xmal liase，以水解葡萄糖聚合物在β-1,3-葡聚糖连接位点的结构，并生成Sphero plast。

此后，Sphero plast 应始终保存在等渗溶液中，以避免细胞裂解；将细胞在 30 摄氏度下轻轻振荡孵育 15 分钟。为验证细胞壁的水解及 Sphero plast 的形成，取 10 微升细胞与 990 微升水混合，测定 OD 600。由于渗透压差异，Sphero plast 应发生裂解，OD 600 值应比加入木聚糖酶前至少降低十倍。若未达到该标准，则继续加入木聚糖酶孵育 15 分钟。

用 100 毫升恢复培养基重悬 Plast 的 PHE，并将 Plast 球体转移至 Helen Meyer 烧瓶中。在 30 摄氏度下振荡孵育 1 小时。此恢复步骤是必要的，因为在 XYs 处理期间翻译过程被抑制，且 mRNA 定位受到破坏。

一小时后，加入 0.1 毫克/毫升的环己酰亚胺，并将 Sphero plast 转移至预冷的 50 毫升离心管中。加入环己酰亚胺对于冻结核糖体与 mRNA 的结合至关重要，从而维持核糖体依赖性的 mRNA 与线粒体的结合状态。

在4°C条件下，以3000 × g离心五分钟后弃去上清液，并用冷甘露醇洗涤两次。缓冲液可重复使用。

用4毫升冰冷的甘露醇缓冲液重悬plass球体，并将悬浮液转移至一个容量为15毫升、配有紧密适配研杵的下压式匀浆器中。轻轻研磨15次以破碎plass球体，然后将裂解液转移至13毫升离心管中。在4°C条件下，以1,500 × g离心6分钟。

离心收集细胞核和未破碎的细胞。小心将上清液转移至新离心管中。保留一毫升或25%的样品作为未分级或总样品。

取 50 微升该样品转移至新管中，并加入 15 微升 4×LSB。对于蛋白质印迹分析，其余总样品将用于沉淀 RNA，以进行 Northern 印迹和基因芯片分析。在 10,000 ×g 条件下离心上清液。

在 4°C 条件下离心 10 分钟。为沉淀线粒体，将上清液转移至新离心管中并置于冰上。此为细胞质组分。

取 50 微升该样品转移至新试管中，并加入 15 微升 4× XLSB。用于 Western 印迹分析；剩余的细胞质样品中的 RNA 将被沉淀，用于 Northern 印迹和微阵列分析。用 3 毫升甘露醇缓冲液洗涤沉淀，并在 10,000 × g 条件下再次离心。

在 4 摄氏度下离心 10 分钟。用 3 毫升甘露醇缓冲液重悬沉淀物。此样品含有线粒体，称为线粒体组分。

取50微升该样品转移至新管中，加入15微升4×上样缓冲液（XLSB），用于蛋白质印迹分析。开始此操作时，向每个样品中加入等体积的8摩尔胍二乙基（guanidium）、HCEL以及两倍体积的100%乙醇，涡旋混匀后于-20摄氏度孵育至少2小时。随后在4摄氏度下以10,000×g离心20分钟。

弃去上清液。由于沉淀物可能不稳定，操作时需小心。用 70% 乙醇洗涤沉淀后，将沉淀重悬于 400 µL 无 RNase 的水中，并将样品转移至新的离心管中。

通过加入0.1倍体积的3摩尔醋酸钠（pH 5.2）和两倍体积的100%乙醇沉淀RNA，涡旋混匀后在-20摄氏度下孵育至少两小时。在4摄氏度下以20,000 ×g离心样品20分钟。

弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀。将沉淀在空气中干燥，然后用无RNase的水重悬RNA。将样品在-80摄氏度保存。

随后可将样品用于Northern印迹或微阵列分析。为进行微阵列分析，首先将从盐酸胍和乙醇沉淀中获得的每份mRNA沉淀用650 µL无RNase的水重悬，并转移至带螺帽的离心管中。然后加入650 µL酸性酚-氯仿，充分涡旋混匀后，在最大转速下离心2分钟。

