Name: 髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG 35-55）诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的C57BL / 6小鼠 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-15T19:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: 了解使用MOG 35-55肽和完全弗氏佐剂在C57BL/6小鼠中诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎的方法。该模型模拟多发性硬化症的临床特征，有助于研究神经免疫学机制和药物筛选。

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本工作由明斯特跨学科临床研究中⼼（IZKF）资助（SEED 03/12，SB）。

1. 小鼠实验的一般注意事项
<ol>
	<li>所有使用小鼠的实验均应遵循各机构动物护理和使用委员会的指导原则。</li>
	<li>将小鼠饲养于无病原体环境中，并自由提供食物和饮水。ad libitum。注意：实验组中应使用年龄和性别相匹配的小鼠，因为对疾病的易感性可能随年龄和性别而变化。</li>
	<li>根据所选实验条件，可设置假免疫对照组，其中用不含抗原的PBS或非脑脊髓炎性肽替代MOG35-55肽。</li>
	<li>在开始实验前请考虑方法学方面的因素（亦见下文）。我们建议安排一名或两名盲法观察者进行EAE评分。</li>
</ol>
2. MOG35-55 乳剂的制备
<ol>
	<li>每只小鼠应注射 200 µl 的 MOG35-55 肽溶液与 CFA 以 1:1 比例混合的乳剂。由于该乳剂黏稠，在配制和注射过程中会有一定损耗。因此，应准备所需总量的 1.5–2 倍&#160;。计算乳剂的总体积后，将其除以 2，即为所需的 MOG35-55 肽溶液和 CFA 各自的体积。</li>
	<li>将冻干的 MOG35-55 肽用 ddH2O 溶解，配制成终浓度为 2 mg/ml 的溶液。通常每只小鼠使用 200 µg MOG35-55 肽，该剂量包含在 100 µl 储存液中。肽溶液应保存于 -20 °C。</li>
	<li>将一管干燥的结核分枝杆菌 H37RA（100 mg）内容物转移至研钵中。
	<ol>
		<li>使用研钵和研杵充分研磨，获得细粉。</li>
		<li>加入 10 ml 不完全弗氏佐剂，配制成 10 mg/ml 的 CFA 储存液，可于 4 °C 保存。</li>
		<li>免疫前，用不完全弗氏佐剂（IFA）将 CFA 储存液稀释至终浓度为 2 mg/ml。每次使用前需充分混匀以重悬颗粒物质，并考虑在实验准备过程中黏稠溶液可能发生的体积损耗。</li>
		<li>与 MOG35-55 肽溶液按 1:1 比例混合，直至终浓度达到 1 mg/ml。 
		注意：灭活的结核分枝杆菌可激活先天免疫反应。避免吸入、摄入以及与皮肤和眼睛接触。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将溶液预先在冰上冷却。
	<ol>
		<li>分别用两个 2 ml 注射器吸取 1 ml 的 2 mg/ml CFA 溶液和 1 ml 的 2 mg/ml MOG35-55 溶液。根据免疫动物数量计算所需注射器数量。 
		注意：配制佐剂时应严格避免穿刺操作，以防引起肉芽肿或诱发自身免疫反应。</li>
		<li>MOG35-55 溶液使用 27 G 套管，CFA 使用 20 G 套管。避免产生气泡，并用三通阀连接两个注射器。</li>
		<li>将乳剂在两个注射器之间反复转移，充分混合至少 10 分钟，良好的乳化是关键步骤。可将三通阀略微关闭以促进乳化。最终溶液应呈白色、浓稠且黏稠，无相分离现象。</li>
		<li>乳剂可在免疫前保存数天。乳剂配制完成后至少等待 30 分钟，观察其是否稳定。免疫前，将乳剂吸入两个注射器中的一个，并连接 27 G 套管。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 百日咳毒素的制备
<ol>
	<li>文献中报道的百日咳毒素用量各不相同，且取决于给药途径（例如静脉注射或腹腔注射）。本实验室在免疫当天及两天后，以200 µl PBS溶液腹腔注射400 ng百日咳毒素。注意：百日咳毒素具有多种生物学效应。避免吸入、摄入以及与皮肤和眼睛接触。</li>
