Name: 快速分析和荧光显微镜图像的探索 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 41 s
Description: 探索使用PhenoRipper平台快速分析荧光显微镜图像的工作流程，通过自动化识别细胞区块类型生成表型特征谱，并利用Pheno Browser工具可视化比较不同实验条件下的复杂表型差异。

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感谢 Adam Coster 以及 Altschuler 实验室和 Wu 实验室的所有其他成员提供的有益反馈和讨论。本研究得到了美国国立卫生研究院基金 R01 GM085442 和 CA133253（S.J.A.）、R01 GM081549（L.F.W.）、CPRIT RP10900（L.F.W.）以及 Welch 基金会 I-1619（S.J.A.）和 I-1644（L.F.W.）的支持。

1. 样品制备与成像
<ol>
	<li>细胞培养
	<ol>
		<li>常规进行细胞分传，并维持细胞融合度在20%-70%。实验前一天，将HeLa细胞接种于DMEM（Dulbecco改良Eagle培养基，见材料表）中培养，添加10%胎牛血清（FBS）和1×青霉素/链霉素。</li>
		<li>实验当天，将培养皿中生长至约50%汇合度的细胞进行传代。</li>
		<li>用 PBS（磷酸盐缓冲液）洗涤细胞，加入约 2 ml 胰蛋白酶/EDTA（乙二胺四乙酸）处理数秒。吸除多余胰蛋白酶/EDTA，于室温下在通风橱中保持细胞浸没于一层薄薄的胰蛋白酶/EDTA 液膜中&#160;约 3 分钟。</li>
		<li>轻轻振荡培养瓶两次，并用含血清的培养基重悬细胞。计数细胞并稀释至5,000&#160;细胞/50 µl 培养基，立即使用自动化液体处理机器人将50 μl/孔接种至384孔玻璃底板（此处仅使用板中的30个孔）。</li>
		<li>室温孵育 30 分钟&#160;以减少孔板边缘效应5孵育结束后，将培养板置于37 °C、5% CO₂条件下2 过夜孵育。</li>
		<li>每种药物将进行复孔检测。向已含有培养基的对应孔中加入25 µl药物。</li>
		<li>在 PBS 中用 4% 多聚甲醛溶液固定平板，持续 24 小时&#160;药物处理后</li>
	</ol>
	</li>
	<li>染色 
	此处使用的特异性一抗、荧光标记的二抗及其他荧光染料详见材料表。
	<ol>
		<li>用含0.2% Triton X-100的TBS（Tris缓冲盐溶液）对固定后的细胞透化处理3分钟，随后用TBST（Tris缓冲盐溶液+Tween 20）洗涤3次。加入含5% BSA（牛血清白蛋白）的TBST溶液进行封闭。</li>
		<li>在室温下孵育平板 2 小时&#160;小时&#160;然后用 TBST 洗涤 3 次。</li>
		<li>在含5% BSA的TBST中配制一抗稀释液（参见材料表），每孔加入10 µl。室温孵育2小时，随后用TBST洗涤3次。</li>
		<li>用 TBST 配制含 5% BSA 的二抗稀释液（见材料表），每孔加入 10 µl。</li>
		<li>在室温下避光孵育平板 2 小时&#160;然后用 TBST 洗涤两次。</li>
		<li>在 PBS 中配制 Hoechst 和鬼笔环肽（参见材料表）的稀释液，并每孔加入 10 μl。</li>
		<li>在避光条件下孵育平板30分钟&#160;室温下</li>
		<li>2 后&#160;TBST 洗涤后，用铝箔覆盖培养板，4 °C 过夜保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>成像 
	使用20X物镜通过落射荧光显微镜采集图像&#160;使用1×1相机像素合并的物镜。每孔采集16张图像，共采集480张图像（3个通道）。</li>
</ol>
2. 图像分析
从 phenoripper.org 下载并安装 PhenoRipper，然后启动 PhenoRipper 以开始图像分析。PhenoRipper 目前支持 TIFF、PNG 和 JPEG 格式，以及 MATLAB 支持的所有其他格式（显微镜软件通常支持导出为 TIFF 格式）。
2.1 加载数据
<ol>
	<li>显微镜图像目前尚无统一的命名或组织规范，这可能导致图像加载及关联元数据（即实验注释，如处理类型、孔位编号等）成为工作流程中最困难的部分。请选择以下提供的方法之一（如下所述）：
	<ol>
		<li>PhenoLoader：当文件名和/或目录结构包含足够信息以按需分组图像时，请选择此选项以半自动加载数据（例如，B16\HeLa_Drug5-DAPI.png 可能表示该图像来自 B16 孔，细胞经药物 ID 为 5 的药物处理，且图像捕获的是细胞核 DAPI 染色——在此命名规则下，可轻松将来自 A1 孔或经 Drug 5 处理的所有图像进行分组）。向导将逐步引导用户将元数据与图像组关联，并定义标记，步骤如下：
		<ol>
			<li>点击 &#34;文件结构&#34; 以进入 PhenoLoader 窗口。</li>
			<li>点击 &#34;定义根目录&#34; 以选择包含图像数据集的目录。然后可筛选分析中不使用的文件（未使用文件）（可选，可留空）。</li>
			<li>点击 &#34;定义标记&#34; 以指定实验中使用的生物标志物，并将其与图像关联。具体操作为：点击一个图像文件，然后选择文件名中唯一标识生物标志物的部分。最后，为每个生物标志物输入名称。</li>
