Name: 激活和NLRP3炎性活性的人单核细胞来源的树突状细胞用IL-1β测量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: 了解人单核细胞来源树突状细胞中NLRP3炎症小体激活机制，通过R848诱导和尼日利亚菌素激活测量IL-1β分泌。该方法为研究免疫细胞炎症反应提供可靠实验方案。

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作者谨向 Olivier Manches 博士、Davor Frleta 博士和 Meagan O'Brien 医学博士表示感谢，感谢他们的支持与反馈。本研究由美国国家过敏与传染病研究所资助，并获得了美国国立卫生研究院（NIH）资助的露丝·L·柯什斯坦国家研究服务奖个体博士前奖学金（F31）以促进健康相关研究中的多样性（AI089030）以及 RO1 项目（AI081848）的支持。

伦理声明：研究样本均在获得捐赠者知情同意后采集并用于研究。所有样本在使用前应进行编码或匿名化处理。本方案遵循本机构审查委员会的指导方针。
1. 人外周血单核细胞向单核细胞来源树突状细胞的分化。
注意：人血沉棕层作为人外周血单个核细胞（PBMCs）的来源，由纽约血液中心（纽约，纽约州）提供。献血者均为健康志愿者。该5天实验流程始于将人外周血单个核细胞（PBMCs）接种至组织培养瓶中35,36。与已发表的实验方案相比，主要差异如下：
<ol>
	<li>使用带滤膜瓶盖的225 cm2无热原聚苯乙烯组织培养瓶，每瓶接种总共2×108个PBMCs，替代10 cm聚苯乙烯组织培养板（58 cm2）（步骤1）。</li>
	<li>在500 ml RPMI-1640 + L-谷氨酰胺中加入30 ml 5%混合人血清（PHS）、5 ml 1 M HEPES缓冲液和1.4 ml 50 mg/ml庆大霉素，配制5% PHS培养基，随后通过20 µM滤器过滤。每225 cm2组织培养瓶中加入50 ml 5% PHS培养基。</li>
	<li>用25 ml新鲜RPMI-1640洗涤贴壁细胞三次，每次剧烈震荡5秒&#160;，并吸除未贴壁细胞（步骤4）。</li>
	<li>在第0、2、4天，每瓶分别加入190 µl 400 IU/µl IL-4和380 µl 100 IU/µl GM-CSF（步骤3）。第0天定义为PBMCs在步骤1中初次接种的当天（步骤8）。</li>
	<li>在第5天收获moDCs，细胞浓度为1×106个细胞/ml（步骤15）。</li>
	<li>立即以静息状态使用moDCs。从不执行步骤17–22。注意：为获得最佳结果，样本应在采集后尽快处理。</li>
	<li>将moDCs以2×105个细胞/孔（200 µl/孔，浓度为1×106个细胞/ml）分装至96孔圆底板（用于Western blot、ELISA、FACs）或分装至经多聚-L-赖氨酸处理的腔室载玻片（用于显微镜观察）进行实验。注意：至少包含四种条件：完全未刺激（阴性对照）、仅启动、仅激活，以及先启动后激活。可根据需要增加R848和尼日尔霉素的溶剂对照条件。若下游检测为胞内细胞因子染色（ICS），则需设置复孔以用于同型对照。</li>
</ol>
2. 启动炎性小体——信号1
<ol>
	<li>根据制造商说明书，用DMSO溶解冻干的R848。在室温下用RPMI-1640稀释成工作液。</li>
	<li>将R848以10 µM的终浓度加入相应的孔中，作用18小时。&#160;将细胞置于37 °C、5% CO2的培养箱中孵育。</li>
</ol>
3. 激活 NLRP3 炎性小体 - 信号 2
<ol>
	<li>根据制造商说明书，用乙醇溶解冻干的尼日尔菌素。在加入相应实验条件前，于室温下用RPMI-1640培养基稀释工作液。</li>
	<li>加入尼日尔菌素，使其终浓度为20 µM，然后将细胞放回37 °C、5% CO2的培养箱中孵育6小时。在启动和激活过程中均无需洗涤步骤。注意：钙离子载体、布雷菲德菌素A、莫能菌素、二硝基苯酚或羰基氰氯苯腙可增强IL-1β的分泌37,38。因此，在分析炎性小体启动或活性时，不建议添加这些分泌抑制剂，因其会改变IL-1β的分泌水平。</li>
</ol>
4. IL-1ß 样本采集
<ol>
	<li>将含有细胞和上清液的培养板在974 × g条件下离心3分钟。</li>
	<li>小心吸走上清液，避免扰动细胞沉淀，并将上清液转移至另一圆底培养板，用于检测细胞因子的分泌水平。注意：上清液可暂时保存于-20 °C，或长期保存于-80 °C。</li>
	<li>用200 µl的1× PBS将细胞沉淀洗涤三次，每次在974 × g条件下离心3分钟&#160;，以去除细胞样品中残留的细胞外IL-1β。注意：当从96孔板中洗涤细胞沉淀时，可通过快速翻转培养板将洗涤液倒入收集容器中，以避免扰动样品。</li>