	<li>将50 µg百日咳毒素溶于500 µl ddH2O中，配制成100 µg/ml的储存液。4 °C保存。</li>
	<li>用PBS稀释1:50。此时200 µl溶液中含有400 ng百日咳毒素。准备所需数量的注射器，并为每根针头额外多准备约100 µl的过量体积。</li>
</ol>
4. 动物免疫
<ol>
	<li>请参考机构动物护理和使用委员会关于短期安乐死的具体标准。本实验室采用异氟烷进行短暂麻醉，其他方案如氯胺酮/赛拉嗪注射或氟烷也可能适用。等待动物进入麻醉状态，并通过前肢脚趾夹捏反应评估麻醉深度。</li>
	<li>确保由有经验的人员进行免疫操作，以最大限度减少动物应激并保证最佳免疫效果。</li>
	<li>将100 µl抗原/CFA乳液分别皮下注射至每侧后侧腹的两个不同部位。确保皮下形成结节状隆起，且该隆起应持续整个实验过程。</li>
	<li>腹腔注射200 µl百日咳毒素。</li>
	<li>确保可对每只小鼠进行个体识别以便每日评估，e.g. 通过在尾根部做颜色标记。</li>
	<li>在免疫后第二天给予第二剂百日咳毒素。</li>
</ol>
5. EAE 监测
<ol>
	<li>应每天评估体重和临床评分。EAE 的发病通常与体重下降相关，体重下降可作为疾病活动的指标。请参照所在机构动物护理和使用委员会的规范，预先定义需将个别小鼠退出实验的标准。当体重下降超过初始体重的 20%，或出现严重临床症状（EAE 评分 7 分或更高）时，应考虑终止实验。有关允许的最高评分，请遵循相应机构动物护理和使用委员会的相关指南。</li>
	<li>当小鼠出现 EAE 临床症状时，应确保其仍能接触到饮水瓶，并将食物放置在笼底。</li>
	<li>可采用不同的评分症状标准。在我们的实验室中，已建立 0-10 的评分量表。</li>
</ol>
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>等级</td>
			<td>临床症状</td>
			<td>备注</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0</td>
			<td>无临床症状</td>
			<td>步态正常，尾巴可活动并能抬起，当小鼠被抓住尾根部时，尾巴可缠绕圆形物体</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>部分尾部无力</td>
			<td>步态正常，尾尖下垂</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>尾部瘫痪</td>
			<td>步态正常，尾部下垂</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>后肢轻瘫，运动不协调</td>
			<td>步态不协调，尾部无力，后肢对夹捏有反应</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>单侧后肢瘫痪</td>
			<td>步态不协调，一侧后肢拖行，尾部无力，一侧后肢对夹捏无反应</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>双侧后肢瘫痪</td>
			<td>步态不协调，双侧后肢拖行，尾部无力，双侧后肢对夹捏无反应</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>后肢瘫痪，前肢肌力减弱</td>
			<td>步态不协调，前肢移动困难，难以拉动身体，前肢对夹捏有反射，尾部无力</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td>后肢瘫痪，单侧前肢瘫痪</td>
			<td>小鼠无法移动，单侧前肢对脚趾夹捏有反应，尾部无力</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8</td>
			<td>后肢瘫痪，双侧前肢瘫痪</td>
			<td>小鼠无法移动，双侧前肢对脚趾夹捏无反应，尾部无力</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9</td>
			<td>濒死状态</td>
			<td>无活动，呼吸异常</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td>死亡</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 临床评分系统。