			<li>点击 &#34;定义元数据&#34; 以将信息与每张图像关联。具体操作为：点击一个图像文件，然后选择文件名中标识图像信息的部分（例如，"B16&#34; 表示孔位名称）。此时将弹出一个窗口要求输入组名（例如，“孔位&#34;），请输入名称。从文件名中提取的该组成员将显示在组表格中（例如&#160;所有孔位名称的完整列表）。若需添加文件名中未包含的额外信息，请点击 &#34;（可选）下一步&#34; 按钮。点击 &#34;添加元数据组&#34;，输入额外的组名（例如，“药物&#34;），然后针对预定义组的每个值（例如 &#34;孔位&#34;），输入其对应值（例如 &#34;Taxol&#34;）。可添加的额外组数量无限制。</li>
			<li>最后，点击 &#34;生成元数据文件&#34; 以生成元数据文件并继续分析。如果此前已生成元数据文件，则可通过选择下方第 3 步所述的 &#34;元数据文件” 选项直接加载该文件，从而跳过上述步骤。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>基于正则表达式的模板：正则表达式是文本中匹配模式的标准方法。当文件名和/或目录结构包含足够信息用于图像分组，且命名规则符合某一预设模板时，请选择此选项。也可手动定义并重复使用基于正则表达式的自定义模板。此高级选项仅推荐熟悉正则表达式的用户使用。</li>
		<li>元数据文件：为实现最大程度的自定义，请选择此选项。定义并加载一个包含文件名及每张图像对应元数据的逗号分隔值（CSV）文件。该文件格式示例可在网站下载部分（phenoripper.org）获取。只需通过界面加载该文件即可显示其包含的信息。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>选择用于定义实验中重复样本的元数据字段，以避免重复采样。对于包含重复样本的数据集（例如，同一孔中的所有图像应相似），将其分组（例如 按孔位）可提高分析性能。在大多数情况下，选择默认选项 &#34;随机（未知）&#34; 是合理的，该选项将随机选择子集。</li>
</ol>
2.2 设置分析参数
点击&#34;设置参数&#34;以定义处理数据集所需的参数。需定义的参数位于左侧面板中。右侧面板显示数据集的合并样本。点击左/右箭头可在不同图像间切换。
<ol>
	<li>阈值强度：选择一个合适的阈值，以粗略识别图像中的细胞区域（而非背景或非细胞区域）。PhenoRipper 会预先计算一个阈值，但可通过图像上方的滚动条进行调整，以优化细胞区域的突出显示效果。若某一阈值无法适用于所有图像，应降低阈值，以包含非细胞区域，避免遗漏细胞区域。</li>
	<li>区块大小：选择合适的区块尺寸（以像素为单位）对图像进行网格划分。指定大小的区块将叠加在图像上。调整区块大小，使每个细胞平均覆盖20-30个区块。若要在图像上叠加网格，请点击复选框 &#34;区块大小&#34; 领域</li>
	<li>可选参数：如果自动缩放的图像未能显示具有理想相对强度的标记物（例如 一种颜色达到饱和）或需要从分析中去除标记时，使用 &#34;调节通道强度&#34; 选项。要使用部分标记物识别细胞区域，请使用 &#34;用于阈值的通道&#34; 选项。其他参数的默认设置通常已足够，但如有需要，可使用 &#34;高级分析选项&#34;.</li>
	<li>点击运行分析 &#34;PhenoRip&#34; 在主应用程序面板上。PhenoRipper 将自动识别图像中重复出现的区块类型。将根据每幅图像中不同类型区块所占比例，生成相应的表型谱。</li>
</ol>
3. 探索结果
<ol>
	<li>使用 PhenoBrowser 探索图像表型谱之间的关系（图 1）。PhenoBrowser 界面由四个面板组成：左上方的面板以图形方式（散点图）展示不同图像/条件之间的相对相似性，右侧的两个面板显示所选条件的样本图像，最后一个面板（柱状图）用于比较它们的表型谱。</li>
	<li>通过 &#34;数据处理&#34;菜单使用 &#34;丢弃空白帧&#34;功能。</li>
	<li>去除低质量图像：首先，从 &#34;数据处理&#34;菜单中关闭分组以查看单个图像。然后，逐个点击散点图中的离群点，并丢弃质量较差的图像（例如 失焦、染色伪影）。</li>
	<li>探索数据：确定哪个元数据字段定义了基本的比较单位（例如 若要比较药物，则具有相同元数据字段 &#34;drug&#34; 值的图像需要被分组在一起）。使用 &#34;按…分组&#34; 将具有相同该元数据字段值的所有图像合并为一个数据点。例如，按药物分组会将每种药物内的图像取平均值，从而每种药物对应一个数据点。散点图中邻近（或远离）的点反映了引发相似（或不同）细胞表型的条件。根据可用的元数据对点进行着色或标记（通过数据展示菜单），以增强可解释性。通过勾选 &#160;&#34;可旋转&#34; 复选框，并用鼠标左键点击并拖动，可旋转 3D 图。</li>
	<li>选择两个不同的点以进行直接比较。图像面板将显示每个点的样本图像，而柱状图面板将显示在两点之间出现频率差异最大的模块类型。</li>
	<li>从 &#34;聚类图菜单&#34; 启动聚类图，以更全面地展示模块类型与实验条件之间的关系。通过同时对模块类型和条件进行分组，该表示方式突出了最能区分各组条件的细胞表型（图 5）。</li>
</ol>