</ol>
5. 从细胞和上清液样本中检测 IL-1ß
<ol>
	<li>细胞内细胞因子染色（ICS）：以下描述了ICS方案39,40。&#160;注意：如果后续实验为显微镜检测，则不要悬浮细胞。所有洗涤和吸液操作均应避免扰动细胞层或细胞沉淀（根据后续实验类型而定）。
	<ol>
		<li>向合适的孔中加入100 µl&#160;含5% PHS的培养基。在避光条件下，室温孵育10分钟，加入适量体积的荧光标记抗体α-CD11c和α-CD14（表型标记物；克隆分别为B-ly6和MφP9）或同型对照抗体（约1 µl/2×105细胞，或每孔约1 µl）。</li>
		<li>用1× PBS在974 × g离心3分钟，洗涤三次。</li>
		<li>加入100 µl 4%多聚甲醛（PFA），在避光条件下室温固定20分钟&#160;。</li>
		<li>暂停点：用100 µl 1× PBS在974 × g离心3分钟&#160;洗涤一次，随后在1× PBS中4 °C过夜&#160;保存。</li>
		<li>加入100 µl破膜缓冲液，作用30分钟。注意：破膜缓冲液由含0.3% Triton X-100和1%牛血清白蛋白（BSA）的1× PBS组成，用于细胞破膜。若后续实验为显微镜检测，则勿扰动贴壁细胞。</li>
		<li>加入适量体积的α-IL-1β-FITC抗体（克隆8516）或同型对照抗体（约62 ng抗体/2×105细胞，或每孔约2.5 µl），在37 °C培养箱中孵育2小时&#160;。</li>
		<li>在避光条件下，用200 µl破膜缓冲液在974 × g离心3分钟&#160;，洗涤细胞三次。</li>
		<li>可选步骤：用DAPI染色，加入封片剂，将盖玻片轻轻覆盖在载玻片上。封片剂需过夜&#160;固化后再进行显微镜成像。</li>
		<li>通过流式细胞术（FACs）或显微镜获取数据。注意：在通过FACs或显微镜分析时，应将每种条件下的同型对照与相应染色样本进行比较。
		<ol>
			<li>FACs：依次获取单个样本数据。首先根据前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）设门于活细胞，再进一步设门于CD11c+CD14-细胞，随后分析moDC群体中pro-IL-1β的染色情况。</li>
			<li>显微镜：使用阳性染色样本（R848处理组）设置曝光时间。通过DAPI+pro-IL-1β+和DAPI+pro-IL-1β-信号确定表达pro-IL-1β的moDC细胞百分比。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>SDS-PAGE：通过免疫印迹法检测pro-IL-1β。注意：以下所述技术结合了标准免疫印迹方法、梯度4–20%聚丙烯酰胺凝胶以及荧光或化学发光检测方法41,42。
	<ol>
		<li>直接在10 µl变性裂解缓冲液中裂解细胞（5 µl β-巯基乙醇/950 µl Laemmli上样缓冲液，再与细胞裂解缓冲液1:1稀释）。将裂解液转移至1.5 ml离心管中。</li>
		<li>在干式加热仪上100 °C加热10分钟&#160;。</li>
		<li>在小型离心机上以20,800 × g离心1分钟，以浓缩液体体积。暂停点：样本可在-20 °C短期冻存。</li>
		<li>将全部体积样品上样至聚丙烯酰胺凝胶。在电泳槽中以140 V电压电泳约1小时，或直至染料前沿迁移至凝胶底部。</li>
		<li>将蛋白从聚丙烯酰胺凝胶转移至PVDF Immobilon-FL膜，100 V转膜90分钟。用含5% BSA的Tris缓冲盐水/0.1% Tween-20（TBS-T）封闭膜1小时。注意：PVDF Immobilon-FL膜最适合用于荧光检测。对于其他检测方法，建议使用不同组成的膜以提高信噪比。</li>
		<li>将一抗和二抗分别稀释于10 ml含5% BSA的TBS-T中。一抗在4 °C摇床上过夜孵育，二抗在室温摇床上孵育1小时。</li>
		<li>在一抗与二抗孵育之间，以及二抗孵育与成像之间，均用TBS-T在摇床上洗涤膜三次，每次5分钟。注意：可通过荧光或化学发光检测条带。请遵循制造商提供的检测说明。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>ELISA：用于储存而冷冻的样本在分析前需恢复至室温。将样本在离心机中离心，以收集上清液中的冷凝液。按照制造商说明书检测IL-1β含量。注意：本方案中特异性检测IL-1β；但同时检测TNFα、IL-6以及免疫调节性细胞因子IL-10，可确认是否建立了适当的刺激条件。</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