<ol><li>McFarland, H. F., Martin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis%3A+a+complicated+picture+of+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis: a complicated picture of autoimmunity.</a> Nat. Immunol. 8, 913-919 (2007).</li>
<li>Wiendl, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroinflammation%3A+the+world+is+not+enough%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neuroinflammation: the world is not enough.</a> Curr. Opin. Neurol. 25, 302-305 (2012).</li>
<li>vander Star, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+models+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22CNS+Neurol.+Disord.+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo models of multiple sclerosis.</a> CNS Neurol. Disord. Drug Targets. 11, 570-588 (2012).</li>
<li>Pachner, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+models+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Experimental models of multiple sclerosis.</a> Curr. Opin. Neurol. 24, 291-299 (2011).</li>
<li>Bittner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TASK1+channel+inhibitor+A293+shows+efficacy+in+a+mouse+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">The TASK1 channel inhibitor A293 shows efficacy in a mouse model of multiple sclerosis.</a> Exp. Neurol. 238, 149-155 (2012).</li>
<li>Handel, A. E., Lincoln, M. R., Ramagopalan, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+mice+and+men%3A+experimental+autoimmune+encephalitis+and+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Of mice and men: experimental autoimmune encephalitis and multiple sclerosis.</a> Eur. J. Clin. Invest. 41, 1254-1258 (2011).</li>
<li>Krishnamoorthy, G., Wekerle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EAE%3A+an+immunologist%27s+magic+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">EAE: an immunologist's magic eye.</a> Eur. J. Immunol. 39, 2031-2035 (2009).</li>
<li>Stromnes, I. M., Goverman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+induction+of+experimental+allergic+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Active induction of experimental allergic encephalomyelitis.</a> Nat. Protoc. 1, 1810-1819 (2006).</li>
<li>Fletcher, J. M., Lalor, S. J., Sweeney, C. M., Tubridy, N., Mills, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cells+in+multiple+sclerosis+and+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">T cells in multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Clin. Exp. Immunol. 162, 1-11 (2010).</li>
<li>Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+peptide+induces+typical+chronic+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+H-2b+mice%3A+fine+specificity+and+T+cell+receptor+V+beta+expression+of+encephalitogenic+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells.</a> Eur. J. Immunol. 25, 1951-1959 (1995).</li>
<li>Hofstetter, H. H., Shive, C. L., Forsthuber, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pertussis+toxin+modulates+the+immune+response+to+neuroantigens+injected+in+incomplete+Freund%27s+adjuvant%3A+induction+of+Th1+cells+and+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+the+presence+of+high+frequencies+of+Th2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Pertussis toxin modulates the immune response to neuroantigens injected in incomplete Freund's adjuvant: induction of Th1 cells and experimental autoimmune encephalomyelitis in the presence of high frequencies of Th2 cells.</a> J. Immunol. 169, 117-125 (2002).</li>
</ol>