<ol><li>Collins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ+for+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">ImageJ for microscopy.</a> Biotechniques. 43, 25-30 (2007).</li>
<li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler%3A+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7, (2006).</li>
<li>Shamir, L., Delaney, J. D., Orlov, N., Eckley, D. M., Goldberg, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+Recognition+Software+and+Techniques+for+Biological+Image+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput.+Biol%22%5BJournal%5D)">Pattern Recognition Software and Techniques for Biological Image Analysis.</a> PLoS Comput. Biol. 6, (2010).</li>
<li>Rajaram, S., Pavie, B., Wu, L. F., Altschuler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PhenoRipper%3A+software+for+rapidly+profiling+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">PhenoRipper: software for rapidly profiling microscopy images.</a> Nat. Methods. 9, 635-637 (2012).</li>
<li>Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+reducing+edge+effect+in+cell-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays.</a> J. Biomol. Screen. 8, 566-570 (2003).</li>
<li>Slack, M. D., Martinez, E. D., Wu, L. F., Altschuler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+heterogeneous+cellular+responses+to+perturbations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Characterizing heterogeneous cellular responses to perturbations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 19306-19311 (2008).</li>
<li>Wolf, D. E., Samarasekera, C., Swedlow, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+digital+microscope+images%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of digital microscope images.</a> Methods Cell. Biol. 81, 365-396 (2007).</li>
<li>Zwier, J. M., Van Rooij, G. J., Hofstraat, J. W., Brakenhoff, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+calibration+in+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Image calibration in fluorescence microscopy.</a> J Microsc. 216, 15-24 (2004).</li>
<li>Shamir, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wndchrm+-+an+open+source+utility+for+biological+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Source+Code+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Wndchrm - an open source utility for biological image analysis.</a> Source Code Biol. Med. 3, 13(2008).</li>
<li>Hamilton, N. A., Wang, J. T., Kerr, M. C., Teasdale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+and+visual+differentiation+of+subcellular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinform%22%5BJournal%5D)">Statistical and visual differentiation of subcellular imaging.</a> BMC Bioinform. 10, 94(2009).</li>
<li>Huang, K., Murphy, R. F. Automated classification of subcellular patterns in multicell images without segmentation into single cells. IEEE Int. Symp. Biomed. Imag. Macro Nano, 2004 Apr 15-18, 2, 1139-1142 (2004).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述的工作流程可快速、简便地对显微图像进行表征和比较。我们首先展示了该工作流程如何帮助优化实验，例如通过快速对显微图像执行质量控制。接着，我们展示了其在分析高通量筛选数据方面的潜力：能够根据药物的作用机制对其进行分组。尽管PhenoRipper的速度比更复杂的方法快几个数量级，但其药物分组结果与使用复杂方法所获得的结果相当6。
尽管我们发现该方法对偶然的实验波动具有较强的抗干扰能力，但与任何基于图像的分析方法一样，检测结果会受到系统性非生物学因素的影响。例如，不同培养板间标记物强度的差异可能会掩盖感兴趣的生物学效应。通过适当的校正方法，可降低此类技术假象的影响。7,8 例如孔间标准化和背景扣除。PhenoRipper 生成的分析结果也可能受到细胞密度变化的影响。尽管这种特性通常是可取的（反映细胞存活或生长情况），但通过取消选中相关选项可降低其影响 &#34;使用背景信息&#34; 选项中的 &#34;高级参数&#34;.
在选择合适的分...

