利用三维喷墨打印技术制备人类软骨组织

本实验的总体目标是构建一种三维人软骨组织，以验证利用改装的热喷墨打印机结合同步光聚合技术进行三维组织打印的可行性。该目标的实现分为两个步骤：首先，将市售的惠普DeskJet 500热喷墨打印机及511626单色墨盒改装为生物打印机；第二步，结合一个简易的三维打印平台和长波长紫外灯，以在制造过程中实现注射生物墨水的即时聚合。

接下来，通过将扩增的人关节软骨细胞悬浮于10%聚乙二醇溶液中，制备生物墨水，细胞浓度为每毫升500万个。最后一步是逐层打印软骨组织，同时进行光聚合。最终通过共聚焦显微镜和组织学分析进行观察。

染色用于显示在培养过程中，3D水凝胶中打印的软骨细胞分布均匀，以及均质新生软骨中优异的软骨细胞外基质生成。该技术相较于现有方法（如手工制备后聚合或扫描后静置细胞）的主要优势在于，打印的细胞可被精确递送至目标位置，并在基质中保持原位，不会因重力作用沉降至支架底部，从而形成均一的软骨结构。

本视频中展示的打印机改装基于惠普（Hewlett Packard）DeskJet 500 热喷墨打印机和一个 5 1 6 2 6 a 黑色墨盒。首先取下打印机的顶部塑料外壳，并小心地将控制面板从外壳上拆下。断开打印机上部与底座之间的三个电缆连接。

然后将打印机上部从底座上拆下。接着，将组成打印头清洁系统的小型塑料和橡胶配件从打印机上部拆除。拆下带弹簧的纸盒底座。

必须移除覆盖在塑料进纸杆上的金属板。此外，还需在中间进纸轮位置切断塑料进纸杆，并拆下两个进纸轮。本视频中，这些部件已被预先移除。

使用压缩空气和乙醇擦拭纸清洁灰尘和碎屑后，在使用紫外光之前，将打印机上部固定到底座上。在超净工作台中对改造后的打印机进行至少两小时的灭菌处理。如需改装墨盒，首先将其帽盖剪下。

使用手锯清空墨水，并移除覆盖墨盒底部储液腔的滤膜。用流动的自来水彻底冲洗墨盒，以去除残留的墨水。随后将墨盒置于去离子水中超声处理10分钟。

检查墨盒，确保所有墨水均已清除。用70%乙醇彻底喷洒墨盒以进行消毒，随后用无菌去离子水冲洗。最后，在打印平台上设置长波长紫外灯，以提供同步光聚合能力。

使用紫外光度计在打印平台上测量紫外光强度。调节紫外灯与打印机平台之间的距离，使打印对象处的光强保持在每平方厘米4至8毫瓦之间。紫外灯与打印机平台之间的距离应约为25厘米。

将人软骨细胞用于制备生物墨水，以在单层培养板中扩增软骨细胞。每个T175组织培养瓶中接种500万个的人软骨细胞，在添加了10%小牛血清和1×青霉素-链霉素-谷氨酰胺的DMEM培养基中，于37°C、含5%二氧化碳的湿润空气中培养细胞。每三天更换一次培养基，直至细胞达到85%融合度。

使用相同代数的细胞。配制聚乙二醇DL或peda溶液。将peda溶于PBS中，配制成终浓度为10%（重量/体积）的溶液。

将光引发剂I 2 9 5 9加入至终浓度为0.05%（重量/体积）的滤膜中。当培养的人软骨细胞达到85%融合度时，对溶液进行灭菌处理。在计算细胞浓度后收集细胞。

将所需体积的细胞悬液转移至锥形管中，使细胞浓度为每毫升500万个，于1200 RPM离心5分钟。离心后吸弃上清液，将细胞沉淀重悬于预先配制的Pega溶液中，以制备生物墨水。开始此操作前，打开打印机和笔记本电脑，使用Microsoft Word创建一个直径为4毫米的实心圆形打印图案。

将塑料模具放入打印机中。调整图案的位置，确保其准确打印到塑料模具内。计算达到所需支架厚度所需的打印次数。

对于四毫米的高度，需要220次打印才能制备出所需的支架。将生物墨水装入墨盒中。用铝箔覆盖墨盒，以避免直接暴露于紫外光下。

打印过程中，向打印机发送打印指令。当打印机开始打印时，拉动纸张传感器以继续打印。若无纸张通过打印机，整个打印过程应耗时少于四分钟，以制备直径四毫米、高度四毫米的支架。

将打印的新生软骨转移至24孔板中，每孔加入1.5毫升培养基。为评估细胞活力，将打印的新生软骨在室温避光条件下，用活死细胞染色工作液孵育15分钟。对载有细胞的水凝胶进行半切，在获取切面区域的荧光图像后，由一位不知分组情况的观察者随机选取五张图像，统计其中活细胞与死细胞数量，以计算细胞活力。

基于改进型热喷墨打印机的特性，本照片展示了一种具有代表性、直径为四毫米、高度为四毫米的打印新生软骨组织。对于该尺寸的构建物，在逐层构建过程中，每层打印的体积和厚度分别为 0.23 µL 和 18 µm。完成整个新生软骨组织的打印过程耗时不到四分钟。

这些图像显示了用绿色和橙色荧光染料标记的软骨细胞。图A显示了在3D支架中打印的软骨细胞分布均匀。由于在细胞沉积过程中同时对周围支架进行光聚合，打印和光聚合过程在四分钟内完成，细胞存活率达到90%。相比之下，图B显示，若不进行同步光聚合，细胞会因重力作用下沉至底部水平界面，而无法保持其初始沉积位置。

经过10分钟的紫外线照射后凝胶，其构建体大小与A相同，细胞活力为63%。藏红花O染色显示，在PEG水凝胶中打印的软骨细胞在培养过程中蛋白多糖生成逐渐增加，表明打印的软骨细胞在三维环境中表现出类软骨表型，并形成了均一的新生软骨组织。观看本视频后，您应能充分理解如何利用改造的热喷墨打印机，在三维支架中创建具有均匀细胞分布的三维预定组织。