激活和NLRP3炎性活性的人单核细胞来源的树突状细胞用IL-1β测量

以下实验的总体目标是使用简单的 IL one β 读数测定法观察体外人树突状细胞中的炎性小体活性。首先向细胞中加入 R 8 48 以诱导细胞内 pro IL one β 表达。然后加入 nige 以激活 NLRP 三个炎性小体的形成。

这反过来又触发了 pro IL one β 在分泌前分裂成成熟的 IL one β。接下来，收集样品并测量细胞内 pro IL one β 和细胞外成熟 IL one β 结果，方法是通过免疫荧光、western blot 和 eli 测量引发和活化细胞分泌 IL one β 获得的。一项检测表明，引发人 DCS 导致 R 8 48 引发细胞内产生 IL one β，并从用尼日利亚 juris 引发和激活的细胞中分泌 IL one β。

这种方法可以深入了解 NLRP 三个炎性小体在人树突状细胞对合成配体的反应中的作用。它也可以应用于其他旨在测试生理触发因素的系统，例如细菌、病毒和自身炎症性疾病。将 200 微升新鲜分离的单核细胞衍生的树突状细胞分装在 96 孔圆底板中，处于静息状态。

从未刺激的阴性对照、仅启动、仅激活和启动后激活的四个标准条件开始。然后，根据实验设计，包括用于下游细胞内细胞因子染色测定的 R 8 48 和 nissin 的稀释剂对照，包括用于同种型对照的重复项，以引发炎性小体。添加 R 8 48，向适当的孔中加入 10 微摩尔的最终浓度。

将细胞置于 37 摄氏度和 5% CO2 的培养箱中 18 小时。然后，为了激活 NLRP 三个炎性小体，添加终浓度为 20 微摩尔的 nige。将培养物放回培养箱中再放置 6 小时以收获样品，以 974 倍 G 离心培养板 3 分钟，不要干扰细胞沉淀。

将每个上清液转移到单独的圆底板上，以测量 EISA 分泌的细胞因子。现在用 200 微升 one XPBS 洗涤细胞沉淀 3 次，以从细胞样品中去除任何细胞外 IL one β，以便通过各种蛋白质印迹检测 pro IL one beta 的技术进一步分析，直接在 10 μL 变性裂解缓冲液中裂解细胞。将裂解物转移到 1.5 mL einor 管中后，将样品在 100 摄氏度下加热 10 分钟，以便通过 IL one β 流式细胞术进行荧光检测。

向细胞样品中加入 100 μL 5% PHS 培养基，并加入 1 μL 针对表型标记物或同种型对照的荧光标记抗体，在室温下避光孵育 10 分钟。3 次 PBS 洗涤后，用 100 μL 4% PFA 在室温下避光固定细胞 20 分钟。接下来，加入 100 微升渗透性缓冲液 30 分钟，然后加入 62 纳克抗 IL one β FSE 抗体或同种型对照样品，在 37 摄氏度下孵育 2 小时。

用 200 μL 可渗透缓冲液洗涤细胞 3 次，然后重悬于一个 XPBS 中。用箔纸包裹样品并在 4 摄氏度下储存。如果通过显微镜检测 IL one β 用 dappy 染色细胞，请添加山并将盖玻片轻轻放在载玻片的顶部。

让山体固化过夜，然后捕获显微镜图像，以便通过流式细胞术进行荧光检测。一次采集一个样本的数据。在活细胞上设置前向和侧向散射门，在 CD 11 C 阳性 CD 14 阴性细胞上设置下一个门。

最后，在显微镜数据采集中基于 pro IL one β 染色分析 MODC 群体。设置阳性染色 R 8 48 处理样品的曝光时间。然后确定表达 MO dcs 易易的 pro IL one β 的百分比，用于 western blot 检测。

将总样品体积加载到聚丙烯酰胺凝胶上。在 140 伏电压下运行，直到芯片前端从凝胶上流出。将蛋白质从聚丙烯酰胺凝胶转移到 FL 膜上的 A-P-V-D-F immo 上。

用 TBST 中的 5% BSA 封闭膜 1 小时。与 Primary Antibody 一起孵育，同时在 4 摄氏度下振荡过夜。TBST 洗涤 3 次 5 分钟后，与二抗在室温下孵育 1 小时，再洗涤 3 次 TBST 后，通过 ELI SA 测量分泌的细胞因子时对膜进行成像，在室温下平衡样品。

离心样品以巩固上清液浓缩，并按照制造商的说明测量 IL one β 细胞内细胞因子染色，对于 pro IL one β，可以进行显微镜检查和来自 CD 11 C 阳性、CD 14 阴性单核细胞衍生的树突状细胞的事实读数。这两种技术都可以相对于非引物或静息细胞对照以及同种型对照进行定量。将 pro IL one β 染色细胞的百分比乘以该群体的几何中位数，得到中位荧光强度。

MFI 与阳性染色细胞中存在的 pro IL one β 的量相当。这里。免疫印迹技术用于测量细胞裂解物中的 pro IL one β。定量数据是相对于内部细胞对照（如 β 微管蛋白）按预期表示的。

在 NI 尼日利亚处理的细胞中，pro IL one beta 的免疫印迹显示 pro IL one beta 减少。上清液中 IL one β 的并发增加对此表示赞美，通过 E ELI 测量仅为 R 8 48，其次是 NI 尼日利亚条件。同时测量其他炎性细胞因子，如 T NF、α、IL 10 和 IL 6，确保尼日尔在引起 IL one β 的分泌方面具有特异性。

启动水平与时间和剂量有关。进一步的实验，例如测量细胞外蛋白浓度、成熟 I one β 生成的化学发光检测或阻断炎性小体将有助于确定细胞外 IO one β 是否是成熟裂解形式以及 IO one β 分泌是否为 nlrp。三个炎性小体活性依赖性。