在过去十年中，成像技术的快速发展使许多实验室具备了进行高通量显微成像的能力。当前的挑战已从成像本身转向数据分析：我们如何对典型高通量成像筛选所产生的大量复杂而细微的表型进行表征、比较和深入分析？
多种图像分析与信息学平台已为用户提供先进的工具箱1-3，用于从大量图像集合中提取生物学信息。然而，在分析高通量图像筛选所产生的数据时，仍存在诸多重要障碍。选择合适的图像表征方法以及针对特定研究系统精细调整算法参数的过程往往十分困难，尤其对于缺乏图像分析专业知识的用户而言，常导致漫长的前期设置时间。其中，细胞分割——即在图像中识别单个细胞的过程——是当前的主要瓶颈。分割结果可能对细胞类型、细胞密度和生物标记物等实验参数高度敏感，通常需要对大型数据集进行反复调整。因此，图像分析常常由专业人员作为独立的最终步骤来完成，而非实验流程中的整合环节。这阻碍了分析与实验之间的快速反馈循环，而该循环正是检测方法开发中的关键组成部分。
本文描述了一种优化的高通量荧光显微成像工作流程，可避免前述诸多技术难题。为此，我们采用了 PhenoRipper4，这是一种开源软件平台，用于显微图像的快速浏览与分析。PhenoRipper 的显著优势在于无需进行细胞分割，从而规避了相关技术挑战。该方法不尝试识别单个细胞，而是将图像分割为亚细胞尺度的像素块，并基于其所含像素块的特征对图像进行表征。具体而言，PhenoRipper 根据基于标记物共定位的特征对像素块进行分析，并自动识别4训练图像中最具代表性的像素块类型。随后，PhenoRipper 将每个像素块归类为最相似的代表性块类型，最终基于图像所含块类型对图像进行整体表征。
与传统的基于单细胞的方法相比，该方法所需的精细调整和专业知识极少。因此，用户只需设置两个参数：区块大小和阈值强度（用于剔除图像中的非细胞部分），这两个参数均可通过图形反馈进行设定。重要的是，已有研究4表明，此处描述的工作流程可轻松扩展至更大规模的数据集，其速度优势和极少的参数调整带来了显著的时间节省和可靠性提升。在实际应用中，我们发现该方法可将设置和运行所需的时间减少多个数量级4。
PhenoRipper 的主要输出结果是图像相似性的可视化表示，使用户能够识别出导致细胞呈现相似表型的实验条件分组。PhenoRipper 所发现的分组通常具有与那些更耗时的基于细胞的分析方法相当的&#34;生物学可解释性&#34;4。在实际应用中，这意味着在完成一次典型的96孔荧光显微镜实验后半小时内，即使没有图像分析经验的实验人员也能获得关于其实验效果的可靠读数。随后，实验人员即可开始探索不同实验条件之间的关系，并将这些关系与图像表型关联起来。
我们通过分析不同作用机制类别药物对经DNA和细胞骨架标记染色的HeLa细胞的影响来演示此工作流程。用同一类药物处理的细胞图像被归为一组，而质量较差的图像（如染色伪影、失焦细胞等）则表现为离群值，便于识别并可能予以剔除。
尽管该工作流程适用于大量基于图像的检测，但在许多情况下，采用不同的方法可能会提供更丰富的信息。例如，PhenoRipper 的输出主要是对不同实验条件下荧光模式的相对比较。如果需要对特定单细胞特征进行绝对表征（例如细胞中斑点的数量），则必须采用基于单细胞的分析方法。然而，即便在此类情况下，PhenoRipper 仍有可能检测到这些单细胞表型的变化，因此可作为检测优化的有用工具。