作者声明无竞争性经济利益。

几十年来，已有大量采用主动免疫方案的不同实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型被报道。尽管大鼠模型直到最近仍被广泛使用，目前小鼠已成为EAE研究中最常用的模式动物。这一发展趋势在很大程度上归因于现有转基因小鼠品系的种类日益丰富且持续增加。采用MOG35-55肽段免疫C57BL/6小鼠是目前应用最广泛的EAE模型之一，可被视为一种可靠、可重复且易于操作的动物模型。在许多神经免疫学实验室中，MOG35-55诱导的EAE已被确立为首选模型，而其他EAE模型则用于回答更为特定的实验问题。
需要考虑的一个关键点是实验设置的规划，以确保EAE实验在方法学上正确进行。为了保证内部有效性，强烈建议对疾病症状进行盲法评分。实验组应在年龄、体重和性别上相匹配，并将小鼠随机分配至各处理组。实验必须始终符合动物福利法规。EAE研究往往统计效力不足，且未考虑II类统计学错误。因此，在实验开始前应进行样本量计算。所需组大小取决于预期的效应量。在启动EAE实验前，建议咨询统计学专家。
需要注意该实验方案存在的一些局限性。最重要的是，由于免疫过程中使用了佐剂和百日咳毒素，二者均会对免疫反应产生额外影响，从而干扰对aEAE数据的解读。还应考虑到，MOG35-55 EAE模型主要表现为由CD4+ T细胞驱动的免疫反应，而CD8+ T细胞和B细胞的作用相对较小；因此，若研究目标涉及这些细胞类型，应考虑采用其他替代性实验方案。该模型预期的疾病进程为急性、单相且自限性病程；而在其他EAE模型中也可实现复发-缓解型疾病进程。该方案另一项重要局限性在于其对多发性硬化（MS）病理生理学中免疫学成分的侧重倾向。近年来越来越明确的是，MS具有显著的神经退行性成分，少突胶质细胞和神经元的死亡会导致神经系统功能缺陷进行性累积。必须认识到，EAE模型可能并不完全适用于研究自身免疫性炎症中的神经退行性机制，此时可考虑采用其他侧重于中枢神经系统病理改变的动物模型——e.g. 铜喹唑（cuprizone）模型，该模型可在不涉及外周免疫系统的情况下诱导毒性脱髓鞘。
所述方案可视为一种基础的神经免疫学实验模型，并可根据其他应用需求进行修改。上述实验步骤可通过更换小鼠品系或改变蛋白的类型与用量，轻松应用于其他EAE实验方案例如 使用 PLP139-151 肽段和SJL小鼠用于诱导复发-缓解型EAE疾病进程，该模型特别适用于评估治疗手段对复发的干预效果）。所述方案也可用于过继性转移实验（被动性EAE）。在此模型中，C57BL/6小鼠以MOG免疫35-55 肽和CFA，具体如上所述。相比之下，百日咳毒素并非必需。7-15天后，分离脾脏或淋巴结，并重新刺激免疫细胞 体外 与 MOG35-55 在转移至一组新的C57BL/6小鼠之前，需进行肽段和多种细胞因子的处理。这些受体小鼠出现实验性自身免疫性脑脊髓炎的时间较经典免疫方法提前数天。 体外 条件可根据特定的免疫学问题进行调整（例如 极化为T细胞H1 或 TH17 个细胞。
有时，疾病发病率低或症状较轻可能会带来实验上的挑战。以下是一些故障排除的建议：
- 通过使用不同剂量的肽/小鼠，可调节疾病严重程度。
- 最佳CFA浓度可能在1-5 mg/ml之间变化。在建立实验时，建议进行CFA的浓度梯度滴定。请参考相应机构动物护理与使用委员会的相关指南，以确定允许使用的CFA浓度，因为许多法规禁止CFA浓度超过2 mg/ml。
- 本文描述了制备乳剂的不同方法。如果认为乳化效果不佳可能是潜在的误差来源，则可考虑采用其他方法，如涡旋震荡1小时或超声处理。
- 年龄、性别、一年中的季节以及动物饲养设施内的环境条件是影响实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）易感性的重要因素。应确保不同独立实验之间的条件具有可比性。
如上所述，上述方案可作为过继性EAE实验的起始点。该模型特别适用于区分遗传表型在外周和中枢神经系统中的效应例如 通过将致脑炎性基因敲除细胞转移至野生型受体小鼠，可研究特定免疫学问题，并对所转移细胞的表型进行深入表征。近年来EAE研究的最新进展是T细胞受体转基因小鼠的建立。这类小鼠无需外界干预即可自发出现EAE症状，从而避免了佐剂接种带来的问题。然而，该模型需要大量动物用于繁育，以确保足够的实验组规模。与主动诱导性EAE（aEAE）不同，基因敲除小鼠在开展EAE实验前需进行杂交育种。由于每只小鼠发病时间各不相同，新型物质的评估可能变得相当复杂。因此，经典主动诱导性EAE模型在神经免疫学研究中的价值依然不可替代。