炎症性细胞因子在调控先天性和适应性免疫反应以对抗病毒感染中起着关键作用。已有研究表明，在流感病毒感染期间，分泌型IL-1β水平会升高3,43,44。然而，这些细胞因子在人类树突状细胞中响应病毒识别而被加工处理的具体机制尚未完全阐明。髓系树突状细胞（DC）的分离试剂盒成本高昂且耗时较长。使用分离试剂盒或流式细胞分选（FAC sorting）可能无意中对细胞造成应激或激活。此外，分离获得的细胞数量常常不足以满足实验需求。幸运的是，体外培养的人源单核细胞来源的树突状细胞（moDCs）在生物学特性上与原代人髓系树突状细胞非常相似in vitro45,46。这两种细胞类型均需要两个信号——TLR启动信号和NLRP3激活信号——才能实现成熟IL-1β的分泌。因此，moDCs为研究NLRP3炎症小体在人类健康与疾病中的相关性和功能提供了一种经济、简便的树突状细胞模型。
利用本文所述方法检测IL-1β，可提...

在感染、疾病和疫苗接种过程中，先天免疫系统的激活对于引导适应性免疫应答至关重要7。树突状细胞是先天免疫系统中最有效的抗原呈递细胞，其功能特化于抗原摄取、迁移至淋巴结，并激活初始CD4+和细胞毒性CD8+T细胞8-10。为了实现对病原体的快速识别，先天免疫系统利用了多种由种系编码的模式识别受体（PRR），这些受体可识别病原体中保守的分子基序或宿主细胞应激与损伤的标志物。Toll样受体（TLRs）是一类膜结合型模式识别受体，能够识别特定的胞外吞噬性病原体相关分子模式（PAMPs）以及损伤相关分子模式（DAMPs）。相比之下，Nod样受体（NLRs）位于细胞质中，可响应多种多样的PAMPs和DAMPs。Nod样受体构成了针对逃逸细胞表面和内吞性PRRs病原体的第二道防御屏障。病原体来源或“危险”相关因子与TLR和NLR配体的相互作用，可诱导树突状细胞（DC）成熟状态，从而增强DC与其他免疫细胞的相互作用，并促进T细胞和自然杀伤细胞的活化11。
白细胞介素-1β（Interleukin-1β）是宿主防御感染的关键组分。当识别到微生物后，这种强效促炎性细胞因子 IL-1β 会被分泌，作为趋化因子并激活先天性和适应性免疫细胞。体内 IL-1β 主要介导急性期反应，包括发热和炎症性细胞因子的合成12。
大多数NLR蛋白包含一个C端亮氨酸富集重复结构域，该结构域被认为在配体感应中发挥作用；一个中心核苷酸结合结构域（NACHT），对NLRP3的寡聚化至关重要；以及一个N端效应结构域（在NLRP3中为PYD），通过蛋白质-蛋白质相互作用将信号转导至下游靶标。NLRP3蛋白定义了目前研究最为深入的炎性小体复合物。该蛋白属于NLR家族，能够形成一种由NLRP3、接头蛋白PYCARD（也称为ASC）和ICE组成的多分子蛋白复合物。当炎性小体被激活时，PYCARD会结合NLRP3的N端结构域，并通过caspase激活和招募结构域（CARD）招募ICE。白细胞介素-1转化酶（ICE）最初以含有N端CARD基序的酶原形式合成。炎性小体的形成使两个ICE分子充分接近，从而诱导其自催化激活。炎性小体复合物对于激活ICE至关重要，使其能够将细胞质中的前体IL-1β转化为成熟的细胞因子。
树突状细胞（DCs）成功分泌IL-1β需要感知两种不同且独立的危险信号。首先，Toll样受体（TLR）对病原体相关分子模式（PAMPs）、损伤相关分子模式（DAMPs）或细胞因子信号（如TNFα或IL-1β）的感知，会诱导细胞质中前体IL-1β（pro-IL-1β）蛋白表达上调。其次，通常为另一种不同的信号，可触发炎症小体复合物的形成，该过程发生在IL-1β转换酶（ICE）成熟之前。一些能够刺激炎症小体的信号包括细菌膜孔形成毒素（如尼日利亚菌素）、溶酶体破坏性晶体（如单钠尿酸晶体，MSU）以及细胞外ATP。目前尚不清楚这些不同激活剂诱导NLRP3炎症小体活化的上游机制。针对炎症小体形成上游信号通路的研究提出，细胞内事件（如低钾血症或活性氧（ROS）的产生）可能间接激活炎症小体13-28。
在多种可激活NLRP3炎症小体的病毒中，流感病毒能够提供IL-1β分泌所必需的初级和次级信号3,29-33 . 利用小鼠 NLRP3 基因敲除模型发现，树突状细胞中 IL-1β 的分泌依赖于 NLRP332此外，NLRP3基因敲除小鼠在感染部位募集的白细胞较少，且死亡率较高2,5最近两篇论文提出了一种在流感病毒感染过程中激活NLRP3炎性小体的机制：首先，通过TLR7或TLR8（取决于响应细胞的TLR表达情况）识别病毒RNA，或通过其他TLR感知共生菌群，从而诱导细胞质中前体IL-1β（pro-IL-1β）的表达；随后产生第二个信号，即流感病毒的离子通道蛋白M2在跨膜&#160;高尔基体网络33,34在后一步骤中，通过干扰细胞内离子平衡实现NLRP3炎症小体的激活。 环境 导致活性氧（ROS）的产生，而NLPR3简单地将其感知为形成炎性小体的信号。然而，在流感病毒感染过程中，炎性小体激活在ICE活性上游的具体机制仍不明确。
本研究描述了一种用于研究人源moDCs中NLRP3炎症小体的技术，可作为进一步探索树突状细胞在R848介导TLR8结合后，再经NLRP3经典激活剂尼日利亚菌素激活炎症小体，从而引发IL-1β分泌通路的基础。该方法的变体可用于其他细胞类型，包括但不限于：单核细胞、巨噬细胞、其他树突状细胞亚群以及上皮细胞。