<table><tbody><tr><td>DMEM，高葡萄糖</td><td>Invitrogen</td><td>11965</td><td>高葡萄糖，L-谷氨酰胺</td></tr><tr><td>标记物 Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H1399</td><td>DNA染色剂，将5 mg/ml储存液按1:2,000稀释</td></tr><tr><td>标记物鬼笔环肽-Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A12379</td><td>偶联鬼苷素，按1:200稀释</td></tr><tr><td>一抗 &amp;alpha;-微管蛋白</td><td>Sigma</td><td>T9026</td><td>一抗，小鼠单克隆抗体，按1:200稀释</td></tr><tr><td>二抗 TRITC标记抗小鼠抗体</td><td>Jackson</td><td>115-025-166</td><td>偶联二抗，0.5 mg溶于1 ml PBS加1 ml甘油</td></tr><tr><td>醛固酮</td><td></td><td></td><td>使用浓度：0.2 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>阿普西丁</td><td></td><td></td><td>使用浓度：20 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>秋水仙碱</td><td></td><td></td><td>使用浓度：0.16 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>皮质醇</td><td></td><td></td><td>使用浓度：0.2 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>地塞米松</td><td></td><td></td><td>使用浓度：0.2 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>多西他赛</td><td></td><td></td><td>使用浓度：0.2 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>M344</td><td></td><td></td><td>使用浓度：20 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>MS-275</td><td></td><td></td><td>使用浓度：5 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>诺考达唑</td><td></td><td></td><td>使用浓度：0.3 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>泼尼松龙</td><td></td><td></td><td>使用浓度：0.2 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>RU486</td><td></td><td></td><td>使用浓度：0.2 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>Scriptaid</td><td></td><td></td><td>使用浓度：70 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>紫杉醇</td><td></td><td></td><td>使用浓度：0.3 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>曲古抑菌素 A</td><td></td><td></td><td>使用浓度：0.2 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>长春瑞滨</td><td></td><td></td><td>使用浓度：0.3 &amp;mu;M</td></tr></tbody></table>

快速分析与探索荧光显微镜图像

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

尽管高通量显微镜技术发展迅速，基于图像的定量检测仍然面临重大挑战。虽然已有多种专用的图像分析工具，但大多数传统的基于图像分析的工作流程学习曲线陡峭（需要精细调整分析参数），并且在成像与分析之间导致较长的周转时间。特别是细胞分割——即在图像中识别单个细胞的过程——在这一过程中构成了主要瓶颈。
本文介绍一种基于 PhenoRipper 的替代性工作流程，该流程无需进行细胞分割。PhenoRipper 是一个开源软件平台，专为显微图像的快速分析与探索而设计。本文所述流程针对细胞培养物的免疫荧光显微图像进行了优化，仅需极少的人工干预。在半小时内，PhenoRipper 即可完成对典型 96 孔实验数据的分析并生成图像特征谱。用户可由此直观地浏览实验数据，进行实验质量控制，确认样本对扰动的响应，并检查重复样本之间的可重复性。该方法在分析与实验之间建立起快速反馈循环，对于检测方法优化至关重要。本方案不仅适用于质量控制的初步分析，也可作为端到端的完整解决方案，尤其适用于筛选实验。此处描述的工作流程可扩展至高通量筛选所产生的大规模数据集，并已在多种生物系统中被证实能够根据表型准确聚类实验条件。PhenoBrowser 界面提供了一个直观的框架，用于探索表型空间，并将图像特征与生物学注释相关联。综上所述，本文所述方案将降低采用基于图像筛选的定量分析的技术门槛。