多发性硬化症（MS）是一种中枢神经系统慢性脱髓鞘性炎症疾病，其特征是少突胶质细胞和神经元的破坏导致异质性且进行性加重的临床症状。MS 被认为是中枢神经系统（CNS）典型的自身免疫性疾病，目前已建立多种动物模型以揭示其复杂的发病机制。此外，现有疗法仅部分有效，主要针对疾病的炎症阶段，而神经退行性变成分可能是未来治疗策略面临的主要挑战1,2。
尽管该疾病的确切病因尚不明确，但目前认为针对中枢神经系统（CNS）轴突髓鞘上表位的自身免疫反应会引发疾病的发生。免疫系统的失调、遗传易感性以及环境因素（例如感染、维生素D）被认为会影响多发性硬化症（MS）病理生理机制的核心环节。
目前已有三种不同类型的动物模型用于研究多发性硬化症（MS）的病理模式：病毒模型（如鼠类脊髓脑炎病毒，Theiler's murine encephalomyelitis virus, TMEV）、由毒性物质诱导的模型（如铜唑酮模型），以及实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的多种不同变体3,4。尽管这些模型均能模拟MS的某些特征，但在诸如适应性免疫系统的参与等基础病理特征方面存在显著差异。EAE是最常用的动物模型，特别适用于研究神经炎症通路，且常作为验证新型治疗策略有效性的“原理验证”模型5,6。EAE可在多种不同动物中诱导产生（例如小鼠、大鼠、小型猪、豚鼠、鸡或灵长类动物）。然而，小鼠已成为应用最广泛的物种，这至少部分归因于日益丰富的转基因或基因敲除小鼠品系的可获得性7。
实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的病理生理学基础是免疫系统对脑特异性抗原的反应。该反应引发炎症并破坏携带抗原的结构，导致出现与多发性硬化症（MS）患者相似的神经学和病理学特征。目前可区分三种不同的研究方法：主动诱导型EAE（aEAE，即主动免疫）、被动转移型EAE（pEAE，即将致脑炎细胞从免疫过的动物转移至受体动物），以及近年来发展的自发性EAE小鼠模型（sEAE），后者可在无需外源性干预的情况下研究自身免疫机制。其中最易诱导的模型是小鼠的aEAE模型，可快速获得稳定可靠的结果。该模型被许多该领域研究者视为神经免疫学动物模型的“金标准”8。
为了诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎（aEAE），动物需在免疫当天以及两天后，接受一次皮下注射乳剂（包含选定的抗原和完全弗氏佐剂（CFA）），同时进行腹腔注射百日咳毒素。由此，特异性针对髓鞘的T淋巴细胞在外周被激活，并穿过血脑屏障迁移至中枢神经系统（CNS）。进入中枢神经系统后，这些T细胞被局部及浸润的抗原呈递细胞重新激活，引发后续的炎症级联反应，招募单核细胞或巨噬细胞等其他细胞参与，最终导致脱髓鞘及轴突细胞死亡9。根据免疫方案的不同，以及小鼠品系（例如 C57BL/6、SJL/J、Biozzi）与抗原（例如 髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）、髓鞘碱性蛋白（MBP）、髓鞘蛋白脂质蛋白（PLP））组合的差异，疾病进程可表现为急性、慢性进行性或复发-缓解型病程。
C57BL/6 小鼠已成为构建转基因小鼠最常用的品系，目前已有大量基因敲除或转基因小鼠品系可供使用。本文描述了一种使用 MOG35-55 肽段对 C57BL/6 小鼠进行免疫的方案10，该方法可诱导出单相性实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE），首次症状出现在免疫后 9–14 天，疾病高峰出现在发病后约 3–5 天，随后在接下来的 10–20 天内症状缓慢且部分恢复。由于 MOG35-55 肽段本身的免疫原性不足以诱导疾病发生，因此需要使用佐剂（如完全弗氏佐剂，CFA）。据认为，CFA 的组分可激活单核吞噬细胞，促进这些分子的吞噬作用并诱导细胞因子的分泌，从而延长抗原在体内的存留时间，并更有效地将抗原转运至淋巴系统。百日咳毒素（PT）的应用有助于 EAE 的诱导，其作用机制可能包括调节血脑屏障功能以及免疫应答本身11。在疾病诱导后，必须每天对小鼠进行细致观察，以评估疾病症状的发展情况。

<table><tbody><tr><td>雌性C57BL/6小鼠，10–12周龄，体重约20 g</td><td>&lt;i&gt;例如&lt;/i&gt; 杰克逊实验室，查尔斯河</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MOG&lt;sub&gt;35-55&lt;/sub&gt; (MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK)</td><td>&lt;i&gt;例如&lt;/i&gt; Pepceuticals Ltd</td><td></td><td>-20℃保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>不完全弗氏&amp;rsquo;不完全弗氏佐剂（IFA）</td><td>&lt;i&gt;例如&lt;/i&gt; Sigma-Aldrich 公司</td><td>F5506</td><td>4°C 下保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>1 ml 注射器，配 26 G 3/8 英寸针头&amp;nbsp;</td><td>&lt;i&gt;例如&lt;/i&gt; Becton Dickinson &amp;amp; 公司</td><td>309625</td><td></td></tr><tr><td>2 ml 注射器</td><td>&lt;i&gt;例如&lt;/i&gt; B. Braun</td><td>7389</td><td></td></tr><tr><td>25 G 5/8 英寸和 30 G 1/2 英寸针头&amp;nbsp;</td><td>&lt;i&gt;例如&lt;/i&gt; Becton Dickinson &amp;amp; Co.,</td><td>305122, 305106</td><td></td></tr><tr><td>三通阀</td><td>&lt;i&gt;例如&lt;/i&gt; B. Braun</td><td>16494 C</td><td></td></tr><tr><td>百日咳毒素，缓冲液冻干粉</td><td>Enzo Life Sciences Inc.</td><td>BML-G100</td><td>4°C 保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>&lt;i&gt;M. tuberculosis&lt;/i&gt; H37 RA</td><td>BD Difco</td><td>231141</td><td>4°C 保存 &amp;deg;C</td></tr></tbody></table>

髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（mog35-55）诱导的c57bl/6小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎（eae）

Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein (MOG35-55) Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 Mice

多发性硬化症是一种以显著神经退变为特征的慢性神经炎症性中枢神经系统脱髓鞘疾病。尽管该疾病的确切病因尚不明确，但目前认为自身反应性T淋巴细胞在其发病机制中起核心作用。迄今为止，多发性硬化症的治疗效果仍有限，科研人员正不断努力加深对疾病发病机制的理解，并开发新的治疗策略。实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是研究多发性硬化症最常用的动物模型，具有许多与人类疾病相似的临床和病理生理特征。EAE模型具有多种类型，可分别反映人类多发性硬化症在临床表现、免疫学和组织学方面的不同特点。在小鼠中主动诱导的EAE模型是最容易建立的可诱导模型，具有结果稳定且可重复的优点。该模型特别适用于利用转基因小鼠研究特定药物或基因在自身免疫性神经炎症条件下的作用。因此，通常使用中枢神经系统匀浆物或髓鞘蛋白肽段对小鼠进行免疫。由于这些肽段的免疫原性较弱，需使用强效佐剂。EAE的易感性和表型取决于所选用的抗原和啮齿类动物品系。C57BL/6小鼠是构建转基因小鼠最常用的品系之一，可对髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）等抗原产生免疫应答。免疫原性表位MOG35-55在免疫前悬浮于完全弗氏佐剂（CFA）中，并在免疫当天及两天后注射百日咳毒素。免疫后9至14天内，小鼠会出现一种“典型”的自限性单相EAE，表现为进行性上升性弛缓性瘫痪。小鼠需每日采用临床评分系统进行评估，持续25至50天。本文还讨论了EAE动物护理的特殊注意事项，以及该模型的潜在应用价值和局限性。

免疫后，需每日评估小鼠体重变化及临床症状。疾病 onset 通常与体重下降相关，体重减轻可能早于 EAE 症状出现 1–2 天。EAE 的临床体征通常在免疫后第 9 至 14 天之间开始出现。由于在 C57BL/6 小鼠的 MOG-EAE 模型中，病灶主要定位于脊髓，因此小鼠通常表现出由尾端向头端发展的运动功能障碍症状。图中展示了一只具有 EAE 症状（评分 6）的免疫小鼠示例 图1A一些非典型的EAE症状也可能出现，例如轴向旋转式翻滚、弓背姿态或过敏反应，这些症状未包含在上述经典的EAE评分标准中 表1. 由于运动症状是该模型的主要特征，该评分确实能很好地反映疾病的严重程度。不同的监测系统（例如 评分为0-5或0-6，以及评估不同功能缺损的更复杂的复合评分也已有发表。请注意，根据各机构动物护理与使用委员会的规定，出现严重症状的小鼠必须从实验中剔除。小鼠的症状通常在接下来的10-20天内部分恢复。典型的疾病进程如图所示。 图1B在EAE的不同时间点，可针对不同结局参数进行评估。以下简要描述一些常见的典型检测方法。在疾病高峰期，可对分离的免疫细胞经MOG再刺激后，检测小鼠的细胞因子产生或增殖情况。35-55 肽 体外 （MOG 回忆实验）。也可从患有 EAE 症状的小鼠的脑和脊髓中分离免疫细胞，并进行后续处理， 例如 通过流式细胞术进行分析。可在疾病高峰期对脊髓切片进行组织学分析，以评估病灶负荷和脱髓鞘情况，而在较晚的时间点，则可能需要关注神经退行性变和神经元细胞死亡的标志物。
<img alt="小鼠模型研究；EAE进展图；免疫对小鼠的影响；研究数据分析图" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51275/51275fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51275/51275fig1.jpg" width="600px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 典型的EAE实验结果。A. 患有EAE症状（EAE评分6分）的免疫C57BL/6小鼠的代表性图片。B. 免疫后30天内的典型疾病进程。数据以均值和标准误表示（n = 5）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51275/51275fig1highres.jpg" target="_blank">点击此处查看高清图像</a>。