<table><tbody><tr><td>IL-4</td><td>R&amp;研发</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GM-CSF</td><td>Genzyme</td><td>NDC 58468-0180-2</td><td>我们凭处方在当地药店购买此物品</td></tr><tr><td>含L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基</td><td>Cellgro</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>外周血单个核细胞</td><td>纽约血液中心</td><td></td><td>从健康供体的血液中分离外周血单个核细胞（PBMCs）</td></tr><tr><td>12孔组织培养板</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>96孔圆底组织培养板</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3799</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-IL-1&amp;beta;-FITC</td><td>R&amp;研发</td><td>IC201F</td><td></td></tr><tr><td>FITC 同型对照</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-213</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-&amp;beta;微管蛋白</td><td>圣塔克鲁兹</td><td>SC-9014</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-IL-1&amp;beta;</td><td>R&amp;研发</td><td>mab201</td><td></td></tr><tr><td>PVDF Immobilon-FL 膜</td><td>默克密理博</td><td>IPFL00010</td><td></td></tr><tr><td>4-12% 聚丙烯酰胺梯度凝胶</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>161-1159</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli 样品缓冲液</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>161-0737</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Equitech Bio 公司</td><td></td><td>30% 溶液，无菌/过滤</td></tr><tr><td>PFA</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>15710</td><td>16% 溶液</td></tr><tr><td>人炎症性细胞因子微球检测试剂盒</td><td>BD</td><td>551811</td><td></td></tr><tr><td>尼日里菌素</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-nig</td><td></td></tr><tr><td>R848</td><td>3M 公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-CD14</td><td>BD</td><td>340436</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-巯基乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250-10ML</td><td></td></tr><tr><td>TBS</td><td></td><td></td><td>现场储藏室</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287-100mL</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a&gt;Nunc EasYFlask 225 cm²&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;，滤膜盖，70 ml 工作体积，30/箱&lt;/a&gt;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>159933</td><td></td></tr><tr><td>20 &amp;mu;M 无菌一次性滤器单元</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>569-0020</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Invitrogen</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>山羊 &amp;alpha;小鼠 IRDye 800CW</td><td>Licor</td><td>926-32210</td><td></td></tr><tr><td>驴 &amp;alpha;-兔 IRDye 680RD</td><td>Licor</td><td>926-68073</td><td></td></tr><tr><td>多色宽范围蛋白质标准品</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>26634</td><td></td></tr><tr><td>Tris-甘氨酸 SDS 10×</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>1610732</td><td></td></tr><tr><td>Tris 甘氨酸 10x</td><td>伯乐（Bio Rad）</td><td>161-0734</td><td></td></tr><tr><td>甲醇 - 4 L</td><td>Fisher Scientific</td><td>A433P-4</td><td></td></tr><tr><td>8孔聚苯乙烯培养皿，经组织培养处理的玻片</td><td>BD Falcon</td><td>354108</td><td></td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸</td><td>Sigma</td><td>P4707</td><td></td></tr></tbody></table>

利用人单核细胞来源的树突状细胞中il-1β检测nlrp3炎性小体的激活与活性测定

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

免疫细胞分泌白细胞介素（IL）-1家族细胞因子所引发的炎症过程，可导致局部或全身性炎症、组织重塑与修复以及病毒学控制1,2。白细胞介素-1β是先天免疫反应的关键组分，在清除入侵病原体的同时，有助于防止持续性感染的建立1-5。
炎性小体是激活白细胞介素1转化酶（ICE 或 Caspase-1）的关键信号平台。NLRP3 炎性小体在树突状细胞（DCs）中需要至少两个信号才能引起 IL-1β 的分泌6。在静息细胞中，前体形式的 IL-1β 蛋白表达受限，因此需要一个启动信号来诱导 IL-1β 的转录和蛋白表达。NLRP3 感知到第二个信号后，会形成多蛋白复合物 NLRP3 炎性小体。可通过使用一种合成嘌呤 R848 来检测树突状细胞对 IL-1β 分泌所需信号的响应能力，R848 可被来源于人单核细胞的树突状细胞&#160;（moDCs）中的 TLR8 感知，从而启动细胞；随后使用细菌毒素及钾离子载体尼日尔菌素（nigericin）激活 NLRP3 炎性小体。
单核细胞来源的树突状细胞&#160;在培养中易于生成，且提供的细胞数量显著多于纯化的人源髓系树突状细胞。本文所述方法与其他炎症小体检测方法的不同之处在于其采用 体外 人源而非小鼠来源的树突状细胞，从而允许对人源炎症小体在疾病与感染中的作用进行研究。

这些技术通过R848处理来检测TLR8的启动状态。针对前体IL-1β的细胞内细胞因子染色可用于对CD14-CD11c+ moDCs进行显微镜观察和流式细胞术（FACs）检测。两种技术均可相对于未经启动（即静息状态）的细胞对照以及同型对照进行定量分析（图1 和 图2）。前体IL-1β+染色阳性细胞百分比乘以该细胞群体的几何中位数，得到中位荧光强度（MFI）。MFI可反映阳性染色细胞中前体IL-1β的含量。
免疫印迹法检测细胞裂解液中的前体白细胞介素-1β（pro-IL-1β），并相对于细胞内对照（如β-微管蛋白或β-肌动蛋白）进行定量图3）。在尼日利亚菌素处理的细胞中进行pro-IL-1β的免疫印迹检测，应显示pro-IL-1β水平降低。同时，仅在R848预处理后给予尼日利亚菌素的条件下，通过ELISA检测上清液中的IL-1β含量会相应增加（图3和图4...