在此，我们测试了该工作流程根据药物作用机制对药物进行分类的能力。将 HeLa 细胞接种于 384 孔板的 30 个孔中，并对 DNA/肌动蛋白/α-微管蛋白进行染色。所用的特异性一抗、荧光标记的二抗及其他荧光染料详见材料表。各孔分别用属于三类不同作用机制（组蛋白去乙酰化酶抑制剂、微管靶向药物和 DNA 损伤剂）的 15 种药物处理 24 小时，并使用 20 倍物镜的落射荧光显微镜进行成像。每个孔采集 16 幅图像，共获得 480 幅图像（3 个通道）。本文所描述的数据可从 www.phenoripper.org 下载。
如上所述，使用 PhenoRipper 分析这些图像。前景阈值设置为 5%（即 最大可能强度的 5%），块大小设置为 20 像素（图 2）。在标准台式计算机（3.2 GHz、64 位、8 核、16 GB 内存）上分析该数据集大约需要 10 分钟。使用 PhenoBrowser 界面（图 3）浏览分析结果。成像伪影（如染色不良和空白帧）很容易识别，因为它们表现为明显的离群值（<str...

本文介绍了一种利用近期开发的图像分析平台PhenoRipper，快速分析和探索荧光显微镜图像集合的工作流程。

尽管高通量显微镜技术取得了快速进展，基于图像的定量分析仍面临重大挑战。尽管存在多种专业化的……

本实验的总体目标是利用图像分析平台快速分析和探索荧光显微镜图像。首先将细胞接种到培养板中，向每孔加入干预因素并进行孵育。随后使用自动荧光显微镜获取图像，并通过 pheno loader 工具将图像半自动加载至 pheno ripper 图像分析平台。设置分析参数后，Pheno Ripper 会自动识别图像中重复出现的模块类型，并为每幅图像生成表型谱，这些表型谱可通过 Pheno Browser 进行浏览。最终生成的聚类图展示了不同实验条件与图像特征之间的关系，从而实现对高通量成像筛选所产生的复杂而细微表型的比较。与现有需要自动识别单个细胞的方法相比，该技术的主要优势在于速度更快、操作更简便。该方法有助于回答生物医学领域的关键问题，例如不同药物如何影响细胞过程。该实验流程首先进行细胞培养和细胞固定，具体步骤参见文本版实验方案；然后使用特定的一抗、荧光标记的二抗以及其他可在文本版实验方案中找到的荧光染料对固定后的细胞进行染色。细胞染色完成后，使用落射荧光显微镜采集图像。在此示例中，我们使用了 Benning 的 1×1 相机，放大倍数为 20 倍。每个孔采集 16 张图像，共采集 480 张图像。为了分析图像，首先从 pheno ripper 下载并安装 pheno ripper。进入 org 网站并启动 pheno ripper。要开始分析图像，需半自动加载图像及关联的元数据，请点击文件结构以在 pheno loader 中访问 pheno loader。选择包含图像数据集的目录，并根据需要指定图像的文件扩展名。筛选出不用于分析的文件。点击“定义标记”以指定实验中使用的生物标志物，并将其与图像关联。具体操作为：点击一个图像文件，然后选择文件路径中能够唯一识别生物标志物的部分。最后，为每个生物标志物输入名称。下一步是单击“定义元数据”。为了将信息与每张图像关联，请单击图像文件，然后选择文件路径中用于识别图像信息的部分。此时会弹出一个要求输入组名的窗口。请输入一个名称。从文件名中提取的组成员将显示在组表格中。此信息可用于分析结果的可视化过程。若需添加文件名中未包含的额外信息，请点击“添加额外信息”按钮，然后选择“添加元数据组”，并输入额外的组名称。针对预定义组的每一项值均可添加，且可添加的额外组数量无限制。最后，单击“create metadata file”以生成 Pheno Ripper 可读的数据注释文件，并选择用于定义实验中重复样本的元数据字段，以避免重复采样。