将上层水相的500微升转移至新离心管中。避免吸取中间层，因其含有DNA。同时注意避免吸取苯酚，因为苯酚可能抑制逆转录反应。

通过氯化锂沉淀法从RNA样品中去除肝素。加入氯化锂至终浓度为2摩尔，在-20摄氏度下孵育样品过夜。次日将样品在4摄氏度下解冻，并以20,000 ×g离心。

在 4 摄氏度下离心 20 分钟。小心弃去上清液，用 80% 乙醇洗涤沉淀，再次离心。再次弃去上清液，空气干燥，将沉淀重悬于 150 µL 无 RNase 的水中，以去除任何残留的氯化锂沉淀，再加入 0.1 倍体积的 3 M 醋酸钠（pH 5.3）和 3 倍体积的 100% 乙醇，于 -20 摄氏度孵育至少 2 小时。

在4°C条件下以最高速离心20分钟。用80%乙醇小心洗涤透明沉淀，并风干。最后用25 µL无RNase的水重悬沉淀，并将样品置于-80°C保存。

通过在不同分离步骤的样品上进行Northern分析和Western分析，是检验本方案能否成功将含线粒体的组分与胞质组分分离的最佳方法。本示例中的样品来自分馏前（即总组分）、胞质组分以及线粒体组分。对以下mRNA进行了Northern分析：COB和一种RNA。

这些是在线粒体内转录的，包括 CO1 和编码一种被导入线粒体的蛋白质的 mRNA；CT1 和编码细胞质肌动蛋白的 mRNA；以及 SEC61 和编码内质网驻留蛋白的 mRNA。底部面板为 Northern 印迹膜的亚甲蓝染色结果，可见两条明显的 RNA 条带，分别为 25S 和 18S。

由于COB在线粒体内转录，其信号应仅存在于线粒体中，本研究中观察到的结果正是如此。若在胞质组分中出现COB，则表明在线粒体分离过程中发生了线粒体裂解。

ACO1 编码一种被导入线粒体的蛋白质，主要存在于线粒体组分中。CT1 编码一种细胞质蛋白，因此主要存在于细胞质组分中。线粒体组分中存在 SEC61 表明该组分中含有内质网成分。

RNAs 的信号在两个组分中均出现，表明存在核糖体。对以下蛋白质进行了蛋白质印迹分析：线粒体外膜蛋白 POR1、HxK1A、细胞质蛋白 CUE1、内质网蛋白 RPL39 以及核糖体蛋白。正如预期，POR1 信号仅在线粒体组分中被检测到。

如果在细胞质组分中检测到 POR 信号，则表明在线粒体组分制备过程中发生了线粒体组分的解离。此外，如预期一致，hx K one 仅在细胞质组分中被检测到。线粒体组分中强烈的 CUE one 信号表明，大量与内质网相关的物质在分离线粒体组分时被共同分离出来。

这可能是内质网与线粒体之间已知的物理接触的结果。RPL39 信号在两个组分中均有出现，再次证实了核糖体存在于这两个组分中；若省略回收步骤，会导致线粒体组分（M 组分）中的核糖体消失，从而影响 mRNA 与线粒体的结合。除了验证线粒体组分与胞质组分分离的质量外，还需确认样品中的 RNA 或蛋白质是否保持完整，并确保在样品制备过程中未发生严重的 RNA 或蛋白质损失。

在分析中，完整的RNA和蛋白质应显示为不同的条带，如图所示。对于编码一种被导入线粒体的蛋白质的c CCP mRNA而言，若出现额外的较短条带或弥散条带，则表明其已发生降解。严重的降解将导致总信号量与相对信号量之间存在显著差异，但综合来看，本实验中并未观察到此种情况。

这些结果验证了该方案作为一种在单次操作中分离 mRNA、核糖体和蛋白质的有效方法。通过此操作流程，可进一步开展转录组测序（RNA-Seq）或蛋白质组学分析等全基因组范围的研究，以鉴定细胞器功能的关键特征与独特属性。观看本视频后，您应能充分掌握如何分离与线粒体相关的 RNA。