树突状细胞（DCs）&#160;在Toll样受体8（TLR8）识别合成嘌呤类物质R848后，经黑素菌素（nigericin）激活NLRP3炎性小体，进而分泌IL-1β，因此IL-1β可用于检测NLRP3炎性小体的活性。通过细胞内细胞因子染色、免疫印迹和ELISA方法，可准确检测IL-1β的表达水平，从而评估NLRP3炎性小体的启动和激活状态。

利用人单核细胞来源的树突状细胞中IL-1β检测NLRP3炎性小体的激活与活性测定

免疫细胞分泌白细胞介素（IL）-1家族细胞因子所引发的炎症过程，可导致局部或全身性炎症及组织损伤……

以下实验的总体目标是利用简单的IL-1β检测方法，在体外人树突状细胞中观察炎性小体活性。首先向细胞中加入R848，以诱导细胞内前体IL-1β的表达；随后加入尼日（nigericin），以激活NLRP3炎性小体的形成。这进而会触发前体白细胞介素-1β（pro-IL-1β）在分泌前裂解为成熟的白细胞介素-1β（IL-1β）。接下来，收集样本并检测细胞内前体IL-1β和细胞外成熟IL-1β的水平，通过免疫荧光、蛋白质印迹和ELISA检测来评估经启动和激活的细胞分泌IL-1β的结果。检测结果表明，使用R848启动人树突状细胞（DCs）可导致细胞内前体IL-1β的产生，而经尼日利亚曲霉（Nigerian juris）启动并激活的细胞则可分泌IL-1β。该方法可深入了解NLRP3炎性小体在人树突状细胞对合成配体反应中的作用。该方法也可应用于其他旨在测试生理刺激物（如细菌、病毒和自身炎症性疾病）的系统。将200微升新鲜分离的、处于静息状态的单核细胞来源树突状细胞分装至96孔圆底板中。首先设置四个标准条件：未刺激的阴性对照、仅启动、仅激活，以及先启动后激活。然后根据实验设计，为R 8 48和乳链菌肽（nissin）设置稀释液对照；在后续的细胞内细胞因子染色实验中，为同型对照设置复孔以启动炎性小体。加入R 8 48，使其在相应孔中的终浓度为10微摩尔。将细胞置于37摄氏度、5%CO2的培养箱中培养18小时。然后为了激活NLRP3炎症小体，加入nige，使其终浓度为20微摩尔。将培养物放回培养箱中继续培养6小时，随后收集样品，以974 × g离心培养板3分钟，注意不要扰动细胞沉淀。将每份上清液转移至独立的圆底培养板中，用于通过EISA检测细胞因子分泌。随后用200微升1×PBS洗涤细胞沉淀物三次，以去除细胞样本中可能存在的细胞外IL-1β，以便后续采用多种技术进行分析。为检测前体IL-1β，直接在10微升变性裂解缓冲液中裂解细胞。将裂解物转移至1.5毫升离心管后，于100摄氏度加热10分钟，用于通过流式细胞术进行IL-1β的荧光检测。向细胞样品中加入 100 微升 5% PHS 培养基，以及一微升荧光标记的抗体用于表型标志物或同型对照，在室温避光条件下孵育 10 分钟。