对于包含重复样本的数据集，将其分组在一起可提高分析性能。接下来，单击“set parameters”以设定处理该数据集所需的参数。待定义的参数位于左侧面板。右侧面板显示出现的数据集示例。点击左侧或右侧箭头以切换不同图像，选择适当的阈值来粗略识别图像中的细胞区域。该阈值由Pheno Ripper预先计算，但可通过图像上方的滚动条进行调整，以优化细胞区域的高亮显示效果。如果选定的阈值无法在所有图像中均有效，则应降低阈值，以包含非细胞区域，而非遗漏细胞区域。接下来，选择合适的块大小（以像素为单位），将图像划分为网格状的多个区块。调整块大小，使每个细胞平均覆盖20至30个区块，从而将网格叠加到图像上。单击块大小字段前的复选框。如果自动缩放的图像未以期望的相对强度显示标记，或需要从分析中去除某些标记，请使用“调整通道强度”选项，在部分标记上识别细胞区域。选择用于阈值选项默认的通道。其他参数的选择通常已足够，但如有需要，可对其进行调整。使用高级分析选项，在主应用程序面板上点击 pheno rip 以运行分析。Pheno ripper 将自动识别图像中的重复模块类型。将根据每张图像中不同类型区块的比例，为每张图像生成表型谱。使用表型浏览器探索图像间表型谱的关系。表型浏览器界面由四个面板组成。左上方面板以图形形式展示不同图像与实验条件之间的相对相似性。右侧的两个面板显示所选条件的样本图像。最后一个面板比较所选条件的表型特征谱。首先，从数据处理菜单中关闭分组功能，以检查单个图像。接着，逐个点击散点图中的离群点，并剔除质量较低的图像。确定哪个元数据字段定义了基本的比较单位。例如，为了比较药物，可将具有相同“药物”元数据字段值的图像分组。现在，每个点代表一种单一药物，可通过数据展示菜单，根据可用的元数据对点进行着色或标注，以增强可读性。点之间的距离反映了相应实验条件下表型相似性的相对程度。距离越近的点表示相似性越高。通过选中“可旋转”复选框，可旋转三维图。按住鼠标左键并在图表上拖动鼠标即可旋转视图。选择两个不同的点以进行直接比较。图像面板将显示每个点的样本图像，而柱状图面板将显示最能区分这两个点的模块类型。从聚类图菜单中启动聚类图，通过对模块类型和实验条件同时进行分组，以更全面地展示模块类型与实验条件之间的关系。该图展示了最能区分不同处理组的细胞表型。采用Pheno Ripper分析经荧光标记DNA（鬼笔环肽）和α-微管蛋白的HeLa细胞，在经组蛋白去乙酰化酶抑制剂、微管靶向药物及DNA损伤药物处理后进行成像。这些图像的前景阈值设为5%，区块大小设为20像素，在标准台式计算机上分析该数据集耗时约10分钟。使用 pheno 浏览器界面来探索结果。图像之间的相对表型相似性通过多维尺度分析进行可视化。每个点代表一幅图像，其颜色根据对应药物的作用机制进行标注。该图显示，可以通过药物的作用机制利用表型谱对其进行分类。成像伪影（如孔洞染色和空白图像）由于明显偏离而易于识别。数据的聚类图将此分类与此处的表型谱关联起来。每一行代表一种药物，每一列代表一种区块类型。灰度值反映了表型特征谱。较亮的值表示该区块类型的占比较高。层次聚类基本按药物类别将不同药物区分开来。一旦掌握，若操作得当，该技术可在 10 分钟内完成。在此步骤基础上，可进一步开展其他方法，例如 IRA 分型分析。这将有助于回答更多问题，例如不同基因如何影响相似的信号通路。

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快速分析与探索荧光显微镜图像

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