实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是多发性硬化症的一种成熟动物模型。通过用髓鞘寡突胶质细胞糖蛋白肽35-55（MOG35-55）免疫C57BL/6小鼠，可诱导中枢神经系统中自身反应性免疫细胞引发的上行性弛缓性瘫痪。本文将讨论疾病诱导与监测的相关方案。

髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG35-55）诱导的C57BL/6小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）

多发性硬化是一种慢性神经炎症性脱髓鞘疾病，主要影响中枢神经系统，并具有显著的神经退行性成分。虽然……

本实验的总体目标是建立一种实验性自身免疫性脑脊髓炎的动物模型，以模拟多发性硬化症的临床及病理生理特征。首先制备抗原、佐剂和百日咳毒素；第二步是将抗原与CFA乳剂进行皮下注射，同时将百日咳毒素进行腹腔注射。两天后，再次通过腹腔注射百日咳毒素。此后，每天称量动物体重并评估其临床评分。最终，实验性自身免疫性脑脊髓炎的临床症状通常在免疫后第9至14天之间出现。与现有方案相比，该技术的主要优势在于，现有方案通常涉及例如唑酮或EIE的不同变体等有毒试剂，而这些模型虽然均模拟多发性硬化症（MS）的某些特征，但在基础病理特征上存在巨大差异，例如适应性免疫系统的参与程度。通常，初次接触该方法的研究人员会因免疫接种操作的难度而面临困难。因此，在方法建立后，必须尽量减少动物的应激反应，并确保实现最佳的免疫效果。该模型为神经免疫学领域的研究人员表征基因敲除动物奠定了基础。为了鉴定新的分子药物靶点或测试有前景的候选药物，需准备肽溶液：首先将冻干的MOG 35至55肽用双蒸水稀释，配制成终浓度为2毫克/毫升的溶液。每只小鼠需要100微升该溶液，且在制备过程中会损失部分体积。因此，配制所需溶液体积的1.5至2倍。将多肽溶液于-20°C保存。如需制备完全弗氏佐剂（CFA），取100毫克干燥的结核分枝杆菌H37 RA，放入研钵中，用研杵研磨成细粉。然后加入10毫升不完全弗氏佐剂，配制浓度为10毫克/毫升的CFA储备溶液。CFA储备液可保存在4°C，直至免疫当天使用。用不完全弗氏佐剂将CFA储备溶液稀释至终浓度为2毫克/毫升，充分混匀以重新悬浮颗粒物质，并置于冰上。解冻一份 MOG 35 至 55 肽溶液后，将其置于冰上。使用一个 2 毫升注射器和一根 27 号针头抽取 1 毫升 CFA。然后使用第二个2 mL注射器和20号套管针吸取1 mL MOG 35至55溶液。去除所有气泡，并通过三通阀将两个注射器连接。将三通阀调至接近关闭状态，将乳剂在两个注射器之间反复推注，充分混合至少10分钟。完成时，溶液应呈白色、质地坚硬且黏稠，无相分离现象。现在将乳剂静置至少30分钟，或长达数天，然后再进行免疫。使用前需检查乳剂是否仍保持乳化状态。在免疫当天，将溶液吸入两支注射器中的一支，并连接一根27号套管针。将50微克百日咳毒素溶于500微升双蒸水中。配制成100微克/毫升的储存液后，于4°C保存备用。在免疫当天，将百日咳毒素储存液按1:50比例稀释。用 PBS 配制一支含有 200 微升稀释百日咳溶液的注射器用于注射，该溶液包含 400 纳克百日咳毒素，并额外抽取 100 微升以填充针头连接部的死腔。使用异氟烷麻醉小鼠后，通过脚趾夹捏法评估麻醉深度。将 100 微升抗原 CFA 乳剂分别皮下注射至每侧后侧腹的两个不同部位。注射后，皮肤下应形成一个球状肿块，该肿块应在整个实验过程中持续存在。接下来，将含有200 µL百日咳毒素的已备好注射器进行腹腔注射。确保每只小鼠均可被明确识别，以便进行每日评估。例如，通过尾基部的颜色标记。

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免疫学与感染

髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG<sub&gt; 35-55</sub&gt;）诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的C57BL / 6小鼠

某些小鼠品系能够抵抗以髓鞘碱性蛋白诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）。本文介绍了一种简单的免疫接种方案，可逆转这些小鼠品系的无反应状态，并在多种典型的EAE抗性小鼠品系中诱导出麻痹性疾病。...