经过三次 PBS 洗涤后，用 100 微升 4% 多聚甲醛（PFA）在室温避光条件下固定细胞 20 分钟。接着，加入 100 微升通透缓冲液作用 30 分钟，随后加入 62 纳克抗 IL-1β FSE 抗体或同型对照抗体，在 37°C 条件下孵育样品 2 小时。用 200 微升通透缓冲液洗涤细胞三次，然后重悬于 1 × PBS 中。用铝箔包裹样品，并在 4 摄氏度下保存。若通过显微镜检测 IL-1β，则用 DAPI 染色细胞，加入封片剂，轻轻将盖玻片置于载玻片上。在采集显微镜图像以通过流式细胞术进行荧光检测之前，让样本在山中过夜孵育。每次获取一个样本的数据。根据活细胞设定前向散射和侧向散射门，接着对 CD11c 阳性 CD14 阴性细胞设门。最后基于显微镜数据收集中pro IL-1β染色结果分析MODC群体。使用经R-848处理的阳性染色样本设定曝光时间，随后确定表达pro IL-1β的MO-DCs百分比，用于Western印迹检测。将总样品体积上样至聚丙烯酰胺凝胶。以140伏电压电泳，直至染料前沿跑出凝胶。将蛋白质从聚丙烯酰胺凝胶转印至FL膜上的A-P-V-D-F immo膜上。用含5% BSA的TBST封闭膜，室温孵育1小时。加入一抗，4°C振荡孵育过夜。用TBST洗膜3次，每次5分钟；再加入二抗，室温孵育1小时，期间振荡。再次用TBST洗膜3次后，进行显影检测。若通过ELISA检测分泌型细胞因子，需先将样本在室温下平衡。离心样品以集中上清液冷凝物，并按照制造商说明进行IL-1β细胞内细胞因子染色，用于检测前体IL-1β，从而实现对CD11c阳性、CD14阴性单核细胞来源树突状细胞的显微镜观察及流式细胞术读数分析。两种技术均可相对于未启动或静息细胞对照以及同型对照进行定量。前体IL-1β染色阳性细胞百分比乘以该细胞群的几何均值，以获得中位荧光强度。MFI 与阳性染色细胞中存在的前体 IL-1β 的量相当。此处，采用免疫印迹技术检测细胞裂解液中的前体 IL-1β。定量数据相对于内部细胞对照（如 β-微管蛋白）表示，符合预期。对经NI Nigerian处理的细胞进行pro-IL-1β的免疫印迹检测，结果显示pro-IL-1β水平降低。同时，通过EELISA检测上清液中的IL-1β，发现在NI Nigerian处理后IL-1β显著增加。同时检测其他炎症细胞因子，如TNF-α、IL-10和IL-6，结果表明Nigerian特异性诱导IL-1β的分泌。启动水平具有时间和剂量依赖性。进一步的实验，例如测定胞外蛋白浓度、检测成熟 I L-1β 生成的化学发光信号，或阻断炎性小体，将有助于确定胞外 IL-1β 是否为成熟的剪切形式，以及 IL-1β 的分泌是否依赖于 NLRP3 炎性小体活性。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

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我们描述了一种简单的免疫测定方法，用于检测表现为自身炎症表型的患者体内促炎性细胞因子（如IL-1β）的产生。通过使用病原体相关分子模式（特别是脂多糖）激活全血培养中的细胞，可在全血上清液中方便地评估细胞因子的分泌情况。...

准确且简便地利用全血刺激实验检测促炎性细胞因子 IL-1β

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本方案介绍了一种高效且可靠的方法，通过电穿孔技术将siRNA或质粒DNA转染至人THP-1巨噬细胞，可在实现高转染效率的同时，保持细胞的高活力以及巨噬细胞完整的分化与极化能力。...

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单核细胞来源的树突状细胞（MoDC）能够感知微量的危险相关分子，因此极易被启动。本文提供了从血液和肿瘤中分离MoDC并利用免疫复合物对其进行激活的详细方案，同时强调了应考虑的关键注意事项，以避免其过早激活。...

小鼠单核细胞来源树突状细胞的分离方案及其后续处理 体外 使用肿瘤免疫复合物激活

我们描述了在细胞水平上通过荧光显微镜检测NLRP3炎性小体活化的方法，该方法利用针对活化型caspase-1和接头蛋白ASC的染色技术。同时提供了一种乳酸脱氢酶释放实验，用于在群体水平上检测细胞焦亡性裂解。这些技术可被调整用于研究炎性小体生物学的多个方面。...

小鼠骨髓来源巨噬细胞中炎性小体激活与细胞焦亡的检测

MALT1 调控先天免疫，但其作用机制尚不明确。我们使用选择性 MALT1 副半胱天冬酶抑制剂 MLT-827，揭示了 MALT1 在 Toll 样受体或 C 型凝集素样受体下游的先天免疫信号通路中的作用，证明 MALT1 调控髓系细胞因子的产生，且该作用主要在 C...

MALT1 副半胱天冬酶活性对髓系先天免疫信号通路的调控

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一种用于在聚合物表面吸附蛋白层上研究Toll样受体介导的NF-κB/AP-1信号通路的巨噬细胞报告细胞检测方法

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人单核细胞来源巨噬细胞中炎症性半胱天冬酶诱导接近现象的可视化

了解人单核细胞来源树突状细胞中NLRP3炎症小体激活机制，通过R848诱导和尼日利亚菌素激活测量IL-1β分泌。该方法为研究免疫细胞炎症反应提供可靠实验方案。

利用人单核细胞来源的树突状细胞中IL-1β检测NLRP3炎性小体的激活与活性测定

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