通过过继转移与抗原攻击克服实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）抵抗性小鼠品系的无应答状态

该视频展示了通过注射髓鞘少突胶质细胞糖蛋白与灭活的结核分枝杆菌（Mycobacterium...

小鼠模型中实验性自身免疫性脑脊髓炎的诱导

本视频演示了通过注射髓鞘来源的多肽并联合佐剂以激活自身反应性T细胞来诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的方法。这些T细胞会迁移至脑部。同时给予百日咳毒素以增加血脑屏障的通透性，使这些T细胞及其他免疫细胞得以进入脑组织。这些免疫细胞引发脱髓鞘，导致神经传导受损，从而诱发EAE。...

在本视频中，采用实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）建立小鼠多发性硬化模型。将含有神经元肽和佐剂的乳剂注射至小鼠体内，引发免疫反应，激活自身反应性T细胞。随后注射百日咳毒素（PTX）以增加血脑屏障通透性，使自身反应性T细胞得以浸润脑组织。此类浸润启动信号级联反应，最终导致髓鞘损伤，模拟多发性硬化症的脱髓鞘病变状态。...

本文描述了实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型的诱导与评分方法，以及在疾病不同阶段，通过流式细胞术和定量PCR分别检测淋巴结、脾脏、血液和脊髓中免疫细胞分布和mRNA细胞因子水平的评估方法。...

小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎的诱导及疾病依赖性免疫细胞在不同组织中分布的评估

我们介绍一种仅使用常规实验室设备的简单方案，用于大量制备和纯化含有小鼠髓鞘少突胶质细胞糖蛋白的融合蛋白。该蛋白可用于诱导由T细胞和B细胞共同介导的实验性自身免疫性脑脊髓炎。...

用于实验性自身免疫性脑脊髓炎研究的小鼠髓鞘少突胶质细胞糖蛋白的简单高效制备与纯化

矢状面运动学步态分析可提供关于运动执行方式的高度精确信息。本文描述了这些技术在识别经受自身免疫介导脱髓鞘小鼠步态缺陷中的应用。这些方法也可用于表征其他具有运动功能障碍的小鼠模型的步态缺陷。...

C57BL/6小鼠经MOG35-55诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎后的矢状面运动学步态分析

本文提供了一种在小鼠中诱导主动实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的实验方案。同时介绍了一种分离和表征中枢神经系统（CNS）中浸润性淋巴细胞的方法，以展示淋巴细胞在CNS自身免疫性疾病发生过程中的作用。...

实验性自身免疫性脑脊髓炎期间中枢神经系统淋巴细胞浸润的流式细胞术分析

本实验方案描述了在小鼠模型中使用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎，并通过临床评分系统监测疾病进程。通过小鼠股骨显微计算机断层扫描分析和开放旷场实验，对实验性自身免疫性脑脊髓炎相关症状进行全面评估，以系统分析疾病发展过程。...

实验性自身免疫性脑脊髓炎的诱导及多种评估指标

实验性自身免疫性脑脊髓炎是目前最常用的多发性硬化小鼠模型之一。在本方案中，对两种性别的C57BL/6J小鼠使用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白肽进行免疫，主要导致尾巴和肢体的上升性轻瘫。本文将讨论EAE的诱导与评估方案。...

在两种性别中建模多发性硬化症：MOG35-55诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎

实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是一种多发性硬化症（MS）的动物模型，与人类疾病相似，均具有强烈的体液自身免疫反应。本文报道一种简单且灵活的ELISA实验方案，用于定量检测EAE免疫小鼠血清中的自身抗体。...

实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型中自身反应性抗体的定量分析

了解使用MOG 35-55肽和完全弗氏佐剂在C57BL/6小鼠中诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎的方法。该模型模拟多发性硬化症的临床特征，有助于研究神经免疫学机制和药物筛选。

髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG_35-55）诱导的C57BL/6小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）

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